Name: Analiza reakcji węchowych neuronów czuciowych myszy za pomocą zapisu elektroolfaktogramu w fazie powietrznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-02T17:57:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Poznaj metodę zapisu elektroolfaktogramu w badaniu czuciowych neuronów węchowych myszy. Technika ta umożliwia analizę odpowiedzi neuronalnych na różne odoranty w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr. Yijun Songowi oraz członkom zespołu trzech laboratoriów Hattar, Kuruvilla i Zhao w Departamencie Biologii Uniwersytetu Johns Hopkins za rady i pomoc. Wsparcie zapewniły granty NIH DC007395 i DC009946.

Część 1. Układ do rejestracji EOG
Aparat pomiarowy składa się z elektrody rejestrującej, elektrody odniesienia, rurki do doprowadzania powietrza, stolika do preparatów oraz mikroskopu stereoskopowego, a wszystko to jest zamocowane na stole pneumatycznym wewnątrz klatki Faradaya. Do pozycjonowania elektrod i rurki do doprowadzania powietrza wykorzystuje się mikromanipulatory. Ciągły strumień powietrza jest przepuszczany przez wodę destylowaną w celu nawilżenia, przed przejściem przez rurkę doprowadzającą i nad preparatem. Jako powierzchnia montażowa preparatu służy naczynie hodowlane o średnicy 60 mm, wypełnione Sylgardem do głębokości 6-8 mm. W Sylgardzie w naczyniu montażowym wykonano otwór i kanał, aby umożliwić elektryczne połączenie elektrody odniesienia z preparatem za pomocą zmodyfikowanego roztworu Ringera.
Elektroda rejestrująca oraz elektroda odniesienia są podłączone do wzmacniacza. Sygnały z wzmacniacza są przesyłane do digitalizatora, a następnie do komputera. Do sterowania protokołem stymulacji, rejestrowania sygnału oraz późniejszej analizy odpowiedzi można wykorzystać oprogramowanie takie jak Axograph lub pClamp. Podłączony za wzmacniacz oscyloskop może być przydatny do monitorowania potencjału elektrycznego w czasie rzeczywistym podczas umieszczania elektrody rejestrującej oraz w trakcie pomiarów EOG.
Podawanie bodźców zapachowych jest kontrolowane przez urządzenie Picospritzer, które jest podłączone do tego samego komputera, który służy do akwizycji sygnałów. Ciśnienie powietrza w urządzeniu Picospritzer zostało ustawione na 10 psi. Do zasilania powietrzem zarówno stołu pneumatycznego, jak i urządzenia Picospritzer można użyć jednej butli z powietrzem i jednego regulatora. Druga butla z powietrzem i regulator służą do dostarczania powietrza do nawilżonego strumienia powietrza, ponieważ wymaga on niższego ciśnienia i dużego przepływu powietrza. Bezpośrednio przed podaniem bodźca zapachowego wyjście urządzenia Picospritzer zostaje podłączone do butelki z substancją zapachową. Butelka z substancją zapachową jest następnie podłączona do rurki doprowadzającej powietrze.
Część 2: Przygotowanie elektrod
Elektrodą rejestrującą jest srebrowa elektroda chlorkowa w wyciągniętej kapilarze szklanej wypełnionej zmodyfikowanym roztworem Ringera (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1.5 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.4, sterylizowana przez filtr). Elektrodą odniesienia jest srebrowa elektroda chlorkowa.
<ol>
 <li>Zainstaluj srebrny drut w uchwycie elektrody. W przypadku elektrody rejestrującej z końca uchwytu powinno wystawać od jednego do dwóch centymetrów drutu. Dla elektrody odniesienia można pozostawić dłuższy odcinek drutu.</li>
 <li>Aby nanieść powłokę AgCl na srebrny drut, umieść drut w 0,1 M NaCl i podłącz uchwyt elektrody do bieguna dodatniego źródła prądu stałego o napięciu 1,5-9 V. Biegun ujemny źródła zasilania powinien być połączony elektrycznie z roztworem 0,1 M NaCl. Pozostaw reakcję chlorowania na 10 minut. Aby wyrównać ładunek statyczny między elektrodą rejestrującą a elektrodą odniesienia, krótko zetknij elektrody ze sobą przed zamontowaniem ich w aparaturze rejestrującej.</li>
 <li>Wytnij kapilarę szklaną za pomocą wyciągacza do mikropipet. Otwór na końcówce kapilary powinien mieć średnicę około 5-10 mikronów. </li>
 <li>Użyj rysika diamentowego, aby naciąć i odłamać tępy koniec kapilary tak, aby była ona o ok. 2 cm dłuższa od srebrnego drutu. Wygładź koniec cięcia za pomocą palnika butanowego.</li>
 <li>Rozpuść 0,5% agarozy w zmodyfikowanym roztworze Ringera. Za pomocą pipety transferowej zaciągnij niewielką ilość roztopionego roztworu agarozy do końcówki elektrody. </li>
 <li>Wypełnij wyciągniętą kapilarę w połowie zmodyfikowanym roztworem Ringera (do tego celu przydatna jest strzykawka, która została podgrzana i wyciągnięta tak, aby miała długi, cienki koniec). Delikatnie potrząśnij kapilarą, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Przechowuj wypełnione elektrody w słoiku z niewielką ilością zmodyfikowanego roztworu Ringera na dnie do momentu ich użycia. Gdy próbka tkanki zostanie przygotowana i będzie gotowa do rejestracji, zamontuj wypełnioną kapilarę na drucie elektrody rejestrującej.</li>
</ol>
Część 3: Przygotowanie roztworów substancji zapachowych
Substancje zapachowe, takie jak octan amylu i heptanal, wywołują silne odpowiedzi, dlatego stanowią odpowiedni wybór jako stymulanty w badaniach EOG.
<ol>
 <li>W probówkach do mikrowirówki przygotować szereg rozcieńczeń substancji zapachowej w dimetylosulfotlenku (DMSO). Jako punkt wyjścia dla krzywej dawka-odpowiedź przygotować rozcieńczenia dziesięciokrotne w zakresie od 5 M do 5 x 10-6 M. Każdego dnia należy przygotowywać świeże rozcieńczenia.</li>
 <li>Kolejno rozcieńczyć substancje zapachowe 50-krotnie w wodzie, mieszając 10 μL rozcieńczonego roztwoku zapasowego w DMSO z 4,9 mL wody w butelkach o pojemności 2 uncji z silikonowymi korkami. Pozostawić roztwory w butelkach na co najmniej 30 minut w celu osiągnięcia równowagi. Należy pamiętać, że stężenie par substancji zapachowych w każdej butelce jest nieznane, ale będzie zmieniać się w zależności od stężenia substancji zapachowych w fazie ciekłej.</li>
 <li>Przez silikonowy korek wprowadzić dwie igły o rozmiarze 18 G, aby stworzyć otwory wlotowy i wylotowy. Otwory powinny być zamknięte, gdy butelka nie jest używana.</li>
</ol>
Część 4: Rejestracja EOG i analiza danych
<ol>
 <li>Uśmierć mysz poprzez eutanazję CO2 lub przedawkowanie środka anestetycznego, a następnie przeprowadź dekapitację. Usuń skórę pokrywającą czaszkę i przedziel głowę strzałkowo wzdłuż linii środkowej. </li>
 <li>Umieść jedną połowę głowy stroną przyśrodkową do góry na tacy montażowej. Ostrożnie usuń przegrodę, aby odsłonić małżowiny nosowe.</li>
 <li>Umieść tacę z zamontowaną tkanką na stole rejestracyjnym. Ustaw stół tak, aby miejsce rejestracji na małżowinach znajdowało się w centrum pola widzenia mikroskopu.</li>
 <li>Otwórz zawór butli z powietrzem, aby dostarczyć nawilżone powietrze na powierzchnię małżowiny. Ustaw rurkę doprowadzającą powietrze w odległości około 10 mm od miejsca rejestracji. Przepływ wynosi ~60 mL/min. </li>
 <li>Ustaw wzmacniacz w trybie DC (wzmocnienie AC wywoła artefakty w sygnale EOG), z filtrem dolnoprzepustowym ustawionym na 1 kHz i wzmocnieniem 10X. </li>
 <li>Zamocuj elektrody rejestrujące i referencyjne w mikromanipulatorach. </li>
 <li>Opuść elektrodę referencyjną do otworu w tacy montażowej i zalej zmodyfikowanym roztworem Ringera tak, aby była ona połączona elektrycznie z tkanką.</li>
 <li>Ostrożnie opuść elektrodę rejestrującą na powierzchnię małżowiny IIb lub III. Elektroda powinna ledwo dotykać powierzchni nabłonka węchowego! W momencie zetknięcia elektrody z nabłonkiem (tzn. zamknięcia obwodu elektrycznego) na oscyloskopie pojawi się prosta linia bazowa. </li>
 <li>Podłącz butelkę z substancją zapachową do bocznego portu rurki doprowadzającej powietrze.</li>
 <li>W programie komputerowym uruchom protokół stymulacji. Częstotliwość próbkowania podczas akwizycji danych powinna wynosić 2 kHz lub więcej. Oprogramowanie wygeneruje impuls zapachowy i rozpocznie rejestrację. </li>
 <li>Typowy protokół stymulacji może obejmować pojedynczy impuls o czasie trwania 10 ms, pary impulsów 10 ms oddzielone 1-sekundowym odstępem lub impuls ciągły trwający 10 s.</li>
 <li>Zachowaj odpowiedni odstęp czasu między protokołami, aby tkanka była w minimalnym stopniu zaadaptowana. Jedna minuta jest wystarczająca dla stężeń ciekłych octanu amylu i heptaldehydu do 10-3 M; przy wyższych stężeniach odczekaj 5 minut. Po podaniu wysokich stężeń zapachowych (np. na końcu krzywej dawka-odpowiedź) w rurce może pozostać resztkowy zapach. Przemyj rurkę doprowadzającą powietrze 95% etanolem i osusz przed przystąpieniem do pracy z kolejnymi próbkami tkanek.</li>
 <li>Oprogramowanie Axograph udostępnia narzędzia do pomiaru kluczowych parametrów sygnału EOG. Parametry te obejmują amplitudę odpowiedzi, latencję, czas do osiągnięcia szczytu oraz stałe czasowe wygasania. Przed dalszą analizą zaleca się cyfrowe filtrowanie śladów przy 25 Hz.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig1.jpg" alt="Schemat układu elektrofizjologicznego, pomiar EOG w odpowiedzi na zapach; obejmuje oscyloskop i wykres." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="rycina 1"> Rycina 1. Parametry analizy EOG. Kilka parametrów EOG jest szczególnie przydatnych do porównywania odpowiedzi między myszami, w tym amplituda odpowiedzi, latencja (czas między podaniem bodźca a początkiem odpowiedzi), czas narastania (czas między początkiem odpowiedzi a jej szczytem), czas do osiągnięcia szczytu (czas od rozpoczęcia stymulacji do szczytu odpowiedzi) oraz stała czasowa wygaszania (τ, wyznaczana poprzez dopasowanie fazy spadku odpowiedzi do pojedynczego równania wykładniczego). W przypadku porównywania parametrów kinetycznych, takich jak latencja, czas narastania i stała czasowa wygaszania, zaleca się normalizację amplitudy szczytowej odpowiedzi przed przystąpieniem do analizy.
<img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig2.jpg" alt="Reakcje elektroolfaktogramu; krzywe zależności odpowiedzi od stężenia; wykresy EOG; analiza octanu amylu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="rycina 2"> Rysunek 2. Reprezentatywne sygnały EOG przy różnych protokołach stymulacji. (a) Przykłady EOG myszy w odpowiedzi na stymulację rosnącymi stężeniami octanu amylu. Czarna linia na górze panelu wskazuje czas i czas trwania stymulacji substancją zapachową. Stężenia w legendzie są stężeniami roztworu ciekłego. (b) Relacja dawka-odpowiedź uśredniona dla pięciu myszy. Słupki błędów przedstawiają 95% przedziały ufności. Spadek amplitudy szczytowej jest często obserwowany przy bardzo wysokich stężeniach substancji zapachowej. (c) Przykład EOG w odpowiedzi na stymulację podwójnym impulsem. Pojedynczy krótki impuls substancji zapachowej wywołuje adaptację trwającą kilka sekund. (d) Przykład EOG w odpowiedzi na 10-sekundową ciągłą stymulację substancją zapachową. EOG wykazuje desensytyzację podczas ciągłego podawania substancji zapachowej.

<ol><li>Ottoson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+electrical+activity+of+the+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Analysis of the electrical activity of the olfactory epithelium.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 35, Suppl 122. 1-83 (1956).</li>
<li>Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electroolfactogram%3A+a+review+of+its+history+and+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">The electroolfactogram: a review of its history and uses.</a> Microsc Res Tech. 58, 152-160 (2002).</li>
<li>Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+anosmia+caused+by+a+targeted+disruption+of+the+mouse+olfactory+cyclic+nucleotide-gated+cation+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel.</a> Neuron. 17, 681-693 (1996).</li>
<li>Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+deficient+in+G%28olf%29+are+anosmic%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mice deficient in G(olf) are anosmic.</a> Neuron. 20, 69-81 (1998).</li>
<li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+a+mammalian+odorant+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional expression of a mammalian odorant receptor.</a> Science. 279, 237-242 (1998).</li>
<li>Wong, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+type+III+adenylyl+cyclase+gene+leads+to+peripheral+and+behavioral+anosmia+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice.</a> Neuron. 27, 487-497 (2000).</li>
<li>Munger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+of+the+CNGA4+channel+subunit+in+Ca2%2B-calmodulin-dependent+odor+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Central role of the CNGA4 channel subunit in Ca2+-calmodulin-dependent odor adaptation.</a> Science. 294, 2172-2175 (2001).</li>
<li>Michalakis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CNGB1+protein+leads+to+olfactory+dysfunction+and+subciliary+cyclic+nucleotide-gated+channel+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Loss of CNGB1 protein leads to olfactory dysfunction and subciliary cyclic nucleotide-gated channel trapping.</a> J Biol Chem. 281, 35156-35166 (2006).</li>
<li>Buiakova, O. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+marker+protein+%28OMP%29+gene+deletion+causes+altered+physiological+activity+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Olfactory marker protein (OMP) gene deletion causes altered physiological activity of olfactory sensory neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9858-9863 (1996).</li>
<li>Nickell, W. T., Kleene, N. K., Gesteland, R. C., Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+chloride+accumulation+in+olfactory+epithelium+of+mice+lacking+NKCC1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal chloride accumulation in olfactory epithelium of mice lacking NKCC1.</a> J Neurophysiol. 95, 2003-2006 (2006).</li>
<li>Song, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+CNG+channel+desensitization+by+Ca2%2B%2FCaM+via+the+B1b+subunit+affects+response+termination+but+not+sensitivity+to+recurring+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Olfactory CNG channel desensitization by Ca2+/CaM via the B1b subunit affects response termination but not sensitivity to recurring stimulation.</a> Neuron. 58, 374-386 (2008).</li>
<li>Cygnar, K. D., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphodiesterase+1C+is+dispensable+for+rapid+response+termination+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phosphodiesterase 1C is dispensable for rapid response termination of olfactory sensory neurons.</a> Nat Neurosci. 12, 454-462 (2009).</li>
<li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem Senses. 33, 839-859 (2008).</li>
<li>Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+adenylyl+cyclase+inhibits+olfactory+generator+currents+induced+by+%22IP%283%29-odors%22%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by "IP(3)-odors".</a> J Neurophysiol. 84, 575-5780 (2000).</li>
<li>Pinato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroolfactogram+responses+from+organotypic+cultures+of+the+olfactory+epithelium+from+postnatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Electroolfactogram responses from organotypic cultures of the olfactory epithelium from postnatal mice.</a> Chem Senses. 33, 397-404 (2008).</li>
<li>Ezeh, P. I., Davis, L. M., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+distribution+of+rat+electroolfactogram%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Regional distribution of rat electroolfactogram.</a> J Neurophysiol. 73, 2207-2220 (1995).</li>
<li>Scott-Johnson, P. E., Blakley, D., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+air+flow+on+rat+electroolfactogram%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Effects of air flow on rat electroolfactogram.</a> Chem Senses. 25, 761-768 (2000).</li>
</ol>

Myszy były obsługiwane i uśmiercane metodami zatwierdzonymi przez komisje ds. opieki i wykorzystania zwierząt (Animal Care and Use Committees) Uniwersytetu Johns Hopkins.

Dzięki konfiguracji opisanej w niniejszym protokole, bodźce zapachowe na powierzchni nabłonka węchowego będą spójne pomiędzy preparatami tkanek, co pozwoli na porównanie myszy typu dzikiego i mutantów, mimo że dokładne stężenie i dynamika substancji zapachowych nie są znane. Kilka czynników, w szczególności miejsce rejestracji oraz szybkość przepływu nawilżonego powietrza, powoduje różnice w EOG. Należy zadbać o rejestrację z podobnych pozycji na tym samym prężnie rozwiniętym ornamentcie nosowym (turbinate), aby zminimalizować zmienność. Można to łatwo osiągnąć, rejestrując sygnały konsekwentnie z tej samej strony głowy oraz utrzymując stałe rozmieszczenie mikroskopu, rurki do podawania zapachu i mikromanipulatorów na stole pneumatycznym pomiędzy próbkami tkanek. Ponadto, po sekcji próbki tkanek należy natychmiast umieścić w strumieniu nawilżonego powietrza, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu tkanki.
Rejestrację EOG u myszy można również przeprowadzić przy użyciu aparatu do perfuzji cieczowej na przygotowanych błonach nosowych myszy7, 14, 15 lub pozostawiając głowę nienaruszoną i wprowadzając elektrodę przez mały otwór wywiercony nad błonami nosowymi16, 17. Każda z wariacji rejestracji EOG ma swoje zalety: rejestracje w fazie powietrznej na preparatach tkankowych, opisane w niniejszym protokole, wymagają minimalnych przygotowań i są najłatwiejsze do przeprowadzenia; rejestracje z użyciem aparatu do perfuzji cieczowej ułatwiają stosowanie odczynników farmakologicznych, choć hydrofobowa natura wielu substancji zapachowych utrudnia ich podawanie; wreszcie, rejestracje z nienaruszoną głową mogą być wykorzystywane w eksperymentach typu „sztuczne węszenie”, mimo że umiejscowienie elektrody jest trudniejsze niż w przypadku pełnej ekspozycji błon nosowych.

<table><tbody><tr><td>Rurka doprowadzająca powietrze</td><td>sprzęt</td><td>Własna konstrukcja</td><td></td><td>Jako zamiennik można zastosować korpus strzykawki o pojemności 1 mL z kształtką T</td></tr><tr><td>Stół pneumatyczny</td><td>sprzęt</td><td>Newport Corp.</td><td>LW3030B-OPT</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>sprzęt</td><td>Warner Instruments</td><td>DP-301</td><td></td></tr><tr><td>Komputer i oprogramowanie do akwizycji danych</td><td>sprzęt</td><td>Axograph 4.9.2 na Apple Macintosh</td><td></td><td>Zaktualizowane wersje programu Axograph dla Mac OS X i Windows są dostępne pod adresem http://axographx.com/.</td></tr><tr><td>Palnik butanowy</td><td>sprzęt</td><td></td><td></td><td>Dobrze sprawdza się palnik kuchenny (cr&amp;#232;me br&amp;#251;l&amp;#232;e)</td></tr><tr><td>Digitalizator</td><td>sprzęt</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1322A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop sekcyjny</td><td>sprzęt</td><td>Scienscope</td><td>SSZ</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt elektrody</td><td>sprzęt</td><td>Harvard Apparatus</td><td>64-1021</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczne urządzenia mocujące (12 mm)</td><td>sprzęt</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulatory</td><td>sprzęt</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Wyciągacz mikropipet</td><td>sprzęt</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>Oscyloskop</td><td>sprzęt</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>5110</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>sprzęt</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurki silikonowe</td><td>sprzęt</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stolik do preparatów</td><td>sprzęt</td><td>Własna konstrukcja</td><td></td><td>Do podniesienia naczynia montażowego można użyć dowolnego małego, stałego przedmiotu. Naczynie należy unieruchomić za pomocą plasteliny.</td></tr><tr><td>Igły 18G</td><td>materiał</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Szklane butelki 2 oz</td><td>materiał</td><td>VWR international</td><td>16152-201</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary szklane</td><td>materiał</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW150F-6</td><td></td></tr><tr><td>Zatworki silikonowe rozmiar 16D</td><td>materiał</td><td>Chemware</td><td>D1069809</td><td></td></tr><tr><td>Drut srebrny</td><td>materiał</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>AGW1010</td><td></td></tr><tr><td>SylGuard 184</td><td>materiał</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td>Z World Precision Instruments</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Octan amylu</td><td>odczynnik</td><td>Aldrich</td><td>W504009</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1016</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>Heptaldehyd</td><td>odczynnik</td><td>Aldrich</td><td>H2120</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;+6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>odczynnik</td><td>JT Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>Przepływomierz</td><td>sprzęt</td><td>Gilmont Instruments</td><td>GF-2260</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza odpowiedzi neuronów sensorycznych węchu myszy z wykorzystaniem zapisu elektroolfaktogramu w fazie gazowej

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Zwierzęta polegają na węchu w wielu krytycznych zachowaniach, takich jak poszukiwanie źródeł pożywienia, unikanie drapieżników oraz identyfikacja osobników tego samego gatunku w celu kopulacji i innych interakcji społecznych. Rejestracja elektroolfaktogramu (EOG) jest informacyjną, łatwą do przeprowadzenia i wiarygodną metodą oceny funkcji węchowych na poziomie nabłonka węchowego. Od opisu EOG u żab przez Ottosona w 1956 roku1, rejestracja EOG była stosowana u wielu kręgowców, w tym u salamander, królików, szczurów, myszy i ludzi (przegląd Scott i Scott-Johnson, 2002, ref. 2). Ostatnie postępy w modyfikacjach genetycznych myszy odnowiły zainteresowanie rejestracją EOG w celu fizjologicznej charakterystyki funkcji węchowych u myszy z knock-outem i knock-inem. Rejestracje EOG z powodzeniem zastosowano do wykazania centralnej roli komponentów transdukcji sygnałów węchowych3-8, a w ostatnim czasie do charakterystyki wkładu określonych mechanizmów regulacyjnych w odpowiedziy OSN9-12.
Detekcja substancji zapachowych zachodzi na powierzchni nabłonka węchowego, na rzęskach neuronów receptorowych węchu (OSN), gdzie kaskada transdukcji sygnału prowadzi do otwarcia kanałów jonowych, generując prąd płynący do rzęsek i depolaryzujący błonę13. EOG to ujemny potencjał rejestrowany zewnątrzkomórkowo na powierzchni nabłonka węchowego po stymulacji substancją zapachową, będący wynikiem sumowania się zmian potencjału wywołanych przez poszczególne reagujące OSN w polu pomiarowym2. Porównanie amplitudy i kinetyki EOG dostarcza zatem cennych informacji o tym, jak modyfikacje genetyczne i inne manipulacje eksperymentalne wpływają na molekularne przesyłanie sygnałów leżące u podstaw odpowiedzi OSN na zapach.
W niniejszej pracy opisujemy rejestrację EOG w fazie gazowej na preparacie turbinatek węchowych myszy. W skrócie, po uśmierceniu myszy, turbinatek węchowe zostają odsłonięte poprzez przecięcie głowy wzdłuż linii środkowej i usunięcie przegrody nosowej. Następnie preparat turbinatek umieszcza się w układzie rejestrującym, a elektrodę rejestrującą przykłada się do powierzchni nabłonka węchowego jednej z turbinatek przyśrodkowych. Elektroda referencyjna zostaje połączona elektrycznie z tkanką za pomocą roztworu buforowego. Nad powierzchnią nabłonka przedmuchiwany jest ciągły strumień nawilżonego powietrza, aby utrzymać jego wilgotność. Opary roztworów substancji zapachowych są wdmuchiwane do strumienia nawilżonego powietrza w celu stymulacji nabłonka. Odpowiedzi są rejestrowane i digitalizowane do dalszej analizy.

Rejestracja elektroolfaktogramu (EOG) jest informacyjną, łatwą do przeprowadzenia i niezawodną metodą oceny funkcji węchowych na poziomie nabłonka węchowego. Niniejszy protokół opisuje konfigurację układu rejestracyjnego, przygotowanie tkanek mysich, gromadzenie danych oraz podstawową analizę danych.

Analiza odpowiedzi neuronów sensorycznych węchu myszy z wykorzystaniem zapisu elektroolfaktogramu w fazie gazowej

Zwierzęta polegają na węchu w wielu kluczowych zachowaniach, takich jak wyszukiwanie źródeł pożywienia, unikanie drapieżników oraz identyfikacja osobników tego samego gatunku w celu kopulacji i...

Preparat nabłonka węchowego zamocowano na szalce i umieszczono w strumieniu nawilżonego powietrza. Pod mikroskopem stereoskopowym elektrodę referencyjną połączono elektrycznie z tkanką poprzez roztwór buforowy. Elektrodę rejestrującą umieszczono na powierzchni nabłonka węchowego.Nabłonek węchowy jest stymulowany za pomocą kontrolowanych komputerowo puf odorantów podawanych w strumieniu nawilżonego powietrza, które transportuje substancje zapachowe do nabłonka węchowego. Sygnały EOG są przesyłane przez wzmacniacz i digytyzator do komputera rejestrującego. Witam, jestem Catherine Ciar z Laboratorium Higieny XO w Katedrze Biologii na Uniwersytecie Johns Hopkins.Dzisiaj przedstawimy procedurę rejestracji elektroolfaktogramu u myszy. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania reakcji neuronów sensorycznych węchu na zapachy. Zacznijmy zatem.Aparatura rejestrująca składa się z elektrody rejestrującej, elektrody odniesienia, rurki doprowadzającej powietrze, stolika z preparatem oraz mikroskopu sekcyjnego, z których wszystkie są zamocowane na stole pneumatycznym wewnątrz klatki Faradaya. Do rozmieszczenia elektrod w rurce doprowadzającej powietrze wykorzystuje się mikromanipulatory. Ciągły strumień powietrza jest przepuszczany przez wodę destylowaną w celu nawilżenia, a następnie kierowany przez rurkę doprowadzającą powietrze nad preparat.Jako powierzchnia montażowa dla preparatu wykorzystuje się szalkę hodowlaną o średnicy 60 mm wypełnioną agarem o grubości od sześciu do ośmiu milimetrów. W agarze w szalce montażowej wydrążono otwór oraz kanał. Służą one do zapewnienia połączenia elektrycznego między elektrodą odniesienia a preparatem za pomocą zmodyfikowanego roztworu Ringera.Elektrody rejestrujące i referencyjne są podłączone do wzmacniacza. Sygnały z wzmacniacza są przesyłane do digitalizatora, a następnie do komputera. Oprogramowanie XI graph służy do sterowania protokołem stymulacji, rejestrowania sygnału oraz analizy odpowiedzi.Oscyloskop jest podłączony za wzmacniaczem w celu monitorowania potencjału elektrycznego w czasie rzeczywistym podczas umieszczania elektrody rejestrującej, a także podczas rejestracji EOG. Podawanie bodźców zapachowych jest sterowane za pomocą picospritzera, który jest podłączony do tego samego komputera, który służy do akwizycji sygnału bezpośrednio przed podaniem bodźca zapachowego.Wyjście rozpylacza pico jest połączone z butelką z substancją zapachową zawierającą ciekły odorant. Butelka ta jest następnie połączona z rurką doprowadzającą powietrze. Przejdźmy teraz do sposobu przygotowania elektrod do eksperymentów rejestracyjnych.Elektrodą rejestrującą jest drut srebrowy z chlorkiem srebra w dociąganej kapilarze szklanej wypełnionej zmodyfikowanym roztworem Ringera. Elektrodą odniesienia jest drut srebrowy z chlorkiem srebra. Przygotowanie obu elektrod należy rozpocząć od zamontowania drutu srebrowego w uchwycie elektrody.W przypadku elektrody pomiarowej z końca uchwytnika elektrody powinien wystawać jeden do dwóch centymetrów drutu. W przypadku elektrody odniesienia można pozostawić więcej drutu. Aby nanieść powłokę z chlorku srebra, należy umieścić drut w 0,1 molarnym roztworze chlorku sodu i podłączyć uchwytnik elektrody do bieguna dodatniego źródła prądu stałego o napięciu od 1,5 do dziewięciu woltów.Ujemny biegun źródła zasilania należy połączyć elektrycznie z 0,1 M roztworem chlorku sodu. Pozostawić układ w reakcji przez 10 minut, aby wyrównać ładunki statyczne między elektrodą pomiarową a elektrodą odniesienia. Przed zamontowaniem elektrod w aparaturze pomiarowej należy je krótko ze sobą zetknąć.Następnie wyprowadź szklaną kapilarę za pomocą mikro-wyciągacza pipet. Otwór na końcówce kapilary powinien mieć średnicę około pięciu do 10 mikronów. Użyj rysika diamentowego, aby naciąć i odłamać tępy koniec kapilary, tak aby była ona o około dwa centymetry dłuższa od srebrnego drutu.Użyj palnika butanowego, aby wypolerować ogniowo cięty koniec, a następnie roztop 0,5% agros w zmodyfikowanym roztworze Ringera. Za pomocą pipety transferowej pobierz niewielką ilość stopionego roztworu agros do końcówki elektrody, używając strzykawki, która została podgrzana i wyciągnięta, aby uzyskać długi, cienki koniec. Wypełnij wyciągniętą kapilarę mniej więcej do połowy.Używając zmodyfikowanego roztworu Ringera, delikatnie stuknij kapilarę, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Przechowuj wypełnioną elektrodę w słoiku do przechowywania z niewielką ilością zmodyfikowanego roztworu Ringera na dnie, aż do momentu użycia. Po przygotowaniu próbki tkanki do rejestracji, zamontuj wypełnioną kapilarę na przewodzie elektrody rejestrującej wraz z przygotowanymi elektrodami.Przeanalizujmy eksperyment rejestracyjny w celu rozpoczęcia przygotowania tkanki do pomiarów. Usuń skórę pokrywającą czaszkę uśpionej myszy i przedziel głowę na pół wzdłuż linii środkowej, a następnie zamocuj jedną z połówek głową stroną przyśrodkową do góry na podkładce montażowej. Ostrożnie usuń przegrodę nosową, aby odsłonić błonia przeciwnose.Umieść płytkę z zamocowaną tkanką na stole rejestracyjnym. Ustaw stół tak, aby miejsce rejestracji na błoniach nosowych znajdowało się w centrum pola widzenia mikroskopu. Następnie otwórz zawór butli z powietrzem, aby dostarczyć nawilżone powietrze z przepływem około 600 milliliters per minute na powierzchnię błoni nosowych.Umieść rurkę doprowadzającą powietrze w odległości około 10 milimetrów od miejsca rejestracji. Ustaw wzmacniacz w trybie DC, ponieważ wzmacnianie AC wywoła artefakty w sygnale EOG. Rejestrację przeprowadź z zastosowaniem filtra dolnoprzepustowego o częstotliwości 1 kHz i wzmocnieniu 100 x.Teraz zamocuj elektrody rejestrujące i referencyjną na mikromanipulatorach. Opuść elektrodę referencyjną do otworu w naczyniu montażowym i przykryj ją zmodyfikowanym roztworem Ringera w taki sposób, aby była ona elektrycznie połączona z tkanką. Ostrożnie opuść elektrodę rejestrującą na powierzchnię małżowiny nosowej 2B lub 3.Elektroda powinna ledwo dotykać powierzchni nabłonka węchowego. Gdy elektroda zetknie się z nabłonkiem, na oscyloskopie pojawi się prosta linia bazowa. Teraz podłącz buteleczkę z substancją zapachową do bocznego portu w rurce doprowadzającej powietrze w komputerze.Rozpocznij protokół stymulacji. Częstotliwość próbkowania podczas akwizycji danych powinna wynosić 2 kHz lub więcej. Oprogramowanie wyzwoli impuls zapachowy i rozpocznie rejestrację.Typowy protokół stymulacji może obejmować pojedyncze sparowane impulsy o czasie trwania 100 ms, oddzielone od siebie odstępem jednej sekundy, lub pojedynczy impuls o czasie trwania 100 ms, albo impuls podtrzymywany przez 10 s. Aby zminimalizować adaptację, należy zachować od jednej do pięciu minut przerwy między protokołami po podaniu wysokich stężeń zapachów. W rurce mogą pozostać resztki zapachu; przed przystąpieniem do analizy kolejnych próbek tkanek należy przemyć rurkę doprowadzającą powietrze 95% etanolem i wysuszyć ją.Oprogramowanie Axo graft udostępnia narzędzia do pomiaru kluczowych parametrów sygnału EOG. Parametry te obejmują amplitudę odpowiedzi, latencję, czas do osiągnięcia szczytu oraz stałe czasowe wygaszania. Kilka parametrów EOG jest szczególnie użytecznych do porównywania znormalizowanych odpowiedzi między myszami, w tym amplituda odpowiedzi, czas narastania latencji, czas do osiągnięcia szczytu oraz stała czasowa wygaszania.Przedstawiono tutaj OGs myszy w odpowiedzi na stymulację rosnącymi stężeniami ciekłego octanu amylu. Czarna linia u góry wskazuje czas i czas trwania stymulacji substancją zapachową. Widoczna jest tutaj zależność dawka-odpowiedź uśredniona z pięciu myszy; słupki błędów reprezentują 95% przedziały ufności.Spadek amplitudy szczytowej jest często obserwowany przy bardzo wysokich stężeniach zapachów. Przykład EOG w odpowiedzi na stymulację podwójnym impulsem pokazuje, że pojedynczy krótki impuls substancji zapachowej wywołuje adaptację trwającą kilka sekund. Przedstawiono tutaj EOG w odpowiedzi na 10 sekund ciągłej stymulacji substancją zapachową.Elektro-olfaktogram (EOG) wykazuje desensytyzację podczas ciągłej prezentacji substancji zapachowej. Przedstawiliśmy właśnie sposób rejestracji elektro-olfaktogramu u myszy. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby umieścić elektrodę bezpośrednio na powierzchni nabłonka i nie wprowadzać jej pod tę powierzchnię.Zawsze rejestruj sygnały z tej samej strony głowy i unikaj modyfikacji konfiguracji aparatury, aby zminimalizować zmienność. Utrzymuj tkankę w stanie wilgotnym, unikając jednak gromadzenia się kropel cieczy; umieszczenie tkanki w nawilżonym powietrzu bezpośrednio po sekcji pozwoli zachować ją w optymalnym stanie do rejestracji. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w eksperymentach.

analyzing-responses-mouse-olfactory-sensory-neurons-using-air-phase

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Analiza odpowiedzi neuronów czuciowych węchowych myszy za pomocą rejestracji elektroolfaktogranu fazy powietrznej

Rejestracje za pomocą macierzy mikroelektrod (MEA) stanowią metodę badania aktywności elektrycznej dużych populacji neuronów. W niniejszym materiale przedstawiamy szczegóły przygotowania MEA do rejestracji sygnałów z nabłonka womeronasalnego myszy przy jednoczesnej stymulacji tkanki.

Rejestracje z macierzy wieloelektrodowej nabłonka narządu Jacobsona

Układy węchowe owadów zapewniają wyjątkowe możliwości rejestrowania odpowiedzi indukowanych substancjami zapachowymi w formie elektroantenogramów (EAG) oraz rejestracji z pojedynczych sensyli (SSR), które stanowią odpowiednio sumaryczne odpowiedzi wszystkich neuronów receptorowych zapachowych (ORNs) zlokalizowanych na antenie oraz tych znajdujących się w poszczególnych sensylach.

Pomiary elektrofizjologiczne z systemu węchowego ćmy

Niniejszy artykuł przedstawia protokoły obrazowania wrodzonych sygnałów optycznych oraz sygnałów autofluorescencji flawoprotein w celu mapowania aktywności wywołanej zapachami na powierzchni opolpacha u myszy.

Obrazowanie aktywności wywołanej zapachami w opoliach myszy z wykorzystaniem sygnałów odbicia optycznego i autofluorescencji

Neurony receptorowe węchu (ORNs) przekształcają sygnały zapachowe najpierw w prąd receptorowy, który z kolei wywołuje potencjały czynnościowe przekazywane do neuronów drugiego rzędu w opłatce węchowej. W niniejszej pracy opisujemy technikę pipety ssącej służącą do jednoczesnego rejestrowania indukowanego substancją zapachową prądu receptorowego oraz potencjałów czynnościowych z ORNs myszy.

Rejestracja odpowiedzi indukowanych substancjami zapachowymi w neuronach receptorowych węchowych z wykorzystaniem techniki pipety ssącej

Muszki owocowe mają złożony system węchowy, potrafią rozróżniać setki substancji zapachowych i używać swojego węchu do kierowania decyzjami behawioralnymi. Ten film opisuje czterokierunkowy test olfaktometryczny, metodę badania węchowych reakcji behawioralnych u much. Prezentowany klip protokołu pokazuje, jak radzić sobie z muchami testowymi i jakie są krytyczne kroki podczas wykonywania testu.

Czterokierunkowy test olfaktometryczny: metoda oceny reakcji zapachowych u Drosophila

Ten film demonstruje elektrofizjologiczny zapis węchowych neuronów czuciowych (OSN) u myszy przy użyciu techniki perforowanego patch-clamp. Nabłonek węchowy, zawierający OSN z receptorami zapachowymi znakowanymi fluoroforem, jest izolowany od myszy i umieszczany w komorze rejestracyjnej. Pipeta rejestrująca jest zaciśnięta na dendrytycznym pokrętle OSN, a nystatyna w pipecie perforuje membranę, tworząc połączenie elektryczne z komórką. Na koniec za pomocą kolejnej pipety dostarcza się...

Perforowany zapis węchowych neuronów czuciowych u myszy

Pokazujemy różne warianty techniki wewnątrzkomórkowego zapisu wielojednostkowego, aby scharakteryzować reakcje wywołane zapachem w pierwszych trzech etapach szlaku węchowego bezkręgowców. Techniki te można łatwo zaadaptować do badania aktywności zespołu również w innych systemach neuronowych.

Wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca americana)

Analiza fizjologicznych właściwości węchowych neuronów czuciowych nadal napotyka na techniczne ograniczenia. Tutaj rejestrujemy je przez perforowany patch-clamp w nienaruszonym preparowaniu nabłonka węchowego u myszy ukierunkowanych na geny. Technika ta pozwala na scharakteryzowanie właściwości błony i odpowiedzi na określone ligandy neuronów wyrażających określone receptory węchowe.

Perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy

Opisujemy tutaj konfigurację behawioralną i metodę analizy danych do oceny reakcji węchowych do 100 muszek octowych (Drosophila melanogaster). System ten może być stosowany z pojedynczymi lub wieloma bodźcami węchowymi i może być przystosowany do optogenetycznej aktywacji lub wyciszania podzbiorów neuronów.

Zachowania węchowe oceniane za pomocą komputerowego śledzenia Drosophila w czterokwadrantowym olfaktometrze

Zewnątrzkomórkowy zapis wielopunktowy z nerwu węchowego jest czułą, solidną i powtarzalną metodą oceny wrażliwości węchowej u ryb morskich. Rejestruje pierwotne bodźce sensoryczne i jest niezależny od zewnętrznego zasolenia.

Zewnątrzkomórkowy zapis wielojednostkowy z nerwu węchowego teleostów

Protokół ten opisuje konstrukcję olfaktometru do eksperymentów z zachowaniami węchowymi go/no-go. Instrukcje krok po kroku wraz ze zdjęciami są dostarczane, aby zapewnić pomyślną konstrukcję olfaktometru. Dołączone są również informacje dotyczące rozwiązywania problemów napotkanych podczas procesu.

Konstruowanie olfaktometru do badań zachowań węchowych gryzoni

Poznaj metodę zapisu elektroolfaktogramu w badaniu czuciowych neuronów węchowych myszy. Technika ta umożliwia analizę odpowiedzi neuronalnych na różne odoranty w czasie rzeczywistym.

Analiza odpowiedzi neuronów sensorycznych węchu myszy z wykorzystaniem zapisu elektroolfaktogramu w fazie gazowej

Przeglądaj więcej filmów