Analiza reakcji węchowych neuronów czuciowych myszy za pomocą zapisu elektroolfaktogramu w fazie powietrznej

Preparat nabłonka węchowego montuje się na naczyniu i umieszcza w strumieniu nawilżonego powietrza. Pod mikroskopem preparacyjnym elektroda referencyjna jest elektrycznie połączona z tkanką za pomocą roztworu buforowego. Elektrodę rejestrującą umieszcza się na powierzchni nabłonka węchowego.

Nabłonek węchowy jest stymulowany przez sterowane komputerowo zaciągnięcia zapachowe podawane do strumienia nawilżonego powietrza, które przenosi substancje zapachowe do nabłonka węchowego. Sygnały EOG są przesyłane przez wzmacniacz i digitizer do komputera rejestrującego. Cześć, nazywam się Catherine Ciar i pracuję w Laboratorium Higieny XO na Wydziale Biologii Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa.

Dzisiaj pokażemy Ci procedurę rejestrowania electro olf facto grama od myszy. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania reakcji węchowych neuronów czuciowych na zapachy. Więc zacznijmy.

Aparatura rejestrująca składa się z elektrody rejestrującej, elektrody referencyjnej, rurki doprowadzającej powietrze, stolika na próbki i mikroskopu preparacyjnego, wszystkie zakotwiczone na stole powietrznym w klatce Faradaya. Manipulatory mikrom służą do umieszczania elektrod w rurze doprowadzającej powietrze. Ciągły strumień powietrza jest przepuszczany przez wodę destylowaną w celu dodania wilgoci przed przejściem przez rurkę doprowadzającą powietrze i nad próbką.

60-milimetrowe naczynie hodowlane wypełnione sardą w celu dostosowania od sześciu do ośmiu milimetrów służy jako powierzchnia montażowa próbki. Studnia i kanał są wydrążone z osłony w czaszy montażowej. Zapewnienie środków do elektrycznego połączenia elektrody referencyjnej z próbką za pomocą zmodyfikowanego roztworu pierścienia.

Elektrody rejestrująca i referencyjna są podłączone do wzmacniacza. Sygnały ze wzmacniacza przesyłane są do digitizera, a następnie do komputera. Oprogramowanie grafu XI służy do kontrolowania protokołu stymulacji, rejestrowania sygnału i analizy odpowiedzi.

Oscyloskop jest podłączony za wzmacniaczem w celu monitorowania potencjału elektrycznego w czasie rzeczywistym podczas umieszczania elektrody rejestrującej. Oraz podczas nagrań EOG. Dostarczanie bodźców zapachowych jest kontrolowane przez piko spritzer, który jest podłączony do tego samego komputera, który służy do akwizycji sygnału tuż przed dostarczeniem bodźca zapachowego.

Wyjście spryskiwacza pico jest podłączone do butelki z nawaniaczem zawierającym płynny środek zapachowy. Butelka jest następnie podłączana do rurki doprowadzającej powietrze. Zobaczmy teraz, jak przygotować elektrody do nagrywania eksperymentów.

Elektroda rejestrująca to drut chlorkowo-srebrny w ciągnionej szklanej kapilarze wypełnionej zmodyfikowanym roztworem dzwonka. Elektrodą odniesienia jest drut chlorkowo-srebrny. Przygotowanie obu elektrod należy rozpocząć od zainstalowania srebrnego drutu w uchwycie elektrody.

W przypadku elektrody rejestrującej z końca uchwytu elektrody powinien wystawać od jednego do dwóch centymetrów drutu. Na elektrodę odniesienia można pozostawić więcej drutu. Aby dodać powłokę z chlorku srebra, umieść przewód w 0.1 molowym chlorku sodu i podłącz uchwyt elektrody do dodatniego zacisku źródła zasilania prądem stałym o napięciu od 1.5 do 9 woltów.

Ujemny zacisk źródła zasilania powinien być elektrycznie podłączony do 0,1-molowego roztworu chlorku sodu. Pozwól, aby chlorek w reakcji postępował przez 10 minut, aby wyrównać wszelkie ładunki elektrostatyczne między zapisem a elektrodą odniesienia. Na krótko zetknąć elektrody ze sobą przed zainstalowaniem ich na urządzeniu rejestrującym.

Następnie pociągnij szklaną kapilę za pomocą ściągacza do mikropipet. Otwór na końcu kapilary powinien mieć średnicę około pięciu do 10 mikronów. Użyj diamentowego ołówka, aby naciąć i odłamać koniec kapilary, tak aby był o około dwa centymetry dłuższy niż srebrny drut.

Użyj palnika butanowego do wypolerowania odciętego końca, teraz rozpuść 0,5% agros w zmodyfikowanym roztworze dzwonka. Za pomocą pipety transferowej wciągnąć niewielką ilość stopionego roztworu agro do końcówki elektrody za pomocą strzykawki, która została podgrzana i pociągnięta tak, aby miała długi, cienki koniec. Napełnij wyciągniętą kapilę mniej więcej do połowy.

Za pomocą zmodyfikowanego roztworu dzwonka delikatnie przesuń kapilarę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Przechowuj napełnioną elektrodę w słoiku do przechowywania z niewielką ilością zmodyfikowanego roztworu dzwonka na dnie, aż będzie gotowa do użycia. Gdy próbka tkanki jest przygotowana i gotowa do zapisu, zainstaluj wypełnioną kapilarnę na przewodzie elektrody rejestrującej z gotowymi elektrodami.

Spójrzmy na eksperyment z nagrywaniem, aby rozpocząć przygotowanie tkanki do nagrywania. Usuń skórę pokrywającą czaszkę złożonej w ofierze myszy i przetnij głowę na pół wzdłuż linii środkowej, zamontuj połowę głowy przyśrodkową stroną do góry na czaszy montażowej. Ostrożnie usuń przegrodę, aby odsłonić małżowiny.

Umieść naczynie z zamontowaną chusteczką na stoliku nagrywającym. Ustaw stolik tak, aby miejsce nagrywania na małżowinach było wyśrodkowane pod mikroskopem. Teraz włącz zbiornik powietrza, aby dostarczyć nawilżone powietrze z prędkością około 600 mililitrów na minutę na powierzchnię małżowiny.

Umieść rurkę doprowadzającą powietrze tak, aby znajdowała się w odległości około 10 milimetrów od miejsca nagrywania. Ustaw amplifier w trybie DC, ponieważ AC amplifikacja wywoła artefakty w sygnale EOG. Pomiar z filtrem dolnoprzepustowym o częstotliwości jednego kiloherca i wzmocnieniu 100 x.

Teraz zamontuj elektrody rejestrujące i referencyjne na mikromanipulatorach. Opuść elektrodę referencyjną do studzienki na czaszy montażowej i przykryj ją zmodyfikowanym roztworem dzwonka tak, aby była elektrycznie połączona z tkanką. Ostrożnie opuść elektrodę rejestrującą na powierzchnię małżowiny dwa B lub trzy.

Elektroda powinna ledwo dotykać powierzchni nabłonka węchowego. Gdy elektroda zetknie się z nabłonkiem, na oscyloskopie pojawi się prosta linia bazowa. Teraz przymocuj butelkę z nawaniaczem do bocznego portu na rurze doprowadzającej powietrze w komputerze.

Zainicjuj protokół stymulacji. Częstotliwość próbkowania do zbierania danych powinna wynosić co najmniej dwa kiloherce. Oprogramowanie uruchomi impuls zapachowy i rozpocznie nagrywanie.

Typowym protokołem stymulacji może być 100-milisekundowy czas trwania, pojedynczy impuls sparowany, 100 milisekundowy impuls oddzielony jednosekundowym interwałem lub dziesięciosekundowym ciągłym impulsem. Aby zminimalizować adaptację, należy odczekać od jednej do pięciu minut między protokołami po dostarczeniu wysokich stężeń zapachu. Resztkowy zapach może pozostać w rurce, umyj rurkę powietrzną 95% etanolem i wysusz przed kontynuowaniem z dodatkowymi próbkami tkanek.

Oprogramowanie Axo graft dostarcza narzędzi do pomiaru kluczowych parametrów sygnału EOG. Parametry te obejmują amplitudę odpowiedzi, opóźnienie, czas do szczytu i stałe czasowe zakończenia. Kilka parametrów EOG jest szczególnie przydatnych do porównywania znormalizowanych odpowiedzi między myszami, w tym amplituda odpowiedzi, czas narastania opóźnienia, czas do szczytu i stała czasowa zakończenia.

Pokazano tutaj OG od myszy w odpowiedzi na stymulację rosnącym stężeniem ciekłego octanu amylu. linia u góry wskazuje czas i czas trwania stymulacji zapachu. Tutaj widzimy zależność dawka-odpowiedź uśredniona z pięciu słupków błędów myszy to 95% przedziały ufności.

Spadek amplitudy piku jest często obserwowany przy bardzo wysokich stężeniach zapachów. Przykładem EOG w odpowiedzi na sparowaną stymulację impulsową jest pojedynczy krótki impuls nawaniacza wywołującego adaptację trwającą kilka sekund. Na zdjęciu pokazano EOG w odpowiedzi na 10 sekund długotrwałej stymulacji zapachowej.

EOG wykazuje odczulenie podczas ciągłej prezentacji substancji zapachowej. Właśnie pokazaliśmy, jak zarejestrować gram współczynnika elektrody od myszy. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby umieścić elektrodę tylko na powierzchni nabłonka i nie wnikać elektrody pod powierzchnię.

Zawsze nagrywaj z tej samej strony głowy i unikaj modyfikacji konfiguracji w celu zminimalizowania zmienności, utrzymuj wilgotność tkanki, ale bez zbierania kropelek płynu, umieszczenie tkanki pod nawilżonym powietrzem natychmiast po wypreparowaniu utrzyma tkankę w najlepszym stanie do nagrywania. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.