Name: Izolacja i wzbogacanie mezenchymalnych komórek macierzystych szczurów (MSC) oraz separacja MSCs pochodzących z jednej kolonii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-22T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Poznaj izolację i wzbogacanie mezenchymalnych komórek macierzystych szczurów przy użyciu sortowania magnetycznego oraz cytometrii przepływowej. Ta metoda umożliwia uzyskanie jednoklonowych MSC do badań nad biologią komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była częściowo finansowana przez National Institute of Health (R01GM079688, R21RR024439 oraz R21GM075838), National Science Foundation (CBET 0941055) oraz MSU Foundation.

1. Izolacja MSC szczura
Mezenchymalne komórki macierzyste wyizolowano od samic szczurów Sprague-Dawley w wieku 6–8 tygodni zgodnie z wcześniejszym opisem 1, 2. Wyizolowane MSC mogą przylegać do powierzchni plastikowej i łatwo namnażać się podczas hodowli in vitro.
<ol>
<li> Zwierzę umieszczono w komorze anestezji i znieczulono przez około pięć minut. Podczas anestezji należy obserwować częstotliwość mrugania, oddychania i aktywność motoryczną. Wyjmij zwierzę z komory natychmiast po ustaniu aktywności motorycznej i rzadkim mruganiu.
</li><li> Połóż zwierzę na stanowisku operacyjnym i uśmierć je poprzez zwichnięcie karku. Odetnij kości udowe i piszczelowe z kończyn tylnych, usuwając skórę i mięśnie.</li>
<li> Wypreparowane kości udowe i piszczelowe zanurz na kilka sekund w 70% izopropanolu, a następnie przenieś do 1X D-PBS.</li>
<li> W komorze z laminarem kości udowe i piszczelowe przeniesiono do szalki 10 cm zawierającej DMEM. Każdą kość przytrzymywano pęsetą, a oba końce przecięto nożyczkami. Do strzykawki 3 ml przymocowano igłę 22G i napełniono ją DMEM, następnie wypłukano szpik do probówki 50 ml, wprowadzając igłę do jednego z otwartych końców kości. Czynność powtórzono 2~3 razy dla każdej kości. Po uzyskaniu całego szpiku komórki resuspendowano i przepuszczono zawiesinę komórkową przez sito komórkowe 70μm, aby usunąć resztki kostne i agregaty krwi.</li>
<li> Komórki odwirowano przy 200g, 4°C przez 5 minut i usunięto nadsącz poprzez aspirację. Komórki resuspendowano w 25 ml pożywki MSC (DMEM zawierającej 10% FBS i 1% Pen-Strep). 10 ml zawiesiny komórkowej wysiano do każdej z dwóch szalek hodowlanych 10 cm. Szalki hodowlane przechowywano w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 1~2 tygodnie. Pożywkę wymieniano co 2~3 dni.</li>
</ol>
2. Namnażanie MSC szczura
W celu wzbogacenia populacji MSC stosowano szereg białek powierzchniowych, w tym CD54, CD90, CD73, CD105 oraz CD271 3-5. W naszym badaniu wykorzystaliśmy CD54 i CD90 jako markery do wzbogacenia MSC za pomocą magnetycznej separacji komórek.
<ol>
<li> Gdy komórki osiągną około 80% konfluencji, odessać medium i dodać 4~5ml trypsyny-EDTA do każdej płytki. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze i inkubować przez około 5 minut, aby umożliwić odklejenie komórek. Po odklejeniu komórek dodać równą ilość medium hodowlanego w celu inaktywacji trypsyny. Zebrać zawiesinę komórkową do probówki 15ml i wirować komórki przy 200g, 4°C przez 5 minut.</li>
<li> Kolejne kroki opisują sposób wzbogacania MSC za pomocą dwóch markerów powierzchniowych CD54 i CD90 zgodnie z instrukcją separacji komórek przy użyciu BD IMagnet. Osad komórkowy resuspendowano w buforze do barwienia komórek (3% inaktywowane termicznie FBS w 1X D-PBS) do stężenia 20 milionów komórek/ml. Dodano biotynilowane przeciwciało CD54 (0,25μg na milion komórek) oraz biotynilowane przeciwciało CD90 (0,15μg na milion komórek) i delikatnie zmieszano z zawiesiną komórkową. Po 15-minutowej inkubacji na lodzie oznakowane komórki przemyto nadmiarem objętości buforu 1X BD IMag. Oznakowane komórki wirowano przy 200g, 4°C przez 5 minut.</li>
<li> Dokładnie wymieszać w vortexie cząstki streptavidyny BD IMag, dodać 40μl cząstek na każde 10 milionów komórek. Dokładnie wymieszać cząstki z oznakowanymi komórkami i inkubować komórki w temperaturze 6~12°C przez 30 minut. Pozwala to cząstkom streptavidyny związać się z biotynilowanymi przeciwciałami anty-CD54 i anty-CD90, które są odpowiednio związane z białkami powierzchniowymi CD54 i CD90.</li>
<li> W czasie inkubacji opisać probówkę z dnem okrągłym do zbierania frakcji pozytywnej. Po inkubacji uzupełnić objętość do stężenia 20 milionów komórek/ml za pomocą buforu 1X BD IMag i przenieść oznakowane komórki do probówki przeznaczonej dla frakcji pozytywnej. Umieścić probówkę z frakcją pozytywną na BD IMagnet i pozostawić na 6 minut, a następnie usunąć nadsącz za pomocą szklanej pipety Pasteura, podczas gdy probówka z frakcją pozytywną wciąż znajduje się na BD IMagnet.</li>
<li> Zdjąć probówkę z frakcją pozytywną z BD IMagnet i umieścić ją na lodzie. Dodać 1ml lodowatego buforu 1X BD IMag i resuspendować komórki poprzez delikatne mieszanie. Umieścić probówkę z powrotem na BD IMagnet i pozostawić na 2~4 minuty. Usunąć nadsącz nową szklaną pipetą Pasteura. Powtórzyć mycie opisane w punkcie 2.5 jeszcze raz.</li>
<li> Zdjąć probówkę z BD IMagnet i resuspendować komórki w medium hodowlanym, zasiać jedną kolbę 75cm2 do podtrzymania hodowli komórek oraz płytkę 10cm do cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
3. Weryfikacja ekspresji markerów powierzchniowych za pomocą cytometrii przepłyewej
Przeprowadzono analizę cytometryczną w celu zweryfikowania, czy uzyskane komórki wykazują ekspresję CD54 oraz CD90. Marker HSC CD45 został wykorzystany do potwierdzenia, że MSC są pozbawione HSC.
<ol>
<li>Gdy komórki osiągną około 80% konfluencji, przeprowadzić trypsynizację za pomocą trypsyny z EDTA i zebrać komórki do probówki o pojemności 15ml. Wirować z prędkością 200g w temperaturze 4°C przez 5 minut w celu zebrania komórek.</li>
<li>Odssać nadsącz i raz przemyć komórki 1X D-PBS. Resuspender komórki w buforze do barwienia komórek (1X D-PBS zawierający 2% FBS i 0,05% azotku sodu) do końcowego stężenia 5~10 milionów komórek/ml i przechowywać komórki na lodzie. Odmierzyć 100μl zawiesiny komórkowej do sześciu oznakowanych probówek (1. same komórki; 2. kontrola izotypowa IgG2a; 3. kontrola izotypowa IgG1; 4. CD45; 5. CD54; 6. CD90).</li>
<li>Dodać kontrole izotypowe oraz przeciwciała pierwszorzędowe w odpowiednich stężeniach (IgG2a i IgG1: 20μl na milion komórek; CD45: 0,5μg na milion komórek; CD54: 0,25μg na milion komórek; CD90: 0,15μg na milion komórek) i inkubować w temperaturze 4°C przez 30 minut.</li>
<li>Przemyć komórki dwukrotnie 1X D-PBS, a następnie resuspender je w 100μl buforu do barwienia komórek. Dodać SA-PE (streptawidyna-fikoeCerytryna, stosować 0,15μg na milion komórek) i inkubować w temperaturze 4°C przez 30 minut w ciemności.</li>
<li>Przemyć znakowane komórki dwukrotnie 1X D-PBS. Resuspender komórki w 400μl buforu do barwienia komórek i przenieść do probówki typu Falcon do analizy cytometrycznej.</li>
</ol>
4. Separacja MSC pochodzących z pojedynczych kolonii
MSC stanowią heterogenną populację składającą się z różnych subpopulacji o odmiennych kształtach komórek, tempach wzrostu oraz zdolnościach do różnicowania 6. Jednakże wszystkie subpopulacje wykazują ekspresję znanych markerów MSC, w związku z czym wykorzystanie markerów do wyodrębnienia tych subpopulacji nie jest możliwe. Zastosowaliśmy zatem cylindry do klonowania, aby wyizolować poszczególne subpopulacje w postaci kolonii powstałych z pojedynczych komórek.
<ol>
<li> Wysiać komórki w zagęszczeniu około 50~100 komórek na płytkę 10 cm. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO2 przez 1~2 tygodnie. W tym okresie badać dobrze odizolowane kolonie za pomocą mikroskopu odwróconego. Gdy kolonie osiągną odpowiednią wielkość (najlepiej powyżej 100 komórek w każdej kolonii), zaznaczyć je markerem na spodzie płytki. Wybierając kolonię do zaznaczenia, należy upewnić się, że w jej pobliżu nie znajdują się inne kolonie.</li><li> Odessać medium i raz przemyć płytkę 1X D-PBS. Za pomocą sterylnej pęsety ująć sterylny cylinder do klonowania i delikatnie umieścić go wokół zaznaczonej kolonii. Powtarzać czynność, aż nad wszystkimi zaznaczonymi koloniami zostaną umieszczone cylindry. Wybrane kolonie powinny być od siebie oddalone w taki sposób, aby każdy cylinder zawierał tylko jedną kolonię.
</li><li> Do każdego cylindra do klonowania dodać 100μl trypsyny-EDTA i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na około 5 minut. Po 5 minutach sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki zaokrąglają się. Gdy komórki odkleją się od podłoża, dodać taką samą ilość medium hodowlanego, aby dezaktywować trypsynę. Wymieszać zawiesinę komórkową za pomocą mikropipety 200μl i przenieść ją do płytki 60 mm zawierającej 3ml uprzednio ogrzanego medium hodowlanego. Odpowiednio opisać płytki i umieścić je z powrotem w inkubatorze. Przez kolejne kilka dni monitorować zmiany morfologiczne.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Zgodnie z protokołem opisanym w części dotyczącej izolacji MSC szczura, plastycznie przylegające MSC powinny być widoczne następnego dnia po wysianiu. W miarę dalszej proliferacji komórek, komórki konfluentne powinny wyglądać jak komórki przedstawione na Rycini 1A. Gdy komórki osiągną ~80% konfluencji (Rycina 1B), można przeprowadzić pasażowanie. Podczas pasażowania do odrywania komórek zastosowano trypsynę-EDTA; odrywane komórki są małe i okrągłe, co pokazano na Rycini 1C.
<img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig1.jpg" alt="Zdjęcia z mikroskopu kultur komórkowych pokazujące różną gęstość komórek; oznaczone jako A, B, C; paski skali 100µm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Obrazy w kontraście fazowym MSC szczura. (A) Konfluentne MSC. Większość komórek ma kształt wrzecionowaty lub gwiaździsty. (B) MSC przy konfluencji około 80%. (C) Ododerwane komórki po trypsynizacji są małe i okrągłe.
Po wzbogaceniu MSC za pomocą magnetycznej separacji komórek przeprowadza się analizę cytometryczną w celu weryfikacji ekspresji markerów powierzchniowych. Jeśli wzbogacenie przebiegło pomyślnie, komórki powinny wykazywać pozytywne barwienie dla markerów MSC CD54 i CD90, natomiast negatywne dla markera HSC CD45 (Rysunek 2). Jako kontrole negatywne stosuje się kontrole izotypowe IgG2a i IgG1.
<img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig2.jpg" alt="Wykres cytometrii przepływowej z intensywnością fluorescencji, analiza markerów CD, wyniki dla CD45, CD54, CD90." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Analiza cytometryczna MSCs pod kątem markerów powierzchniowych. MSCs znakowano przeciwciałami przeciwko IgG2a (kontrola izotypowa 1), IgG1 (kontrola izotypowa 2), CD45, CD54 i CD90. MSCs wykazywały ekspresję CD54 i CD90, ale nie CD45.
Gdy komórki zostaną wysiane z odpowiednią gęstością klonalną, kolonie powinny powstawać z pojedynczych komórek. Rysunek 3A przedstawia kolonię utworzoną przez jedną komórkę. Następnie można użyć cylindrów do klonowania, aby oddzielić kolonie, a komórki pochodzące z tych kolonii można hodować osobno. Rysunki 3B i 3C przedstawiają komórki pochodzące z dwóch oddzielnych kolonii. Komórki pochodzące z kolonii 1 mają kształt wrzecionowaty (Rysunek 3B), natomiast komórki pochodzące z kolonii 2 są okrągłe (Rysunek 3C).
<img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig3.jpg" alt="Porównanie kultur komórkowych; obraz mikroskopowy; warunki próbek A, B, C w skali 50μm; eksperyment." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Tworzenie kolonii przez MSC i komórki pochodne z pojedynczych kolonii. MSC hodowane w gęstości klonalnej tworzą pojedyncze kolonie. Kolonie te można oddzielić za pomocą cylindrów do klonowania, a komórki z różnych kolonii można hodować osobno. (A) Reprezentatywna kolonia utworzona przez MSC po wysianiu w gęstości klonalnej. (B) Komórki o wrzecionowatym kształcie pochodne z jednej kolonii. (C) Komórki okrągłe pochodne z innej kolonii.

<ol><li>de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+glial+glutamate+transporters+in+adult+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells.</a> J Neurochem. 91, 155-166 (2004).</li>
<li>Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+dexamethasone+withdrawal+on+osteoblastic+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells.</a> J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).</li>
<li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+mesenchymal+stem+cells%3A+their+phenotype%2C+differentiation+capacity%2C+immunological+features%2C+and+potential+for+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).</li>
<li>Abdallah, B. M., Kassem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells%3A+from+basic+biology+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications.</a> Gene Ther. 15, 109-116 (2008).</li>
<li>Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Krause+Plasticity+of+marrow-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Krause Plasticity of marrow-derived stem cells.</a> Blood. 102, 3483-3493 (2003).</li>
<li>Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+subpopulation+of+rapidly+self-renewing+and+multipotential+adult+stem+cells+in+colonies+of+human+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).</li>
</ol>

Niniejszy protokół opisuje sposób izolacji i namnażania MSC. Uwzględniono w nim również metodę oddzielania komórek pochodzących z pojedynczych kolonii. Istnieje kilka kroków kluczowych dla pomyślnej izolacji, namnażania i separacji kolonii. Podczas izolacji komórek od szczura zaleca się filtrowanie przez sitko komórkowe lub sterylną siatkę nylonową o podobnych oczkach w celu usunięcia skrzepów krwi i fragmentów kości. Po wysianiu komórek i inkubacji przez noc w medium będzie unosić się wiele martwych komórek; ich usunięc...

<table><tbody><tr><td>1X D-PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>Sito do oddzielania komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>pł Tks (płytkowa surowica bydlęca)</td><td>Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>BD Imagnet</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>Biotynowana mysia IgG2a</td><td>BD Biosciences</td><td>555572</td><td></td></tr><tr><td>biotynilowana mysia IgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>555747</td><td></td></tr><tr><td>Biotynilowane przeciwciało anty-CD54 szczura</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL054B</td><td></td></tr><tr><td>Biotynilowane przeciwciało anty-CD90 szczura</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL005B</td><td></td></tr><tr><td>Biotynilowane przeciwciało anty-CD45 szczura</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL001B</td><td></td></tr><tr><td>bufor BD Imag</td><td>BD Biosciences</td><td>552362</td><td></td></tr><tr><td>Probówka z okrągłym dnem</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Cząsteczki streptawidyny</td><td>BD Biosciences</td><td>557812</td><td></td></tr><tr><td>SA-PE</td><td>R&amp;R&D Systems</td><td>F0040</td><td></td></tr><tr><td>cylinder do klonowania</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2059</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i namnażanie mezenchymalnych komórek macierzystych (msc) szczura oraz separacja msc pochodzących z pojedynczych kolonii

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

MSC to populacja dorosłych komórek macierzystych, która stanowi obiecujące źródło w zastosowaniach terapeutycznych. Komórki te można wyizolować ze szpiku kostnego i łatwo oddzielić od hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) dzięki ich zdolności do przylegania do tworzywa sztucznego. Niniejszy protokół opisuje sposób izolacji MSC z kości udowych i piszczeli szczura. Wyizolowane komórki zostały następnie wzbogacone pod kątem dwóch markerów powierzchniowych MSC, CD54 i CD90, za pomocą magnetycznego sortowania komórek. Ekspresję markerów powierzchniowych CD54 i CD90 potwierdzono następnie analizą cytometrii przepływowej. Włączono również marker HSC CD45, aby sprawdzić, czy z posortowanych MSC usunięto komórki HSC. MSC są naturalnie dość heterogeniczne. Istnieją subpopulacje komórek o różnych kształtach, zdolnościach do proliferacji i różnicowania. Wszystkie te subpopulacje wykazują ekspresję znanych markerów MSC i nie zidentyfikowano dotąd żadnego unikalnego markera dla poszczególnych subpopulacji. Dlatego alternatywnym podejściem do wydzielenia różnych subpopulacji jest zastosowanie cylindrów klonujących w celu odseparowania komórek pochodzących z pojedynczych kolonii. Komórki pochodzące z pojedynczych kolonii mogą być następnie hodowane i oceniane oddzielnie.

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) szczura wyizolowano z kości udowych i piszczeli, a następnie wzbogacono za pomocą magnetycznej separacji komórek. Ekspresję markerów powierzchniowych w posortowanych komórkach potwierdzono metodą cytometrii przepływowej. Komórki te hodowano również w gęstości klonalnej w celu utworzenia pojedynczych kolonii, które następnie oddzielono za pomocą cylindrów do klonowania.

Izolacja i namnażanie mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) szczura oraz separacja MSC pochodzących z pojedynczych kolonii

MSC to populacja dorosłych komórek macierzystych, która stanowi obiecujące źródło dla zastosowań terapeutycznych. Komórki te można izolować z szpiku kostnego i...

Mezenchymalne komórki macierzyste, w skrócie MSCs, są izolowane od samicy szczura szczepu rag dolly w wieku od sześciu do ośmiu tygodni i hodowane w 10 centymetrowej płytce Petriego, aż osiągną około 80% konfluencji. W celu wzbogacenia populacji MSCs, komórki barwi się przeciwciałami pierwszorzędowymi sprzężonymi z biotyną, a następnie stosuje kuleczki magnetyczne sprzężone ze streptawidyną. Tak oznakowane komórki są następnie rozdzielane na dwie frakcje – negatywną i pozytywną – za pomocą magnetycznego sortowania komórek (MACS).Następnie przeprowadzono analizę cytometryczną w celu potwierdzenia ekspresji markerów powierzchniowych. Na koniec zastosowano cylindry do klonowania, aby uzyskać MSC pochodzące z pojedynczych kolonii. Cześć, jestem Lee z laboratorium Christiny Chang w Departamencie Inżynierii Chemicznej i Inżynierii Materiałowej na Uniwersytecie Michigan State.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę izolacji i namnażania komórek macierzystych chy oraz otrzymywania komórek pochodzących z pojedynczych kolonii. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania zachowań proliferacyjnych i różnicowania się czerwonych komórek macierzystych. Przejdźmy zatem do szczegółów.Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) zostaną wyizolowane z samicy szczura linii Sprague Dawley w wieku od sześciu do ośmiu tygodni. Aby rozpocząć tę procedurę, należy odciąć kości udowe oraz piszczele z tylnych kończyn uśpionego zwierzęcia. Należy usunąć skórę i mięśnie, umieścić wypreparowane kości udowe i piszczele w 70% izopropanolu na kilka sekund, a następnie przenieść je do 1X DPBS.Poniższe kroki należy wykonać w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Najpierw przenieść kość udową i piszczelową do szalki o średnicy 10 centymetrów zawierającej DMEM. Następnie, przytrzymując każdą kość pęsetą, rozciąć nożyczkami oba końce.Do strzykawki o pojemności 3 ml przymocuj igłę o rozmiarze 22 G i napełnij ją pożywką DMEM. Wprowadź igłę do jednego z otwartych końców kości i wypłucz szpik do probówki o pojemności 50 ml. Powtórz czynność dwa lub trzy razy dla każdej kości, aż do całkowitego pozyskania szpiku.Ponownie zawiesić komórki, a następnie przepuścić zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm w celu usunięcia resztek kostnych i agregatów krwi. Odwirować komórki przy 200 ×g w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Po usunięciu supernatantu za pomocą aspiracji, ponownie zawiesić komórki w 25 mL pożywki do wysiewu MSC.10 ml zawiesiny komórkowej do każdej z dwóch szalek hodowlanych o średnicy 10 cm. Inkubować szalki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez jeden do dwóch tygodni. Gdy wcześniej wyizolowane MSC szczura osiągną konfluencję na poziomie około 80%, odessać medium i dodać od czterech do pięciu ml trypsyny EDTA do każdej szalki.Przenieś szalki z powrotem do inkubatora i inkubuj przez około pięć minut. Aby umożliwić odklejenie komórek, dodaj taką samą ilość pożywki hodowlanej w celu inaktywacji trypsyny. Zbierz zawiesiny komórkowe do probówki o pojemności 15 ml i odwiruj komórki przy 200 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.W tej części zademonstrujemy wzbogacenie populacji MSCs za pomocą dwóch markerów powierzchniowych: CD 54 oraz CD 90. Wykorzystamy do tego magnes BD I, będący magnesem do separacji komórek firmy BD Biosciences. Należy rozpocząć od resuspensji osadu komórkowego w buforze do barwienia komórek do stężenia 20 milionów komórek na mililitr.Następnie do zawiesiny komórkowej dodaj biotynilowane przeciwciało CD 54 oraz biotynilowane przeciwciało CD 90 i delikatnie wymieszaj; po inkubacji w lodzie przez 15 minut przemyj znakowane komórki nadmiarową objętością buforu BD IMAG 1X. Odwiruj znakowane komórki przy 200 $\times$g w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Przygotuj cząsteczki streptawidyny BD imag, dokładnie wstrząsając je w wirówce typu vortex, a następnie dodaj 40 µL cząsteczek na każde 10 milionów komórek.Dokładnie wymieszaj cząstki z znakowanymi komórkami i inkubuj komórki w temperaturze od 6 do 12 °C przez 30 minut. W czasie inkubacji opisz probówkę z okrągłym dnem, która posłuży do zbierania frakcji pozytywnej. Po zakończeniu inkubacji doprowadź objętość znakowania do stężenia 20 milionów komórek na mililitr.Przy użyciu jednego buforu Expedia I mag. Przenieś znakowane komórki do probówki na zbiór frakcji pozytywnej. Umieść probówkę z frakcją pozytywną na magnesie BDI i pozostaw ją na sześć minut.Następnie, gdy probówka z frakcją pozytywną wciąż znajduje się na magnesie BDI, należy usunąć nadsącz za pomocą szklanej pipety Pasteura. Następnie należy zdjąć probówkę z frakcją pozytywną z magnesu BDI i umieścić ją w lodzie. Należy dodać 1 mL schłodzonego do temperatury 4°C buforu XBDI mag i resuspendować komórki poprzez delikatne mieszanie.Umieścić probówkę ponownie na magnesie BDI i pozostawić na dwie do czterech minut. Usunąć supernatant za pomocą nowej szklanej pipety Pasteura. Powtórzyć płukanie zgodnie z wcześniejszym opisem.Powtórz czynność jeszcze raz. Na koniec usuń nadpłyn za pomocą nowej szklanej pipety Pasteura. Następnie wyjmij probówkę z urządzenia magnetycznego BDI.Resuspenduj komórki w 1 mL pożywki hodowlanej i przenieś zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 50 mL zawierającej 25 mL pożywki. Przenieś komórki do kolby kwadratowej o wymiarach 175 cm² w celu ich utrzymania oraz do szalki 10 cm do cytometrii przepływowej.Aby rozpocząć procedurę separacji MSC pochodzących z pojedynczych kolonii, wysiej komórki w zagęszczeniu od 50 do 100 komórek na płytkę 10 cm i inkubuj w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez jeden do dwóch tygodni. W tym okresie od jednego do dwóch tygodni obserwuj dobrze odseparowane kolonie za pomocą mikroskopu odwróconego. Gdy kolonie osiągną wystarczający rozmiar, przekraczający 100 komórek w każdej kolonii, zaznacz je markerem niezmywalnym na spodzie płytki.Podczas wyboru kolonii do oznakowania należy upewnić się, że w jej pobliżu nie znajdują się inne kolonie. Odessać pożywkę i raz przemyć szalkę przy użyciu X-D-P-B-S, posługując się pincetą. Pobrać sterylny cylinder do klonowania i ostrożnie umieścić go wokół oznakowanej kolonii.Powtarzaj tę czynność, aż nad każdą zaznaczoną kolonią zostanie umieszczony cylinder do klonowania. Do każdego cylindra dodaj 100 µL trypsyny EDTA i przenieś szalkę z powrotem do inkubatora. Po pięciu minutach sprawdź pod mikroskopem, czy komórki zaokrąglają się.Gdy komórki się odkleją, dodaj taką samą ilość pożywki hodowlanej, aby zneutralizować trypsynę. Wymieszaj zawiesinę komórkową za pomocą mikropipety 200 µL, a następnie przenieś zawiesinę do szalki 60 mm zawierającej 3 mL uprzednio ogrzanej pożywki hodowlanej. Opisz szalki i umieść je z powrotem w inkubatorze po ich izolacji jako komórki adherentne do plastiku.MSCs powinny być widoczne następnego dnia po wysiewaniu. W miarę dalszej proliferacji komórek, konfluencja powinna przypominać obraz widoczny w tym kontraście fazowym, gdzie większość komórek ma kształt wrzecionowaty lub gwiaździsty. Przeniesienie hodowli jest wskazane, gdy komórki osiągną około 80% konfluencji.Po trypsynizacji oddzielone komórki powinny mieć okrągły kształt i unosić się w medium. Po wzbogaceniu populacji MSC za pomocą magnetycznej separacji komórek przeprowadzana jest cytometria przepływowa w celu weryfikacji ekspresji markerów powierzchniowych. Jeśli wzbogacenie przebiegło pomyślnie, komórki powinny wykazywać pozytywne barwienie dla markerów MSC, CD 54 i CD 90, ale negatywne dla markera HSC CD 45; jako kontrole negatywne stosuje się kontrole izotypowe IgG two A i IgG one.Gdy komórki są osadzone z odpowiednią gęstością klonalną, powinny powstać kolonie wywodzące się z pojedynczych komórek, jak pokazano w tym przykładzie. Następnie można użyć cylindrów do klonowania, aby odseparować kolonie, a komórki pochodzące z tych kolonii można hodować oddzielnie. W tych dwóch przykładach komórki pochodzące z jednej kolonii mają wrzecionowaty kształt, podczas gdy komórki pochodzące z drugiej kolonii są okrągłe.Przedstawiliśmy sposób izolacji i wzbogacania przypadkowych oraz powszechnych komórek macierzystych, a także metodę otrzymywania komórek pochodzących z pojedynczych kolonii. Podczas tej procedury ważne jest pamiętanie o usunięciu skrzepów krwi i resztek kostnych w trakcie izolacji. Należy zastosować optymalną ilość przeciwciał podczas wzbogacania oraz dokładnie oznaczać dobrze wyizolowane kolonie podczas separacji kolonii.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

isolation-enrichment-rat-mesenchymal-stem-cells-mscs-separation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja i wzbogacanie komórek macierzystych mezenchymalnych szczura (MSC) oraz separacja MSC pochodzących z pojedynczych kolonii

Niniejszy protokół opisuje izolację i następującą ekspansję mezenchymalnych komórek macierzystych oraz komórek endotelialnych tworzących kolonie bez użycia surowicy zwierzęcej, w celu wygenerowania autologicznych par do celów eksperymentalnej transplantacji.

Izolacja i ekspansja w warunkach wolnych od surowicy zwierzęcej mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) oraz endotelialnych komórek progenitorowych tworzących kolonie (ECFC) pochodzących z ludzkiej pępowiny

Ten protokół opisuje technikę izolacji w celu uzyskania pierwotnych mezenchymalnych komórek zrębu rezydujących w płucach od szczurów, poprzez zastosowanie trawienia enzymatycznego, separacji gradientu gęstości, przylegania plastiku i selekcji kulek magnetycznych CD146+.

Izolacja mezenchymalnych komórek zrębowych płuc rezydentnych CD146 + z płuc szczura

W tym artykule prezentujemy metody izolowania i różnicowania komórek zrębu szpiku kostnego i hematopoetycznych komórek macierzystych od kości długich myszy. Przedstawiono dwa różne protokoły dające różne populacje komórek odpowiednie do ekspansji i różnicowania w osteoblasty, adipocyty i osteoklasty.

Izolacja, hodowla i różnicowanie komórek zrębu szpiku kostnego i progenitorów osteoklastów od myszy

Ten artykuł przedstawia prosty i ekonomiczny protokół prostej izolacji i oczyszczania mezenchymalnych komórek macierzystych z płynu maziowego białego królika z Nowej Zelandii.

Strategie sortowania komórek aktywowanych magnetycznie w celu izolacji i oczyszczenia mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z płynu maziowego z modelu królika

Ogólnym celem tego artykułu jest ujednolicenie protokołu izolacji, charakterystyki i różnicowania komórek macierzystych serca (CSC) od serca dorosłej myszy. W tym miejscu opisujemy metodę wirowania w gradimencie gęstości w celu wyizolowania mysich CSC oraz opracowane metody hodowli CSC, proliferacji i różnicowania do kardiomiocytów.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie sercowych komórek macierzystych z serca dorosłej myszy

Ten artykuł przedstawia metodę, która łączy przyleganie całego szpiku kostnego i sortowanie cytometrią przepływową do izolacji, hodowli, sortowania i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego z żuchwy szczura.

Izolacja i hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego żuchwy u szczurów

Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (Ad-MSC) mogą być potencjalnym źródłem MSC, które różnicują się w komórki produkujące insulinę (IPC). W tym protokole przedstawiamy szczegółowe kroki izolacji i charakterystyki Ad-MSC najądrza szczura, a następnie prosty, krótki protokół generowania IPC z tych samych Ad-MSC szczurów.

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych tkanki tłuszczowej szczura w celu różnicowania w komórki produkujące insulinę

Ten protokół opisuje metodologię izolowania i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (MSC) od szczurów Sprague Dawley.

Izolacja i identyfikacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej szczurów Sprague Dawley

Mezenchymalne komórki macierzyste ze szpiku kostnego szczęki pełnią znaczące funkcje w różnorodnym różnicowaniu, samoodnawianiu i modulacji immunologicznej. Stały się one kluczowym rezerwuarem komórek prekursorowych w terapii genowej, inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej. W tym miejscu przedstawiamy unikalną metodę izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego szczęki u szczurów.

Technika izolacji i hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego szpiku szczurów

Niniejszy protokół opisuje opłacalną metodę oczyszczania, namnażania i charakteryzowania wysoce jednorodnych mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMSC) od myszy. Takie podejście ułatwia pozyskiwanie dużych ilości BMSC o wysokim potencjale proliferacji i różnicowania, wspierając modele mysie i posuwając naprzód badania przedkliniczne.

Oczyszczanie, ekspansja i fenotypowanie oparte na cytometrii przepływowej mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego pochodzenia mysiego

Poznaj izolację i wzbogacanie mezenchymalnych komórek macierzystych szczurów przy użyciu sortowania magnetycznego oraz cytometrii przepływowej. Ta metoda umożliwia uzyskanie jednoklonowych MSC do badań nad biologią komórek macierzystych.

Izolacja i namnażanie mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) szczura oraz separacja MSC pochodzących z pojedynczych kolonii

Przeglądaj więcej filmów