Izolacja i namnażanie mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) szczura oraz separacja MSC pochodzących z pojedynczych kolonii

Mesenchymalne komórki macierzyste, skrócone jako MSCs, są izolowane z samicy szczura linii rag dolly w wieku od sześciu do ośmiu tygodni i hodowane w 10 centymetrowej płytce Petriego, aż osiągną około 80% konfluencji. W celu wzbogacenia populacji MSCs, komórki barwi się przeciwciałami pierwszorzędowymi sprzężonymi z biotyną, a następnie magnetycznymi kulkami sprzężonymi ze streptawidyną. Znakowane komórki są następnie rozdzielane na dwie frakcje, ujemną i dodatnią, za pomocą magnetycznego sortowania komórek (MACS).

Następnie w celu potwierdzenia ekspresji markerów powierzchniowych stosuje się analizę cytometrii przepływowej. Na koniec, w celu uzyskania MSC pochodzących z pojedynczych kolonii, wykorzystuje się cylindry do klonowania. Cześć, jestem Lee z laboratorium Christiny Chang z Katedry Inżynierii Chemicznej i Nauki o Materiałach na Michigan State University.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę izolacji i namnażania komórek macierzystych chy, a także sposób pozyskiwania komórek pochodzących z pojedynczych kolonii. Procedurę tę stosujemy w naszym laboratorium do badania proliferacji i zachowań różnicowania czerwonych komórek macierzystych. Zatem zaczynajmy.

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSCs) zostaną wyizolowane od samiczego szczura linii Sprague-Dawley w wieku od sześciu do ośmiu tygodni. Aby rozpocząć tę procedurę, należy odciąć kości udowe i piszczele z tylnych kończyn uśpionego zwierzęcia. Usunąć skórę oraz mięśnie, umieścić wypreparowane kości udowe i piszczele w 70% izopropanolu na kilka sekund, a następnie przenieść je do 1X DPBS.

Kolejne kroki należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Najpierw przenieść kość udową i piszczel do naczynia o średnicy 10 cm zawierającego DMEM. Następnie, trzymając każdą kość pęsetą, rozciąć nożyczkami oba końce.

Do strzykawki o pojemności 3 ml przymocuj igłę o rozmiarze 22G i napełnij ją pożywką DMEM. Wprowadź igłę do jednego z otwartych końców kości i wypłucz szpik do probówki o pojemności 50 ml. Powtórz tę czynność dwa do trzech razy dla każdej kości, aż do całkowitego pozyskania szpiku.

Resuspenduj komórki, a następnie przepuść zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm, aby usunąć resztki kostne i agregaty krwi. Odwiruj komórki przy 200 ×g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Po usunięciu supernatantu za pomocą aspiracji, resuspenduj komórki w 25 mL medium do posiewu MSC.

10 mililitrów zawiesiny komórkowej do każdej z dwóch szalek hodowlanych o średnicy 10 centymetrów. Inkubować szalki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i przy 5% dwutlenku węgla przez jeden do dwóch tygodni. Gdy wcześniej wyizolowane MSC szczura osiągną konfluencję na poziomie około 80%, odessać medium i dodać od czterech do pięciu mililitrów trypsyny EDTA do każdej szalki.

Przenieś naczynia z powrotem do inkubatora i inkubuj przez około pięć minut. Aby umożliwić odczepienie komórek, dodaj taką samą ilość pożywki hodowlanej w celu inaktywacji trypsyny. Zbierz zawiesiny komórkowe do probówki o pojemności 15 ml i odwiruj komórki przy 200 GS w temperaturze czterech stopni Celsius przez pięć minut.

Teraz zademonstrujemy wzbogacanie MSC o dwa markery powierzchniowe: CD 54 i CD 90. Użyjemy do tego magnesu BD I, który jest magnesem do separacji komórek firmy BD Biosciences. Rozpocznij od resuspensji osadu komórkowego w buforze do barwienia komórek do stężenia 20 milionów komórek na mililitr.

Następnie do zawiesiny komórkowej należy dodać biotynilowane przeciwciało CD 54 oraz biotynilowane przeciwciało CD 90, a następnie delikatnie wymieszać. Po inkubacji w temperaturze 4°C przez 15 minut oznakowane komórki należy przemyć nadmiarem buforu 1X BD IMAG. Oznakowane komórki należy odwirować przy 200 ×g w temperaturze 4°C przez pięć minut. Cząsteczki BD imag streptavidinu należy przygotować poprzez dokładne wymieszanie w wortexie, a następnie dodać 40 µL cząsteczek na każde 10 milionów komórek.

Dokładnie wymieszaj cząsteczki z znakowanymi komórkami i inkubuj komórki w temperaturze od 6 do 12 °C przez 30 minut. W czasie inkubacji opisz probówkę z okrągłym dnem przeznaczoną do zbierania frakcji pozytywnej. Po zakończeniu inkubacji doprowadź objętość znakowania do poziomu 20 milionów komórek na ml.

Przy użyciu jednego buforu Expedia I mag. Przenieś znakowane komórki do probówki na frakcję pozytywną. Umieść probówkę z frakcją pozytywną na magnesie BDI i pozostaw na sześć minut.

Następnie, gdy probówka z frakcją pozytywną wciąż znajduje się na magnesie BDI, usunąć nadsącz za pomocą szklanej pipety Pasteura. Następnie zdjąć probówkę z frakcją pozytywną z magnesu BDI i umieścić ją na lodzie. Dodać 1 mL schłodzonego do temperatury lodowej buforu XBDI mag i resuspendować komórki poprzez delikatne mieszanie.

Umieść probówkę z powrotem na magnesie BDI i pozostaw ją na od dwie do czterech minut. Usuń nadsącz za pomocą nowej szklanej pipety Pasteura. Powtórz proces płukania zgodnie z wcześniejszym opisem.

Powtórz tę czynność jeszcze raz. Na koniec usuń supernatant za pomocą nowej szklanej pipety Pasteura. Następnie wyjmij probówkę z urządzenia magnetycznego BDI.

Resuspenduj komórki w 1 mL pożywki hodowlanej i przenieś zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 50 mL zawierającej 25 mL pożywki. 1 kolba kwadratowa 75 cm² do utrzymania komórek oraz szalka 10 cm do cytometrii przepływowej.

Aby rozpocząć procedurę separacji MSC pochodzących z pojedynczych kolonii, wysiej komórki w gęstości od 50 do 100 komórek na płytkę o średnicy 10 cm i inkubuj w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez jeden do dwóch tygodni. W tym okresie od jednego do dwóch tygodni badaj dobrze odizolowane kolonie za pomocą mikroskopu odwróconego. Gdy kolonie osiągną wystarczający rozmiar, przekraczający 100 komórek w każdej kolonii, zaznacz je trwałym markerem na spodzie płytki.

Wybierając kolonię do oznaczenia, należy upewnić się, że w jej pobliżu nie znajdują się inne kolonie. Odessać pożywkę i przepłukać szalkę raz 1X DPBS, używając pęsety. Pobrać sterylny cylinder do klonowania i ostrożnie umieścić go wokół oznaczonej kolonii.

Powtarzać tę czynność, aż nad każdą zaznaczoną kolonią zostanie umieszczony cylinder do klonowania. Do każdego cylindra do klonowania dodać 100 µL trypsyny z EDTA i umieścić szalkę z powrotem w inkubatorze. Po pięciu minutach sprawdzić komórki pod mikroskopem, aby ocenić, czy ulegają one zaokrągleniu.

Gdy komórki odkleją się od powierzchni, dodaj równą ilość pożywki hodowlanej, aby zneutralizować trypsynę. Wymieszaj zawiesinę komórkową za pomocą mikropipety 200 µL, a następnie przenieś zawiesinę do szalki 60 mm zawierającej 3 mL uprzednio ogrzanej pożywki. Opisz szalki i umieść je z powrotem w inkubatorze po izolacji komórek adherentnych.

MSC powinny być widoczne następnego dnia po wysiewaniu. W miarę dalszej proliferacji komórek, komórki w stanie konfluencji powinny przypominać komórki przedstawione na tym obrazie w kontraście fazowym, gdzie większość z nich ma kształt wrzecionowaty lub gwiaździsty. Przesiew kultywacji jest odpowiedni, gdy komórki osiągną około 80% konfluencji.

Po trypsynizacji odseparowane komórki powinny mieć okrągły kształt i unosić się w medium. Po wzbogaceniu populacji MSC za pomocą magnetycznego sortowania komórek przeprowadzana jest cytometria przepływowa w celu weryfikacji ekspresji markerów powierzchniowych. Jeśli wzbogacenie przebiegło pomyślnie, komórki powinny wykazywać pozytywne barwienie dla markerów MSC, CD 54 i CD 90, ale negatywne dla markera HSC CD 45; jako kontrole negatywne stosuje się izotypowe kontrole IgG dwa A oraz IgG one.

Gdy komórki zostaną osadzone z odpowiednią gęstością klonalną, kolonie powinny wyrosnąć z pojedynczych komówek, tak jak pokazano w tym przykładzie. Do oddzielenia kolonii można następnie użyć cylindrów do klonowania, a komórki pochodzące z kolonii można hodować oddzielnie. W tych dwóch przykładach komórki pochodzące z jednej kolonii są wrzecionowate, podczas gdy komórki pochodzące z innej kolonii są okrągłe.

Przedstawiliśmy sposób izolacji i wzbogacania losowych oraz powszechnych komórek macierzystych, a także metodę otrzymywania komórek pochodzących z pojedynczych kolonii. Podczas tej procedury ważne jest, aby pamiętać o usunięciu skrzepów krwi i resztek kostnych w trakcie izolacji. Należy stosować optymalną ilość przeciwciał podczas wzbogacania oraz starannie oznaczać dobrze wyizolowane kolonie podczas ich separacji.

To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.