Name: Ekspresja białek rekombinowanych w drożdżach metylotroficznych Pichia pastoris (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-25T16:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Poznaj metodę ekspresji białek rekombinowanych w drożdżach Pichia pastoris. Protokół obejmuje przygotowanie komórek elektrokompetentnych, transformację wektora, izolację DNA oraz analizę Western blot.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Canadian Foundation for Innovation, British Columbia Knowledge Development Fund oraz Canadian Institutes of Health Research (CIHR) za wsparcie niniejszej pracy. M.T otrzymał wsparcie w ramach stypendium z Centre for Microbial Diversity and Evolution (CMDE), finansowanego przez fundację TULA.

<ol><li>Cereghino, G. P., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+yeast+in+biotechnology%3A+protein+production+and+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).</li>
<li>Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pichia+pastoris+as+a+Host+System+for+Transformations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pichia pastoris as a Host System for Transformations.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).</li>
<li>Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Pichia pastoris.</a> Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).</li>
<li>Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+in+fermenter+cultures+of+the+yeast+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris.</a> Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).</li>
</ol>

W niniejszym protokole opisano ekspresję białek z wykorzystaniem metylotroficznych drożdży Pichia pastoris jako systemu gospodarza. W zależności od zastosowanego wektora klonującego białko może być wydzielane do pożywki. Sekrecja białka rekombinowanego ułatwia jego późniejsze oczyszczanie. Przedstawione jednak warunki mogą wymagać optymalizacji w przypadku ekspresji różnych białek, a zmiany w warunkach i czasie ekspresji mogą prowadzić do zwiększenia poziomu białka. Wektor użyty w tym protokole posiada epitop <e...

ekspresja białek rekombinowanych w metylotropowych drożdżach pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Ekspresja białek w mikrobowym eukariotycznym gospodarzu Pichia pastoris umożliwia uzyskanie dużych ilości białka rekombinowanego w szybkim i łatwym w użyciu systemie ekspresyjnym.
Jako jednokomórkowy mikroorganizm P. pastoris jest łatwy w manipulacji i szybko rośnie na tanich pożywkach, osiągając wysoką gęstość komórek. Będąc organizmem eukariotycznym, P. pastoris jest zdolny do przeprowadzania wielu modyfikacji potranslacyjnych typowych dla komórek wyższych eukariotów, a otrzymane białka rekombinowane podlegają fałdowaniu białek, przetwarzaniu proteolitycznemu, tworzeniu mostków dwusiarczkowych oraz glikozylacji [1].
Jako drożdże metylotroficzne P. pastoris są zdolne do metabolizowania metanolu jako jedynego źródła węgla. Silny promotor oksydazy alkoholowej, AOX1, jest ściśle regulowany i indukowany przez metanol, a wykorzystuje się go do ekspresji genu docelowego. W związku z tym ekspresję obcego białka można indukować poprzez dodanie metanolu do pożywki wzrostowej [2; 3].
Kolejną istotną zaletą jest sekrecja białka rekombinowanego do pożywki hodowlanej, z wykorzystaniem sekwencji sygnałowej w celu skierowania obcego białka do szlaku sekrecyjnego P. pastoris. Dzięki temu, że drożdże wydzielają do pożywki jedynie niewielkie ilości białek endogennych, a do pożywki nie dodawano żadnych białek, białko heterologiczne stanowi większość całkowitej ilości białka w pożywce, co ułatwia kolejne etapy oczyszczania białka [3; 4].
Wektor użyty w tej procedurze (pPICZαA) zawiera promotor AOX1 umożliwiający ściśle regulowaną, indukowaną metanolem ekspresję genu zainteresowania; sygnał sekrecyjny czynnika α służący do sekrecji białka rekombinowanego, gen oporności na Zeocyn do selekcji zarówno w E. coli, jak i Pichia oraz peptyd C-końcowy zawierający epitop c-myc i znacznik polihistydynowy (6xHis) do detekcji i oczyszczania białka rekombinowanego. Przedstawiamy również analizę western blot białka rekombinowanego z użyciem specyficznego przeciwciała Anti-myc-HRP rozpoznającego epitop c-myc w wektorze macierzystym.

Protokół opisuje ekspresję białek z wykorzystaniem drożdży metylotroficznych Pichia pastoris. Przeprowadzono również przygotowanie elektrokompetentnych komórek drożdży, transformację wektora z genem zainteresowania do P. pastoris oraz oczyszczanie DNA drożdży. Ostatnie etapy tego protokołu ekspresji białek stanowią analiza Western blot oraz oczyszczanie białek.

Ekspresja białek rekombinowanych w metylotropowych drożdżach Pichia pastoris

Ekspresja białek w mikrobowym gospodarzu eukariotycznym Pichia pastoris umożliwia uzyskanie dużych ilości białka rekombinowanego w szybki i...

Poniższy protokół opisuje ekspresję białek z wykorzystaniem drożdży methyl atrophic yeast opus. Przedstawiono przygotowanie elektrokompetentnych komórek drożdży oraz transformację wektora z genem zainteresowania do PPAs, a następnie etap oczyszczania DNA drożdży w celu sprawdzenia prawidłowej integracji genu zainteresowania z genomem drożdży. Na koniec przeprowadzimy ekspresję białka rekombinowanego.Cześć, jestem Maria z laboratorium Stevena Hallama z Departamentu Mikrobiologii i Immunologii na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej. Jestem Marcus, również z laboratorium Helm. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę ekspresji białek rekombinowanych w drożdżach TRO PQ.Past stories.Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania białek z nieopisanych mikroorganizmów, w przypadku których wyekstrahowano i zarchiwizowano środowiskowe DNA oraz biblioteki meta-genomowe. Zatem zacznijmy. Ekspresja białek rekombinowanych w troficznych drożdżach *Pichia pastoris* wymaga sklonowania genu zainteresowania w ramce odczytu w wektorze PPA.W naszym doświadczeniu wykorzystujemy wektor PPIC Z alpha A. Wektor ten zawiera promotor AO X one w celu ściśle regulowanej, indukowanej metanolem ekspresji interesującego genu, sygnał sekrecyjny czynnika alfa dla sekrecji rekombinowanego białka, gen oporności zaas do selekcji zarówno w e coli, jak i pic, a także peptyd C-końcowy zawierający epitop acemic oraz znacznik polihistydynowy do detekcji i oczyszczania rekombinowanego białka. Przed transformacją należy zlinearyzować wektor zawierający interesujący gen za pomocą trawienia restrykcyjnego. Stosujemy enzym PME one, lecz możliwe jest użycie innych miejsc restrykcyjnych, o ile wstawka nie zawiera danego miejsca restrykcyjnego.Aby uzyskać wystarczającą ilość zlinearyzowanego DNA wektora, należy przygotować od trzech do czterech reakcji trawienia restrykcyjnego o objętości 50 µL w oddzielnych probówkach; po trawieniu połączyć wszystkie roztwory i zagęstzić konstrukt. Używając jednostek filtracyjnych do wirowania AmCon oraz MicroCon, należy przygotować od 5 do 20 µg zlinearyzowanego DNA w 5–10 µL sterylnej wody do transformacji do PPA dous. Aby przygotować elektrokopotentne PPA dous, na cztery dni przed planowaną transformacją należy wysiać komórki na płytki A-Y-P-D-S bez SN, a następnie inkubować w temperaturze 30 °C przez jeden do dwóch dni lub do momentu pojawienia się pojedynczych kolonii na dwa dni przed transformacją.Wyhoduj 5 ml szczepu PPA lub innego szczepu w podłożu YPD w probówce Falcon o pojemności 50 ml w temperaturze 30 °C przez noc. Dzień przed transformacją umieść probówkę Falcon w kolbie, aby przymocować ją w inkubatorze wytrząsowym. Użyj 0,25 ml nocnej kultury do zaszczepienia 500 ml świeżego podłoża YPD w kolbie o pojemności 2 l.Ponownie hoduj przez noc w inkubatorze wytrząsowym w temperaturze 30 °C do uzyskania OD 600 na poziomie 1,3–1,5. W dniu transformacji przygotuj lód, zimną, sterylną wodę oraz sorbitol 1 M. Wirowarkuj komórki przy 1500 Gs przez pięć minut w temperaturze 4 °C.Po wirowaniu zawiesamy osad w 500 mililitrach lodowatej, sterylnej wody. W zależności od pojemności probówek do wirowania, może być konieczne rozdzielenie objętości do dwóch oddzielnych probówek lub przeprowadzenie kilku cykli wirowania. Ponownie odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w 250 mililitrach lodowatej, sterylnej wody.W zależności od pojemności probówek wirówki można połączyć oddzielne osady komórkowe w jednej probówce. Po wirowaniu należy ponownie resuspender osad komórkowy. Przenieś resuspenderte komórki do probówki typu Falcon o pojemności 50 ml w 20 ml lodowatego, jednomolarnego sorbitolu i odwiruj.Po końcowym wirowaniu resuspenduj osad w jednym mililitrze lodowatego, jednomolarnego sorbitolu do końcowej objętości około 1,5 mililitra. Komórki po resuspensji w probówkach do mikrocentryfugi przechowuj na lodzie lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu ich użycia do transformacji. Przed transformacją skoncentrowanego, zlinearyzowanego konstruktu do komórek PPA przygotuj następujące odczynniki i urządzenia.Napełnić probówkę do mikrocentryfugi jednym mililitrem jednomolarnego sorbitolu i umieścić ją na lodzie. Umieścić kubek do elektroporacji o rozmiarze 0,2 centymetra na lodzie.Oznacz sterylną szklaną probówkę o pojemności 15 ml i przygotuj sterylną pipetę szklaną. Przenieś 80 µl wcześniej przygotowanych komórek elektrokompetentnych do schłodzonej na lodzie kuwety do elektroporacji o szczelinie 0,2 cm.Dodaj roztwór plazmidowego DNA do komórek i wymieszaj, poruszając końcówką pipety z boku na bok. W cuwecie do elektroporacji. Inkubuj cuwetę z komórkami w lodzie przez pięć minut.Następnie przetrzyj zewnętrzną stronę cuwety chusteczką i poddaj komórki impulsom zgodnie z parametrami dla drożdży pączkujących sugerowanymi przez producenta konkretnego urządzenia do elektroporacji. W tej demonstracji wykorzystano urządzenie BioRad gene Pulser z następującymi warunkami: napięcie ładowania 1500 V, pojemność 25 µF oraz rezystancja 200 Ω bezpośrednio po impulsie.Dodaj jeden mililitr lodowatego, jednomolowego sorbitolu do probówki. Przenieś zawartość probówki do sterylnej probówki 15 ml za pomocą sterylnej pipety szklanej. Inkubuj probówkę w temperaturze 30 °C bez wytrząsania przez 1,5 godziny.Po 1,5 godziny elektroporowane komórki są gotowe do wysiewania. Do każdej z czterech opisanych płytek YPTS zawierających 100 µg/mL Zain dodaj od pięciu do 10 sterylnych szklanych kulek. Rozsmaruj 250 µL mieszaniny po elektroporacji.Wymieszaj zawartość na każdej płytce i potrząśnij płytką w poziomie, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Pozostaw płytki do wyschnięcia na 15 minut, a następnie usuń kuleczki z agro poprzez odwrócenie płytek. Zawiń płytki w czarną folię plastikową, aby zapobiec degradacji światłoczułego Zain, i inkubuj płytki odwrócone do góry dnem przez dwa do trzech dni w temperaturze 30 °C aż do momentu powstania kolonii.Wybierz 12 kolonii. Oczyść je poprzez wyseianie klonów na świeże płytki YPDS zawierające 100 µg/mL zeiny. Aby przygotować komórki PPA do ekspresji białka, wybierz pojedynczą kolonię z oczyszczonych kolonii pichia i zaszczep w 25 ml podłoża VMGY w sterylnym kolbie o pojemności 250 ml; hoduj w temperaturze 30 °C w inkubatorze z wytrząsaniem, aż kultura osiągnie OD 600 od dwóch do sześciu.Gdy komórki osiągną odpowiednią wartość OD 600, przygotuj bank glikolu komórkowego do przechowywania. Przenieś 800 µL kultury komórkowej do dwóchmililitrowej probówki kriogenicznej i dodaj 200 µL sterylizowanego glicerolu. Przechowuj bank glikolu w temperaturze -80 °C.Dodatkowo przenieś 1,5 mililitra hodowli komórkowej do probówki do mikrocentryfugi. Zbierz komórki, wirując próbkę przy 1300 GS przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Przechowuj osad w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Komórki te zostaną wykorzystane do puryfikacji DNA drożdży w celu analizy pichia po PCR z zastosowaniem starterów specyficznych dla insertu na żelu agarozowym, aby potwierdzić, że gen zainteresowania został zintegrowany z genomem pichia. Przenieś pozostałą część 25 mililitrów hodowli do 50 mililitrowej probówki typu Falcon i zbierz komórki, odwirugując je przy 3000 Gs przez pięć minut w temperaturze pokojowej, odlej supernatant i ustaw probówkę do góry dnem na chusteczce, aby usunąć pozostałości pożywki. Aby wypłukać osad komórkowy, resuspenduj go poprzez vortexowanie lub pipetowanie w 20 mililitrach pożywki BMMY, a następnie odwiruguj.Po zlaniu nadsączu z zawiesiny komórkowej, ponownie zawiesić osad komórkowy poprzez wortexowanie lub pipetowanie w górę i w dół w pożywce BMMY do uzyskania OD 600 równej 1,0. Jest to pożywka służąca do indukcji ekspresji. Przenieść kulturę do litrowej kolby z przegrodami i zabezpieczyć kolbę zlewką o pojemności 200 ml.Zdecydowanie zalecamy stosowanie kolb z przegrodami, ponieważ zapewniają one lepsze natlenienie hodowli. W celu wydajnej ekspresji białka podczas indukcji metanolem, inkubuj kolbę w inkubatorze, aby kontynuować wzrost w temperaturze 30 °C. Jest to istotne, aby temperatura nie przekroczyła 30 °C, jeśli temperatura w Twoim inkubatorze ulega wahaniom.Ustaw temperaturę na 28 °C. Co 24 godziny dodawaj sterylizowany czysty metanol do uzyskania końcowego stężenia 0,5%metanolu, aby utrzymać indukcję. W określonych punktach czasowych po rozpoczęciu ekspresji przenieś jeden mililitr hodowli do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra i wiruj przy 1300 Gs przez 2,5 minuty. W temperaturze pokojowej przenieś supernatant do oddzielnej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra.Przechowywać nadnadkład i pellety komórkowe w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszej analizy. Próbki z różnych punktów czasowych zostaną przeanalizowane w celu ustalenia optymalnego okresu ekspresji białek po indukcji. Przedstawiamy teraz reprezentatywne wyniki pomyślnej ekspresji białek rekombinowanych przy użyciu PIA Pastis jako systemu gospodarza.Ten obraz western blot przedstawia cztery ekspresowane białka po 24 godzinach ekspresji. Przeciwciałem zastosowanym do immunoblottingu było przeciwciało acemic HRP. Druga ścieżka stanowi kontrolę negatywną i została załadowana supernatantem z komórek, które nie wykazują ekspresji białka rekombinowanego, ponieważ zostały one transformowane wektorem macierzystym.Właśnie zaprezentowaliśmy sposób ekspresji białek rekombinowanych z wykorzystaniem eukariotycznego gospodarza PQ.Plus. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest zsekwencjonowanie konstruktu w celu potwierdzenia, że gen docelowy został sklonowany w odpowiedniej ramce odczytu, a także przygotowanie wszystkich szalek i odczynników przed rozpoczęciem pracy. Istotne jest również przygotowanie wystarczającej ilości zlinearyzowanego plazmidu, aby uzyskać wysoką liczbę transformantów przed ekspresją białka indukowaną metanolem. Należy pamiętać o dokładnym przemyciu pelletu komórkowego, aby usunąć wszelkie pozostałości glicerolu, który może hamować ekspresję białka.To już wszystko. Dziękujemy za obejrzenie filmu i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

expression-recombinant-proteins-methylotrophic-yeast-pichia

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ekspresja białek rekombinowanych w metylotroficznej drożdży Pichia pastoris

Transdukcja białek umożliwia bezpośrednie dostarczanie biologicznie czynnych białek do komórek. W przeciwieństwie do konwencjonalnych metod, takich jak transfekcja DNA czy transdukcja wirusowa, ten nieinwazyjny paradygmat pozwala na wysoce efektywną manipulację komórkową w sposób miareczkowalny, unikając toksyczności komórkowej oraz ryzyka transformacji onkogennej wynikającej z trwałej modyfikacji genetycznej.

Inżynieria białek przenikających przez błony komórkowe

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

Prezentowany tutaj jest ujednolicony opis technik, które mogą być użyte do rozwoju, transformacji, podawania i testowania ekspresji heterologicznego białka probiotycznych drożdży Saccharomyces boulardii.

Przemiana drożdży probiotycznych i ich odzyskiwanie z tkanek odpornościowych przewodu pokarmowego po zgłębniku doustnym u myszy

Laboratoryjna produkcja białek eukariotycznych z odpowiednią modyfikacją potranslacyjną stanowi istotną barierę. Oto solidny protokół z szybkim ustanowieniem i przekształceniem w ekspresję białek przy użyciu systemu ekspresji ssaków. System ten wspomaga selektywne znakowanie aminokwasów, selektywne znakowanie białek i małocząsteczkowych modulatorów składu glikanów.

Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

Nielityczne systemy ekspresji komórek owadów są niedostatecznie wykorzystywane do produkcji, transportu/lokalizacji komórkowej i analizy funkcjonalnej białek rekombinowanych. W tym miejscu opisujemy metody generowania wektorów ekspresyjnych i późniejszej przejściowej ekspresji białek w dostępnych na rynku liniach komórkowych lepidoptera. Przedstawiono również kolokalizację akwaporyn Bemisia tabaci z subkomórkowymi białkami markerowymi fluorescencyjnymi.

Przejściowa ekspresja i lokalizacja komórkowa rekombinowanych białek w hodowanych komórkach owadów

Analizy biochemiczne i strukturalne glikozylowanych białek wymagają stosunkowo dużej ilości jednorodnych próbek. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę chemiczną specyficznej dla miejsca glikozylacji rekombinowanych białek oczyszczonych z bakterii poprzez celowanie w reaktywne tiole Cys.

Ukierunkowanie tioli cysteinowych na glikozylację białek rekombinowanych in vitro specyficzną dla miejsca

Ta metoda po raz pierwszy opisuje wiarygodne procedury eksperymentalne dla efektywnej produkcji indukowalnego, wolnego od metanolu rekombinowanego białka w Pichia pastoris (Komagataella phaffii), wykorzystując regulowane przez źródło węgla promotory PDCi PDF w eksperymentach na małą skalę, podczas gdy parametry uprawy mogą być monitorowane online, a stała dawka glicerolu jest stosowana.

Ekspresja niezależna od metanolu przez Pichia Pastoris wykorzystująca technologie derepresji

System wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS) to solidna platforma do badania ekspresji i produkcji białkowych metylotransferaz argininowych (PRMT) do wykorzystania w badaniach biochemicznych, biofizycznych i strukturalnych. Miligramowe ilości materiału mogą być produkowane dla większości PRMT i innych białek będących przedmiotem zainteresowania, wymagających eukariotycznej platformy ekspresyjnej.

Produkcja rekombinowanych białek PRMT przy użyciu systemu wektorów ekspresyjnych bakulowirusa

Optogenetyczna kontrola metabolizmu mikrobiologicznego oferuje elastyczną dynamiczną kontrolę nad procesami fermentacji. Niniejszy protokół pokazuje, jak skonfigurować fermentację regulowaną niebieskim światłem do produkcji chemicznej i białkowej w różnych skalach objętościowych.

Fermentacja kontrolowana światłem do produkcji mikrobiologicznej, chemicznej i białkowej

Ten protokół opisuje podstawowe kroki do przeprowadzenia kampanii selekcji powierzchni drożdży w celu wzbogacenia wariantów białek wiążących się z interesującym nas antygenem.

Inżynieria białkowa za pomocą wyświetlacza powierzchni drożdży

Poznaj metodę ekspresji białek rekombinowanych w drożdżach Pichia pastoris. Protokół obejmuje przygotowanie komórek elektrokompetentnych, transformację wektora, izolację DNA oraz analizę Western blot.

Ekspresja białek rekombinowanych w metylotropowych drożdżach Pichia pastoris

Przeglądaj więcej filmów