Ekspresja białek rekombinowanych w metylotropowych drożdżach Pichia pastoris

Poniższy protokół opisuje ekspresję białek z wykorzystaniem drożdży methyl atrophic yeast opus. Przedstawiono przygotowanie elektrokompetentnych komórek drożdży oraz transformację wektora z genem zainteresowania do PPAs, a następnie etap oczyszczania DNA drożdży w celu sprawdzenia prawidłowej integracji genu zainteresowania z genomem drożdży. Na koniec przeprowadzimy ekspresję białka rekombinowanego.

Cześć, jestem Maria z laboratorium Stevena Hallama z Departamentu Mikrobiologii i Immunologii na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej. Jestem Marcus, również z laboratorium Helm. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę ekspresji białek rekombinowanych w drożdżach TRO PQ.Past stories.

Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania białek z nieopisanych mikroorganizmów, w przypadku których wyekstrahowano i zarchiwizowano środowiskowe DNA oraz biblioteki meta-genomowe. Zatem zacznijmy. Ekspresja białek rekombinowanych w troficznych drożdżach *Pichia pastoris* wymaga sklonowania genu zainteresowania w ramce odczytu w wektorze PPA.

W naszym doświadczeniu wykorzystujemy wektor PPIC Z alpha A. Wektor ten zawiera promotor AO X one w celu ściśle regulowanej, indukowanej metanolem ekspresji interesującego genu, sygnał sekrecyjny czynnika alfa dla sekrecji rekombinowanego białka, gen oporności zaas do selekcji zarówno w e coli, jak i pic, a także peptyd C-końcowy zawierający epitop acemic oraz znacznik polihistydynowy do detekcji i oczyszczania rekombinowanego białka. Przed transformacją należy zlinearyzować wektor zawierający interesujący gen za pomocą trawienia restrykcyjnego. Stosujemy enzym PME one, lecz możliwe jest użycie innych miejsc restrykcyjnych, o ile wstawka nie zawiera danego miejsca restrykcyjnego.

Aby uzyskać wystarczającą ilość zlinearyzowanego DNA wektora, należy przygotować od trzech do czterech reakcji trawienia restrykcyjnego o objętości 50 µL w oddzielnych probówkach; po trawieniu połączyć wszystkie roztwory i zagęstzić konstrukt. Używając jednostek filtracyjnych do wirowania AmCon oraz MicroCon, należy przygotować od 5 do 20 µg zlinearyzowanego DNA w 5–10 µL sterylnej wody do transformacji do PPA dous. Aby przygotować elektrokopotentne PPA dous, na cztery dni przed planowaną transformacją należy wysiać komórki na płytki A-Y-P-D-S bez SN, a następnie inkubować w temperaturze 30 °C przez jeden do dwóch dni lub do momentu pojawienia się pojedynczych kolonii na dwa dni przed transformacją.

Wyhoduj 5 ml szczepu PPA lub innego szczepu w podłożu YPD w probówce Falcon o pojemności 50 ml w temperaturze 30 °C przez noc. Dzień przed transformacją umieść probówkę Falcon w kolbie, aby przymocować ją w inkubatorze wytrząsowym. Użyj 0,25 ml nocnej kultury do zaszczepienia 500 ml świeżego podłoża YPD w kolbie o pojemności 2 l.

Ponownie hoduj przez noc w inkubatorze wytrząsowym w temperaturze 30 °C do uzyskania OD 600 na poziomie 1,3–1,5. W dniu transformacji przygotuj lód, zimną, sterylną wodę oraz sorbitol 1 M. Wirowarkuj komórki przy 1500 Gs przez pięć minut w temperaturze 4 °C.

Po wirowaniu zawiesamy osad w 500 mililitrach lodowatej, sterylnej wody. W zależności od pojemności probówek do wirowania, może być konieczne rozdzielenie objętości do dwóch oddzielnych probówek lub przeprowadzenie kilku cykli wirowania. Ponownie odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w 250 mililitrach lodowatej, sterylnej wody.

W zależności od pojemności probówek wirówki można połączyć oddzielne osady komórkowe w jednej probówce. Po wirowaniu należy ponownie resuspender osad komórkowy. Przenieś resuspenderte komórki do probówki typu Falcon o pojemności 50 ml w 20 ml lodowatego, jednomolarnego sorbitolu i odwiruj.

Po końcowym wirowaniu resuspenduj osad w jednym mililitrze lodowatego, jednomolarnego sorbitolu do końcowej objętości około 1,5 mililitra. Komórki po resuspensji w probówkach do mikrocentryfugi przechowuj na lodzie lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu ich użycia do transformacji. Przed transformacją skoncentrowanego, zlinearyzowanego konstruktu do komórek PPA przygotuj następujące odczynniki i urządzenia.

Napełnić probówkę do mikrocentryfugi jednym mililitrem jednomolarnego sorbitolu i umieścić ją na lodzie. Umieścić kubek do elektroporacji o rozmiarze 0,2 centymetra na lodzie.

Oznacz sterylną szklaną probówkę o pojemności 15 ml i przygotuj sterylną pipetę szklaną. Przenieś 80 µl wcześniej przygotowanych komórek elektrokompetentnych do schłodzonej na lodzie kuwety do elektroporacji o szczelinie 0,2 cm.

Dodaj roztwór plazmidowego DNA do komórek i wymieszaj, poruszając końcówką pipety z boku na bok. W cuwecie do elektroporacji. Inkubuj cuwetę z komórkami w lodzie przez pięć minut.

Następnie przetrzyj zewnętrzną stronę cuwety chusteczką i poddaj komórki impulsom zgodnie z parametrami dla drożdży pączkujących sugerowanymi przez producenta konkretnego urządzenia do elektroporacji. W tej demonstracji wykorzystano urządzenie BioRad gene Pulser z następującymi warunkami: napięcie ładowania 1500 V, pojemność 25 µF oraz rezystancja 200 Ω bezpośrednio po impulsie.

Dodaj jeden mililitr lodowatego, jednomolowego sorbitolu do probówki. Przenieś zawartość probówki do sterylnej probówki 15 ml za pomocą sterylnej pipety szklanej. Inkubuj probówkę w temperaturze 30 °C bez wytrząsania przez 1,5 godziny.

Po 1,5 godziny elektroporowane komórki są gotowe do wysiewania. Do każdej z czterech opisanych płytek YPTS zawierających 100 µg/mL Zain dodaj od pięciu do 10 sterylnych szklanych kulek. Rozsmaruj 250 µL mieszaniny po elektroporacji.

Wymieszaj zawartość na każdej płytce i potrząśnij płytką w poziomie, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Pozostaw płytki do wyschnięcia na 15 minut, a następnie usuń kuleczki z agro poprzez odwrócenie płytek. Zawiń płytki w czarną folię plastikową, aby zapobiec degradacji światłoczułego Zain, i inkubuj płytki odwrócone do góry dnem przez dwa do trzech dni w temperaturze 30 °C aż do momentu powstania kolonii.

Wybierz 12 kolonii. Oczyść je poprzez wyseianie klonów na świeże płytki YPDS zawierające 100 µg/mL zeiny. Aby przygotować komórki PPA do ekspresji białka, wybierz pojedynczą kolonię z oczyszczonych kolonii pichia i zaszczep w 25 ml podłoża VMGY w sterylnym kolbie o pojemności 250 ml; hoduj w temperaturze 30 °C w inkubatorze z wytrząsaniem, aż kultura osiągnie OD 600 od dwóch do sześciu.

Gdy komórki osiągną odpowiednią wartość OD 600, przygotuj bank glikolu komórkowego do przechowywania. Przenieś 800 µL kultury komórkowej do dwóchmililitrowej probówki kriogenicznej i dodaj 200 µL sterylizowanego glicerolu. Przechowuj bank glikolu w temperaturze -80 °C.

Dodatkowo przenieś 1,5 mililitra hodowli komórkowej do probówki do mikrocentryfugi. Zbierz komórki, wirując próbkę przy 1300 GS przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Przechowuj osad w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Komórki te zostaną wykorzystane do puryfikacji DNA drożdży w celu analizy pichia po PCR z zastosowaniem starterów specyficznych dla insertu na żelu agarozowym, aby potwierdzić, że gen zainteresowania został zintegrowany z genomem pichia. Przenieś pozostałą część 25 mililitrów hodowli do 50 mililitrowej probówki typu Falcon i zbierz komórki, odwirugując je przy 3000 Gs przez pięć minut w temperaturze pokojowej, odlej supernatant i ustaw probówkę do góry dnem na chusteczce, aby usunąć pozostałości pożywki. Aby wypłukać osad komórkowy, resuspenduj go poprzez vortexowanie lub pipetowanie w 20 mililitrach pożywki BMMY, a następnie odwiruguj.

Po zlaniu nadsączu z zawiesiny komórkowej, ponownie zawiesić osad komórkowy poprzez wortexowanie lub pipetowanie w górę i w dół w pożywce BMMY do uzyskania OD 600 równej 1,0. Jest to pożywka służąca do indukcji ekspresji. Przenieść kulturę do litrowej kolby z przegrodami i zabezpieczyć kolbę zlewką o pojemności 200 ml.

Zdecydowanie zalecamy stosowanie kolb z przegrodami, ponieważ zapewniają one lepsze natlenienie hodowli. W celu wydajnej ekspresji białka podczas indukcji metanolem, inkubuj kolbę w inkubatorze, aby kontynuować wzrost w temperaturze 30 °C. Jest to istotne, aby temperatura nie przekroczyła 30 °C, jeśli temperatura w Twoim inkubatorze ulega wahaniom.

Ustaw temperaturę na 28 °C. Co 24 godziny dodawaj sterylizowany czysty metanol do uzyskania końcowego stężenia 0,5%metanolu, aby utrzymać indukcję. W określonych punktach czasowych po rozpoczęciu ekspresji przenieś jeden mililitr hodowli do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra i wiruj przy 1300 Gs przez 2,5 minuty. W temperaturze pokojowej przenieś supernatant do oddzielnej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra.

Przechowywać nadnadkład i pellety komórkowe w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszej analizy. Próbki z różnych punktów czasowych zostaną przeanalizowane w celu ustalenia optymalnego okresu ekspresji białek po indukcji. Przedstawiamy teraz reprezentatywne wyniki pomyślnej ekspresji białek rekombinowanych przy użyciu PIA Pastis jako systemu gospodarza.

Ten obraz western blot przedstawia cztery ekspresowane białka po 24 godzinach ekspresji. Przeciwciałem zastosowanym do immunoblottingu było przeciwciało acemic HRP. Druga ścieżka stanowi kontrolę negatywną i została załadowana supernatantem z komórek, które nie wykazują ekspresji białka rekombinowanego, ponieważ zostały one transformowane wektorem macierzystym.

Właśnie zaprezentowaliśmy sposób ekspresji białek rekombinowanych z wykorzystaniem eukariotycznego gospodarza PQ.Plus. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest zsekwencjonowanie konstruktu w celu potwierdzenia, że gen docelowy został sklonowany w odpowiedniej ramce odczytu, a także przygotowanie wszystkich szalek i odczynników przed rozpoczęciem pracy. Istotne jest również przygotowanie wystarczającej ilości zlinearyzowanego plazmidu, aby uzyskać wysoką liczbę transformantów przed ekspresją białka indukowaną metanolem. Należy pamiętać o dokładnym przemyciu pelletu komórkowego, aby usunąć wszelkie pozostałości glicerolu, który może hamować ekspresję białka.

To już wszystko. Dziękujemy za obejrzenie filmu i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.