Name: Ekspresja białek rekombinowanych w drożdżach metylotroficznych Pichia pastoris (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-25T16:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Poznaj metodę ekspresji białek rekombinowanych w drożdżach Pichia pastoris. Protokół obejmuje przygotowanie komórek elektrokompetentnych, transformację wektora, izolację DNA oraz analizę Western blot.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować Canadian Foundation for Innovation, British Columbia Knowledge Development Fund oraz Canadian Institutes of Health Research (CIHR) za wsparcie niniejszej pracy. M.T otrzymał wsparcie w ramach stypendium z Centre for Microbial Diversity and Evolution (CMDE), finansowanego przez fundację TULA.

<ol><li>Cereghino, G. P., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+yeast+in+biotechnology%3A+protein+production+and+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).</li>
<li>Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pichia+pastoris+as+a+Host+System+for+Transformations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pichia pastoris as a Host System for Transformations.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).</li>
<li>Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Pichia pastoris.</a> Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).</li>
<li>Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+in+fermenter+cultures+of+the+yeast+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris.</a> Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).</li>
</ol>

W niniejszym protokole opisano ekspresję białek z wykorzystaniem metylotroficznych drożdży Pichia pastoris jako systemu gospodarza. W zależności od zastosowanego wektora klonującego białko może być wydzielane do pożywki. Sekrecja białka rekombinowanego ułatwia jego późniejsze oczyszczanie. Przedstawione jednak warunki mogą wymagać optymalizacji w przypadku ekspresji różnych białek, a zmiany w warunkach i czasie ekspresji mogą prowadzić do zwiększenia poziomu białka. Wektor użyty w tym protokole posiada epitop <e...

ekspresja białek rekombinowanych w metylotropowych drożdżach pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Ekspresja białek w mikrobowym eukariotycznym gospodarzu Pichia pastoris umożliwia uzyskanie dużych ilości białka rekombinowanego w szybkim i łatwym w użyciu systemie ekspresyjnym.
Jako jednokomórkowy mikroorganizm P. pastoris jest łatwy w manipulacji i szybko rośnie na tanich pożywkach, osiągając wysoką gęstość komórek. Będąc organizmem eukariotycznym, P. pastoris jest zdolny do przeprowadzania wielu modyfikacji potranslacyjnych typowych dla komórek wyższych eukariotów, a otrzymane białka rekombinowane podlegają fałdowaniu białek, przetwarzaniu proteolitycznemu, tworzeniu mostków dwusiarczkowych oraz glikozylacji [1].
Jako drożdże metylotroficzne P. pastoris są zdolne do metabolizowania metanolu jako jedynego źródła węgla. Silny promotor oksydazy alkoholowej, AOX1, jest ściśle regulowany i indukowany przez metanol, a wykorzystuje się go do ekspresji genu docelowego. W związku z tym ekspresję obcego białka można indukować poprzez dodanie metanolu do pożywki wzrostowej [2; 3].
Kolejną istotną zaletą jest sekrecja białka rekombinowanego do pożywki hodowlanej, z wykorzystaniem sekwencji sygnałowej w celu skierowania obcego białka do szlaku sekrecyjnego P. pastoris. Dzięki temu, że drożdże wydzielają do pożywki jedynie niewielkie ilości białek endogennych, a do pożywki nie dodawano żadnych białek, białko heterologiczne stanowi większość całkowitej ilości białka w pożywce, co ułatwia kolejne etapy oczyszczania białka [3; 4].
Wektor użyty w tej procedurze (pPICZαA) zawiera promotor AOX1 umożliwiający ściśle regulowaną, indukowaną metanolem ekspresję genu zainteresowania; sygnał sekrecyjny czynnika α służący do sekrecji białka rekombinowanego, gen oporności na Zeocyn do selekcji zarówno w E. coli, jak i Pichia oraz peptyd C-końcowy zawierający epitop c-myc i znacznik polihistydynowy (6xHis) do detekcji i oczyszczania białka rekombinowanego. Przedstawiamy również analizę western blot białka rekombinowanego z użyciem specyficznego przeciwciała Anti-myc-HRP rozpoznającego epitop c-myc w wektorze macierzystym.

Protokół opisuje ekspresję białek z wykorzystaniem drożdży metylotroficznych Pichia pastoris. Przeprowadzono również przygotowanie elektrokompetentnych komórek drożdży, transformację wektora z genem zainteresowania do P. pastoris oraz oczyszczanie DNA drożdży. Ostatnie etapy tego protokołu ekspresji białek stanowią analiza Western blot oraz oczyszczanie białek.

Ekspresja białek rekombinowanych w metylotropowych drożdżach Pichia pastoris

Ekspresja białek w mikrobowym gospodarzu eukariotycznym Pichia pastoris umożliwia uzyskanie dużych ilości białka rekombinowanego w szybki i...

Poniższy protokół opisuje ekspresję białek z wykorzystaniem drożdży methyl atrophic yeast opus. Przedstawiono przygotowanie elektrokompetentnych komórek drożdży oraz transformację wektora z genem zainteresowania do PPAs, a następnie etap oczyszczania DNA drożdży w celu sprawdzenia prawidłowej integracji genu zainteresowania z genomem drożdży. Na koniec przeprowadzimy ekspresję białka rekombinowanego.Cześć, jestem Maria z laboratorium Stevena Hallama z Departamentu Mikrobiologii i Immunologii na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej. Jestem Marcus, również z laboratorium Helm. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę ekspresji białek rekombinowanych w drożdżach TRO PQ.Past stories.Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania białek z nieopisanych mikroorganizmów, w przypadku których wyekstrahowano i zarchiwizowano środowiskowe DNA oraz biblioteki meta-genomowe. Zatem zacznijmy. Ekspresja białek rekombinowanych w troficznych drożdżach *Pichia pastoris* wymaga sklonowania genu zainteresowania w ramce odczytu w wektorze PPA.W naszym doświadczeniu wykorzystujemy wektor PPIC Z alpha A. Wektor ten zawiera promotor AO X one w celu ściśle regulowanej, indukowanej metanolem ekspresji interes

expression-recombinant-proteins-methylotrophic-yeast-pichia

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ekspresja białek rekombinowanych w metylotroficznej drożdży Pichia pastoris

Transdukcja białek umożliwia bezpośrednie dostarczanie biologicznie czynnych białek do komórek. W przeciwieństwie do konwencjonalnych metod, takich jak transfekcja DNA czy transdukcja wirusowa, ten nieinwazyjny paradygmat pozwala na wysoce efektywną manipulację komórkową w sposób miareczkowalny, unikając toksyczności komórkowej oraz ryzyka transformacji onkogennej wynikającej z trwałej modyfikacji genetycznej.

Inżynieria białek przenikających przez błony komórkowe

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

Domeny palców cynkowych są z natury przepuszczalne dla komórek i zdolne do pośredniczenia w dostarczaniu białek do szerokiego zakresu typów komórek ssaków. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku wdrażania technologii palca cynkowego do wewnątrzkomórkowego dostarczania białka.

Bezpośrednie dostarczanie białek do komórek ssaków za pomocą przepuszczalnych dla komórek domen Cys2-his 2 palców cynkowych

Prezentowany tutaj jest ujednolicony opis technik, które mogą być użyte do rozwoju, transformacji, podawania i testowania ekspresji heterologicznego białka probiotycznych drożdży Saccharomyces boulardii.

Przemiana drożdży probiotycznych i ich odzyskiwanie z tkanek odpornościowych przewodu pokarmowego po zgłębniku doustnym u myszy

Laboratoryjna produkcja białek eukariotycznych z odpowiednią modyfikacją potranslacyjną stanowi istotną barierę. Oto solidny protokół z szybkim ustanowieniem i przekształceniem w ekspresję białek przy użyciu systemu ekspresji ssaków. System ten wspomaga selektywne znakowanie aminokwasów, selektywne znakowanie białek i małocząsteczkowych modulatorów składu glikanów.

Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

Nielityczne systemy ekspresji komórek owadów są niedostatecznie wykorzystywane do produkcji, transportu/lokalizacji komórkowej i analizy funkcjonalnej białek rekombinowanych. W tym miejscu opisujemy metody generowania wektorów ekspresyjnych i późniejszej przejściowej ekspresji białek w dostępnych na rynku liniach komórkowych lepidoptera. Przedstawiono również kolokalizację akwaporyn Bemisia tabaci z subkomórkowymi białkami markerowymi fluorescencyjnymi.

Przejściowa ekspresja i lokalizacja komórkowa rekombinowanych białek w hodowanych komórkach owadów

Analizy biochemiczne i strukturalne glikozylowanych białek wymagają stosunkowo dużej ilości jednorodnych próbek. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę chemiczną specyficznej dla miejsca glikozylacji rekombinowanych białek oczyszczonych z bakterii poprzez celowanie w reaktywne tiole Cys.

Ukierunkowanie tioli cysteinowych na glikozylację białek rekombinowanych in vitro specyficzną dla miejsca

Ta metoda po raz pierwszy opisuje wiarygodne procedury eksperymentalne dla efektywnej produkcji indukowalnego, wolnego od metanolu rekombinowanego białka w Pichia pastoris (Komagataella phaffii), wykorzystując regulowane przez źródło węgla promotory PDCi PDF w eksperymentach na małą skalę, podczas gdy parametry uprawy mogą być monitorowane online, a stała dawka glicerolu jest stosowana.

Ekspresja niezależna od metanolu przez Pichia Pastoris wykorzystująca technologie derepresji

System wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS) to solidna platforma do badania ekspresji i produkcji białkowych metylotransferaz argininowych (PRMT) do wykorzystania w badaniach biochemicznych, biofizycznych i strukturalnych. Miligramowe ilości materiału mogą być produkowane dla większości PRMT i innych białek będących przedmiotem zainteresowania, wymagających eukariotycznej platformy ekspresyjnej.

Produkcja rekombinowanych białek PRMT przy użyciu systemu wektorów ekspresyjnych bakulowirusa

Ten protokół opisuje podstawowe kroki do przeprowadzenia kampanii selekcji powierzchni drożdży w celu wzbogacenia wariantów białek wiążących się z interesującym nas antygenem.

Inżynieria białkowa za pomocą wyświetlacza powierzchni drożdży

Poznaj metodę ekspresji białek rekombinowanych w drożdżach Pichia pastoris. Protokół obejmuje przygotowanie komórek elektrokompetentnych, transformację wektora, izolację DNA oraz analizę Western blot.

Ekspresja białek rekombinowanych w metylotropowych drożdżach Pichia pastoris

Przeglądaj więcej filmów