Zapłodnienie oocytów Xenopus metodą transferu do gospodarza

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie rozwijających się embrionów pochodzących z miejsc oocytów, które zostały poddane manipulacjom w hodowli. Osiąga się to poprzez wstępną izolację miejsc oocytów dawcy od jednej samicy i poddanie ich pożądanym manipulacjom w warunkach hodowli. Drugim krokiem procedury jest stymulacja dojrzewania tych komórek za pomocą progesteronu oraz wstrzyknięcie gonadotropiny potencjalnym samicom biorcom w celu stymulacji składania jaj.

Trzecim krokiem procedury jest barwienie cytów dawcy barwnikami witalnymi oraz przygotowanie samicy, która będzie pełnić rolę gospodarza. Ostatnim etapem procedury jest chirurgiczne przeniesienie cytów dawcy do jamy ciała gospodarza, a następnie, po kilku godzinach, odzyskanie i zapłodnienie przeniesionych jaj. W rezultacie otrzymuje się normalnie dzielące się embriony pochodzące od eksperymentalnie manipulowanego dawcy.

Zarodki można pozyskiwać i analizować w taki sam sposób jak normalne embriony. Dzień dobry, nazywam się Doug Houston z University of Iowa. Jesteśmy dziś na kursie Xap w Cold Spring Harbor, aby pokazać Państwu, jak przeprowadzić procedurę transferu do gospodarza.

W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania roli produktów genów matczynych oraz określania ich funkcji we wczesnym rozwoju zap. Przejdźmy zatem do działania. Przed rozpoczęciem zabiegu należy upewnić się, że obszar operacyjny został zdezynfekowany, a świeże pożywki i sterylne narzędzia są przygotowane.

Chwyć igłę chirurgiczną w igłotrzymaczu w pożądanej orientacji. Umieść znieczuloną samicę żaby na grzbiecie na wilgotnej chuście chirurgicznej. Za pomocą małych nożyczek irydowych wykonaj jedno centymetrowe nacięcie skóry w dolnej części brzucha, bocznie od linii środkowej.

Należy unikać przecięcia mięśnia brzusznego. Za pomocą pęsety należy unieść warstwę mięśniową i otaczającą ją białą powięź. Następnie, używając nożyczek irydowych, należy wykonać jedno szybkie cięcie pionowo w dół przez mięsień.

Przedłuż nacięcie do jednego centymetra, odsłaniając jajnik. Za pomocą pęsety chwyć jajnik i wyciągnij jeden z jego płatów. Użyj nożyczek, aby odciąć płat na poziomie ściany ciała.

Umieść tkankę w szalce o średnicy 90 mm zawierającej pożywkę do hodowli oocytów (OCM) i natychmiast oceń jakość jajnika pod mikroskopem stereoskopowym. Kilka oocytów można oddzielić za pomocą pęsety. Jeśli oocyty są jędrne, mają jednolity rozmiar i zabarwienie, pobierz żądaną ilość tkanki jajnika żaby i umieść ją w szalce Petriego o średnicy 90 mm z OCM.

Zamknij nacięcie. Wprowadź igłę kilka milimetrów bocznie od nacięcia, upewniając się, że przechodzi ona zarówno przez mięsień, jak i powięź. Użyj pęsety do manipulowania igłą, dbając o to, aby nie wyciągnąć końcówki nici całkowicie.

Zamknij ranę, stosując szew pojedynczy przerywany i chirurgiczne węzły kwadratowe. Technika ta została szczegółowo opisana w towarzyszącym tekście. Powtórz szycie w warstwie skóry.

Opłucz samicę wodą dejonizowaną i umieść ją w pojemniku regeneracyjnym wypełnionym chłodną wodą. Natychmiast po zakończeniu operacji użyj nożyczek, aby podzielić jajnik. Rozetnij poszczególne płaty, rozpłaszcz je i potnij na kawałki o wymiarach dwóch centymetrów kwadratowych.

Przepłukać w czystym medium, używając pincety. Przenieść od pięciu do sześciu fragmentów do nowej szalki 90 mm z OCM, aby wyizolować pojedyncze cyty. Rozpocząć od przeniesienia jednego z fragmentów do małej szalki z medium i umieścić pod mikroskopem sekcyjnym.

Za pomocą pęsety zegarmistrzowskiej ręcznie wyizoluj od 3 do 500 oocytów. Drugą pęsetą chwyć warstwę tkanki łącznej otaczającą w pełni rozwinięty oocyt w szóstym stadium w pobliżu zapasu. Pierwszą pęsetą chwyć jajnik sąsiadujący z oocytem.

Lekko pociągnij w poprzek oocytu, aby przerwać warstwę pęcherzyka. Delikatnie wyizoluj oocyt z tkanki. Oocyty pozbawione pęcherzyków nie mają widocznych naczyń krwionośnych i są bardziej wiotkie niż oocyty z nienaruszonymi pęcherzykami.

Używając wypalanej pipety z watowym korkiem, przenieś grupy od 100 do 150 oocytów do 60-milimetrowych naczyń hodowlanych zawierających 8 mL OCM. Przechowuj oocyty w naczyniach w temperaturze 18 °C. Oocyty można teraz mikroiniekować zgodnie z potrzebą antysensownymi oligonukleotydami lub mRNA według dowolnego z dostępnych protokołów, a następnie hodować w OCM w inkubatorze w temperaturze 18 °C.

Oocyty należy wykorzystać do transferu w ciągu 96 godzin od izolacji, w wieczór poprzedzający przeprowadzenie transferu. Niezbędne oocyty należy inkubować z progesteronem w celu ich dojrzewania, dodając 16 µL 1 mM progesteronu do medium zawierającego komórki, aby uzyskać stężenie końcowe 2 µM. Inkubować przez 10 do 12 godzin w temperaturze 18 °C tego samego wieczoru, a następnie wstrzyknąć trzem do pięciu samicom 1000 jednostek ludzkiej gonadotropiny kosmórkowej na żabę, aby wywołać składanie jaj.

W dniu transferu, rano, pozostaw samice w temperaturze pokojowej lub 18 °C na całą noc. Sprawdź pod mikroskopem stereoskopowym, czy hodowane oocyty uległy dojrzewaniu. Dodaj barwniki witalne i wiruj z prędkością powyżej 10 000 G przez pięć minut.

Aby zmniejszyć tło spowodowane zanieczyszczeniami, dodaj 80 µL odpowiedniego barwnika witalnego do każdej grupy doświadczalnej oocytów. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut na kołysarce. Przenieś zabarwione komórki jajowe do 90 mm szalki ze świeżym o cm i delikatnie zamieszaj w celu ich przemycia.

Wykonaj pipetę do transferu cytów. Użyj rysika diamentowego, aby naciąć pipetę około dwóch centymetrów poniżej części zwężonej, a następnie przełam ją czysto. Powinno to stworzyć pipetę o średnicy otworu 1,5 mm, wystarczająco dużej, aby pomieścić oocyt.

Wygładzić końcówkę, aż krawędzie będą gładkie, uważając, aby nie zamknąć otworu. Transplantacja oocytów. Operację należy przeprowadzić tak szybko, jak to możliwe.

Wykonaj nacięcie, jak wcześniej, u znieczulonej samicy znoszącej jaja dobrej jakości. Nacięcie to powinno mieć minimalną długość, niezbędną do zmieszczenia otworu transferowego. Pipetuj mniej niż jeden centymetr.

Zawirować naczynie z oocytami eksperymentalnymi, aby zebrać je w centrum naczynia. Za pomocą przygotowanej pipety pasterskiej odessać jak największą liczbę komórek. Pozostawić oocyty do osadzenia się na końcu pipety, aby zminimalizować ilość cieczy przenoszonej do żaby.

Za pomocą pęsety chwyć i unieś jedną płat mięśnia i powięzi. Wprowadź końcówkę pipety do nacięcia i powoli pozwól oocytom spłynąć do jamy ciała. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie oocyty zostaną przeniesione.

Nie zwalniaj warstwy mięśniowej, aby zapobiec wypadnięciu oocytów przez nacięcie. Za pomocą pęsety chwyć oba brzegi nacięcia i zbliż je do siebie, pozwalając komórkom opaść do jamy ciała. Rozpocznij szycie warstwy mięśniowej i powięzi w ten sam sposób co wcześniej, dbając o zachowanie napięcia skierowanego w górę aż do zawiązania pierwszego węzła.

Zszyj skórę. Przepłucz żabę wodą dejonizowaną i pozwól jej dojść do siebie w taki sam sposób jak wcześniej. Żaba powinna zacząć składać jaja w sposób prawidłowy od dwóch do trzech godzin po operacji.

Zabierać jaja poprzez zwykłe wyciskanie co pół godziny, aż samica przestanie składać jaja, do naczynia z zebranym materiałem. Dodać 4 mL zawiesiny świeżo pobranego nasienia w pożywce 1X MMR i inkubować w temperaturze pokojowej przez 4 minuty. Obficie zalać i wypłukać jaja w temperaturze pokojowej.

Punkt pierwszy: XMMR inkubowano w temperaturze pokojowej, aby umożliwić aktywację i rozszczepienie. W dowolnym momencie można użyć cysteiny w celu usunięcia otoczki galaretowatej. Przeniesione embriony można następnie posegregować do osobnych naczyń w zależności od koloru i hodować jak normalne embriony.

Zazwyczaj ponad dwie trzecie przeniesionych jaj aktywuje się w ciągu kilku minut od zapłodnienia, wykazując silny skurcz kory w obrębie bieguna zwierzęcego. W większości eksperymentów ponad połowa przeniesionych jaj przechodzi prawidłowy pierwszy podział. Czasami podział ten jest opóźniony o około 20 minut w stosunku do jaj gospodarza w naszych badaniach.

Od 30 do 60% przeniesionych embrionów prawidłowo przechodzi w stadium gastruli i przetrwa etap neuralny. Przeniesione embriony zachowają kolor barwnika witalnego przez wiele dni rozwoju. Embriony pochodzące z nieiniekcyjnych oocytów kontrolnych będą wyglądać prawidłowo, zgodnie z oczekiwaniami.

W przeciwieństwie do tego, zarodki pochodzące z oocytów wstrzykniętych na przykład beta-kateniną i oligosami antysensownymi będą miały wygląd scentralizowany. Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak pozyskać zarodki z oocytów manipulowanych w kulturze.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby rozpocząć od zdrowych, w pełni wykształconych oocytów dawcy oraz użyć samic biorców z jajami wysokiej jakości. Ponadto sukces tej metody ma tendencję do korelacji z szybkością izolacji oocytów i przeprowadzania operacji. W związku z tym uzyskanie spójnych wyników może wymagać pewnej wprawy.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.