Name: Zapłodnienie oocytów Xenopus metodą Host Transfer (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj metodę transferu do żywicielki do zapłodnienia oocytów Xenopus w badaniach biologii rozwoju. Technika ta umożliwia uzyskanie zarodków z manipulowanych komórek jajowych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować członkom laboratorium Houston za krytyczne przeczytanie manuskryptu. Badania są wspierane przez National Institutes of Health (GM083999) w ramach grantu przyznanego D.W.H.

1. Chirurgiczne usunięcie tkanki jajnika
<ol class="lalpha">
	<li>Przygotować świeżą partię pożywki do hodowli oocytów (OCM; Materiały), w ilości od 400-800 mL, w zależności od skali eksperymentu. Dostosować pH do wartości 7.6-7.8, aż czerwień fenolowa zmieni kolor na ciemnoczerwony (wymagane jest około sześciu małych kropli 5N NaOH). Odlać niewielką ilość do oddzielnej probówki w celu sprawdzenia pH, ponieważ elektroda do pomiaru pH może zanieczyścić pożywkę. OCM należy przechowywać w temperaturze 18°C i zużyć w ciągu tygodnia.</li>
	<li>Wybrać 3-5 samic i umieścić każdą z nich w ~ 2L buforowego roztworu anestetyka (Materiały). Należy unikać używania żab karmionych w dniu lub w dniu poprzedzającym zabieg chirurgiczny. Podczas gdy żaba ulega działaniu anestetyka, zdezynfekować obszar operacyjny 70% EtOH i przygotować instrumenty chirurgiczne.</li>
	<li>Zesterylizować instrumenty chirurgiczne poprzez 20-sekundowe zanurzenie w gorącym sterylizatorze koralikowym w temperaturze 250°C. Pod ręką powinny znajdować się następujące narzędzia: rękojeść skalpela (#3) i ostrze (#10 lub 11), kilka par pincet Dumont, nożyczki irydowe Bonn (zakrzywione lub proste), mikroigłotrzymacz Halsey lub Olsen-Hegara oraz nici chirurgiczne. Zesterylizowane instrumenty należy umieścić na sterylnej szalce Petriego lub na wewnętrznej stronie opakowania nici, aby zachować ich sterylność. Przed rozpoczęciem chwycić igłę w igłotrzymaczu w pożądanej orientacji. Preferowane są igłotrzymacze Olsen-Hegara, ponieważ ich rękojeść zawiera ostrza nożyczek, które można wykorzystać do przycinania nici bez konieczności zmiany instrumentu.</li>
	<li>Po 10 minutach sprawdzić, czy osiągnięto chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia. Znieczulone żaby przestaną się poruszać i nie będą reagować na uciśnięcie palca u nogi ani na obrócenie. Znieczulenie powinno trwać 15 minut, co jest czasem w zupełności wystarczającym do przeprowadzenia zabiegów. Założyć odpowiednią odzież chirurgiczną. W zależności od preferencji osobistych i instytucjonalnych wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami, może to obejmować czyste rękawiczki (nietylne), fartuchy laboratoryjne i maseczki chirurgiczne.</li>
	<li>Uwaga dotycząca techniki aseptycznej: wydzieliny skóry żab zawierają peptydy przeciwdrobnoustrojowe, które zazwyczaj zmniejszają częstość występowania zakażeń podczas operacji, niemniej jednak należy w miarę możliwości przestrzegać techniki aseptycznej. Można stosować obłożenia chirurgiczne, choć mogą one nie być wymagane przez instytucjonalne komisje IACUC i mogą nie przynosić dużych korzyści. Zazwyczaj stosuje się tzw. „technikę końcówek” (tip technique), w której dłonie nie dotykają sterylnych końcówek instrumentów, materiału szewnego ani miejsca nacięcia. Instrumenty można ponownie wysterylizować (w sterylizatorze koralikowym) po nacięciu skóry; na blacie należy zachować sterylny obszar do odkładania narzędzi (np. szalkę Petriego lub opakowanie nici). Wymagania instytucjonalne mogą się znacznie różnić, dlatego należy stosować się do wytycznych swojej jednostki i przejść odpowiednie przeszkolenie przed przeprowadzeniem zabiegów.</li>
	<li>Wyjąć żabę z anestetyka i ułożyć ją na plecach na wilgotnej chusteczce chirurgicznej. Uwaga: skórę można oczyścić, płucząc ją w rozcieńczonym jodku powidonu (1:20) lub chlorheksydynie (0.75%). Należy jednak unikać komercyjnych szorówek chirurgicznych, mydeł i 70% alkoholu izopropylowego, ponieważ mogą one uszkodzić delikatną skórę płazów.</li>
	<li>Za pomocą skalpela lub małych nożyczek irydowych wykonać niewielkie (1- 1.5 cm) nacięcie skóry w dolnej części brzucha, bocznie od linii środkowej. Kolejne nacięcia u tej samej żaby powinny być wykonywane naprzemiennie po obu stronach, w znacznej odległości od siebie. Nacięcia można wykonywać równolegle lub prostopadle do linii środkowej.</li>
	<li>Nacięcia skóry i mięśni brzusznych należy wykonać w dwóch etapach. Po przecięciu skóry unieść warstwę mięśniową i otaczającą ją białą powięź pęsetą, a następnie wykonać nacięcie w uniesionym mięśniu. Używając nożyczek, przeciąć tkankę pionowo w dół; należy starać się wykonać jedno szybkie cięcie, aby odsłonić jamę ciała, pozostawiając czyste brzegi rany. Jeśli przecięta zostanie tylko powięź, wciągnie się ona, co utrudni późniejsze szycie. Uniesienie mięśnia pomoże uniknąć przypadkowego uszkodzenia narządów wewnętrznych. Należy również starać się nie przeciąć widocznych serc limfatycznych ani naczyń krwionośnych w warstwach mięśniowych. Za pomocą nożyczek wydłużyć nacięcie tak, aby jajnik można było łatwo wyciągnąć.</li>
	<li>Po wykonaniu nacięcia jajnik powinien być wyraźnie widoczny. Aby pobrać jajnik, chwycić go pęsetą i wysunąć tkankę jajnika na zewnątrz. Należy usunąć pożądaną ilość tkanki, odcinając ją na poziomie ściany ciała. Nie wolno wpychać tkanki z powrotem do jamy coelomicznej, ponieważ może to być źródłem infekcji lub innych powikłań.</li>
	<li>Natychmiast obejrzeć mały fragment jajnika pod mikroskopem stereoskopowym i odfolikulować kilka oocytów, aby sprawdzić ich jakość. Powinny być one twarde, o jednolitym rozmiarze i zabarwieniu. Jeśli są one akceptowalne, pobrać pożądaną ilość tkanki jajnika i zaszyć nacięcie. Dla większości eksperymentów zazwyczaj wystarcza ilość pozwalająca wypełnić szalkę Petriego o średnicy 90 mm. Jeśli jakość oocytów budzi wątpliwości, zaszyć żabę i powtórzyć procedurę u innej samicy.</li>
	<li>Zamknąć nacięcie, szyjąc najpierw warstwę mięśniową i powięź. Wbić igłę kilka milimetrów bocznie od nacięcia, upewniając się, że przechodzi ona również przez warstwę powięzi. Szwy wykonane tylko w mięśniu mogą rozerwać tkankę i rozwiązać się. Użyć pęsety, aby pomóc w wprowadzeniu igły od dołu po przeciwnej stronie nacięcia. Puścić i ponownie chwycić igłę z zewnątrz ciała, a następnie przeciągnąć nić, aż pozostanie około kilku cali końca nici, uważając, aby nie przeciągnąć jej całkowicie.</li>
	<li>Zamknąć ranę, stosując proste szwy przerywane. Do wiązania węzłów chirurgicznych (węzłów płaskich) stosujemy podstawową metodę wiązania instrumentem. Owinąć długi koniec nici wokół igłotrzymacza, chwycić koniec nici i przeciągnąć go przez pętlę w swoją stronę, a następnie zaciągnąć. Powtórzyć pętlę i przeciągnąć nić, tym razem odsuwając igłotrzymacz od siebie. Dla większego bezpieczeństwa można wykonać trzeci splot (w tym samym kierunku co pierwszy). Przyciąć nić, pozostawiając krótki koniec, i wykonać kolejny szew w mięśniu w odległości kilku milimetrów. Dla małych nacięć wystarczają dwa szwy, dla większych trzy. Powtórzyć procedurę dla warstwy skóry. Prezentacje wideo z podstawowej techniki szycia są dostępne na YouTube – należy szukać pod hasłem „instrument tie”; dostępnych jest wiele filmów, choć podstawowa technika jest zawsze taka sama.</li>
	<li>Opłukać samicę wodą dejonizowaną i umieścić ją w pojemniku z chłodną (18°C) wodą w celu rekonwalescencji. W laboratorium żaby są trzymane w wodzie z kranu uzdatnionej Amquelem w celu usunięcia chloramin. Co kilka minut delikatnie unosić żabę z wody i obserwować, czy nie wykonuje ruchów chłapnięcia wodą lub wybrzuszeń oczu, co świadczy o wybudzaniu się z narkozy.</li>
	<li>Uwaga: zabieg chirurgiczny z przeżyciem nie jest ściśle konieczny do pobrania tkanki jajnika, choć samice będą nadal produkować dobre oocyty po kilku operacjach. Wykonywanie zabiegów z przeżyciem pozwoli również ograniczyć liczbę wykorzystywanych zwierząt. Należy bezwzględnie przestrzegać wytycznych jednostki opieki nad zwierzętami w zakresie metod chirurgii z przeżyciem kręgowców, opieki i monitorowania pooperacyjnego oraz dopuszczalnej liczby zabiegów u jednego osobnika.</li>
</ol>
2. Hodowla i defolikulacja oocytów
<ol class="lalpha">
	<li>Bezpośrednio po zakończeniu operacji podziel jajnik na małe fragmenty (~2 cm2) i przechowuj w świeżym OCM, używając 5-6 fragmentów na szalkę 90 mm. Poszczególne płaty jajnika należy rozciąć, rozpłaszczyć i pociąć na kwadratowe kawałki. Następnie należy je wypłukać w czystym OCM i umieścić na szalkach do hodowli. Rozpłaszczenie i podział jajnika przedłuży jego żywotność w hodowli i ułatwi defolikulację.</li>
	<li>Przenieś płat na małą szalkę z OCM i manualnie defolikuluj 300-500 oocytów. Przenoszenie oocytów wykonuj za pomocą sterylnej, wypalanej pipety. Stwierdziliśmy, że stosowanie pipet z watowym korkiem jest niezbędne do zminimalizowania zanieczyszczenia kultur. Przechowuj oocyty w temperaturze 18°C w 8 mL OCM (w szalkach średnich (Falcon 1007)) w grupach po 100-150. Dzięki wprawie powinieneś być w stanie defolikulować odpowiednią liczbę oocytów w ciągu 1-2 godzin. Oocyty traktowane kolagenazą nie nadają się do transferu do biorcy, ponieważ nie ulegają zapłodnieniu.</li>
	<li>Metoda defolikulacji. Defolikulację przeprowadzamy za pomocą pęset zegarmistrzowskich (Dumont #4s lub #5s, Fine Science Tools), stosując podstawowe metody opisane przez Smith et al. (1991). Używając jednej pęsety (w dominującej dłoni), chwyć warstwę tkanki łącznej otoczki w pobliżu miejsca przyczepienia pęcherzyka do jajnika (szypułki) w pełni wykształconego oocytu VI stadium. Drugą pęsetą chwyć jajnik obok pierwszej pęsety. Delikatnie rozerwij warstwę pęcherzyka, ciągnąc w poprzek oocytu. Ostrożnie wydziel oocyt z tkanki. Prawidłowo defolikulowane oocyty są bardziej wiotkie niż oocyty po prostu oderwane bez usunięcia warstwy pęcherzyka i są pozbawione widocznych naczyń krwionośnych.</li>
	<li>Uwaga: Niezbędne jest wywieranie bardzo lekkiego nacisku końcówkami pęsety, ledwie wystarczającego do ich zetknięcia. Zbyt mocny chwyt jest częstym błędem początkujących i skutkuje wyrwaniem oocytu wraz z nienaruszonym pęcherzykiem. Przeznacz dobrą parę pęset wyłącznie do defolikulacji. Końcówki powinny stykać się precyzyjnie i być nieco tępiejsze niż pęsety używane do przygotowywania eksplantów z embrionów Xenopus (Ryc. 1).</li>
	<li>Rutynowo testujemy dojrzałość około 20 oocytów za pomocą progesteronu i przerywamy eksperyment, jeśli wskaźnik dojrzewania jest niski (&lt;50% po 6-7 godzinach w temperaturze pokojowej).</li>
	<li>Na tym etapie oocyty mogą być manipulowane i hodowane według potrzeb, np. poprzez mikroiniekcję oligo, morfolino lub mRNA. Procedury iniekcji różnią się w zależności od laboratorium, dlatego nie będziemy ich tutaj opisywać. Oocyty można utrzymywać w OCM do tygodnia, jednak zazwyczaj ich kondycja pogarsza się, dlatego najlepiej wykorzystać je do transferu w ciągu 96 godzin od izolacji.</li>
	<li>Należy pamiętać, że ze względu na ograniczenia dotyczące barwników witalnych, do jednej samicy można przenieść tylko od pięciu do sześciu grup (łącznie z kontrolą), dlatego należy odpowiednio zaplanować eksperymenty.</li>
</ol>
3. Dojrzewanie oocytów i stymulacja samic przyszłych biorców
<ol class="lalpha">
	<li>W przypadku przeprowadzania ratowania po wyczerpaniu oligosów, wstrzyknij mRNA (zazwyczaj 50-300 pg RNA) około 24-48 godzin po podaniu oligosów. Do tego czasu oligosy powinny ulec degradacji i nie wpływać na wstrzyknięte RNA.</li>
	<li>Wieczorem przed przeprowadzeniem transferu dodaj 16 μL roztworu roboczego progesteronu (1mM w EtOH) do oocytów w 8 mL OCM w naczyniach z medium (końcowe stężenie progesteronu wynosi ~2 μM). Inkubuj przez 10-12 godzin w temperaturze 18°C, aby umożliwić dojrzewanie oocytów.</li>
	<li>Wstrzyknij 3-5 samicom po 1000 jednostek hCG na żabę, aby indukować składanie jaj. Nasze eksperymenty zdają się przebiegać pomyślniej, gdy dojrzewanie oocytów i wstrzyknięcie hCG odbywają się w podobnym czasie, około 12 godzin przed implantacją do biorcy (np. od 22:00 do 10:00). Pozostaw samice w temperaturze pokojowej lub 18°C na noc.</li>
</ol>
4. Przygotowanie i barwienie oocytów barwnikami witalnymi
<ol class="lalpha">
	<li>W dniu transferu zarezerwuj ok. 45-60' na przygotowanie i przeprowadzenie procedury. Na tym etapie dojrzałe oocyty można zamrozić do późniejszej analizy skuteczności wyciszenia mRNA lub ekspresji białka. Należy również sprawdzić, czy oocyty nie zostały zainfekowane oraz czy stopień dojrzewania był zadowalający (&gt;50%). Zainfekowane oocyty nie zostaną zapłodnione. Rozmroź barwniki witalne (Materiały) i wiruj z maksymalną prędkością przez 5 min.</li>
	<li>Oznacz kolorystycznie poszczególne grupy eksperymentalne, dodając 80 μL odpowiedniego barwnika witalnego do szalek z oocytami, a następnie inkubuj z kołysaniem przez 15'. W tym czasie wybierz samicę biorcy i rozpocznij anestezyję. Wybierz żabę, która składa jaja w sposób naturalny i powolny lub taką, która produkuje obficie jaja przy lekkim ucisku. Jaja od biorcy powinny być wysokiej jakości. Unikaj samic składających jaja w formie sznurów lub jaj zmiażdżonych.</li>
	<li>Przenieś zabarwione jaja do dużej szalki ze świeżym OCM, krótko zamieszaj w celu przemycia i odstaw przed transferem.</li>
	<li>Przygotuj sterylną pipetę Pasteura z otworem o średnicy wystarczającej do pomieszczenia oocytu (~ 1.5 mm), która posłuży do transplantacji oocytów. Narysuj linię na pipecie za pomocą rysika diamentowego i przełam ją czysto. Wygładź krawędzie palnikiem, uważając, aby nie stopić otworu.</li>
</ol>
5. Przeprowadzenie transplantacji oocytów
<ol class="lalpha">
	<li>Transplantacja oocytów wykorzystuje te same procedury chirurgiczne, które opisano w części I, jednak zamiast usuwania jajnika, manipulowane oocyty są wprowadzane do jamy ciała za pomocą pipety. Idealnie procedura przeniesienia powinna zostać wykonana tak szybko, jak to możliwe, a rozmiar nacięcia powinien być jak najmniejszy.</li>
	<li>Zanieść samicę biorcę i przygotować narzędzia chirurgiczne zgodnie z opisem w części I. Wykonać nacięcie opisane w części I. Nacięcie może być mniejsze, ale musi być wystarczająco duże, aby zmieścił się w nim otwór pipety transferowej (Rycina 2A).</li>
	<li>Aby przeprowadzić transplantację oocytów, chwycić i unieść jedną warstwę mięśnia i powięzi pęsetą i wprowadzić eksperymentalne oocyty za pomocą wcześniej przygotowanej pipety Pasteura. Zamieszać naczynie z oocytami, aby zebrać je w centrum, i odessać jak najwięcej z nich. Pozwolić oocytom osiąść na końcu pipety, aby zapobiec wprowadzeniu nadmiaru cieczy, następnie włożyć końcówkę pipety do nacięcia i powoli pozwolić oocytom spłynąć do jamy ciała (Rycina 2B). Powtarzać czynność aż do przeniesienia wszystkich oocytów. Nie puszczać warstwy mięśniowej aż do rozpoczęcia szycia, w przeciwnym razie oocyty mogą wypłynąć przez nacięcie.</li>
	<li>Po przeniesieniu oocytów chwycić pęsetą obie strony nacięcia i zbliżyć je do siebie, pozwalając oocytom osiąść w jamie ciała. Rozpocząć szycie zgodnie z opisem, dbając o utrzymanie napięcia mięśnia i powięzi do góry aż do zawiązania pierwszego węzła (Rycina 2C). Zapobiegnie to wypchnięciu oocytów na zewnątrz i pozwoli krawędziom nacięcia na równomierne zagojenie. Dodać kolejny szew w warstwie mięśniowo-powięziowej, a następnie zaszyć skórę.</li>
	<li>Opłukać samicę wodą dejonizowaną i umieścić ją w pojemniku rekonwalescencyjnym wypełnionym schłodzoną (18°C) wodą traktowaną Amquelem. Monitorować wybudzanie z anestezji jak opisano powyżej. Samica powinna zacząć normalnie składać jaja po operacji.</li>
	<li>Pobrać jądra od samca żaby stosując standardowe procedury. Przechowywać jądra w OCM lub L15 do momentu użycia. W eksperymentach dotyczących zapłodnienia po transferze preferujemy świeże jądra.</li>
</ol>
6. Pozyskiwanie oocytów i zapłodnienie in vitro
<ol class="lalpha">
	<li>Rzęski otrzewne przesuną przeniesione jaja (oraz normalne jaja celomiczne gospodarza) do ujść jajowodów w przedniej części jamy ciała. Kolorowe jaja można odzyskać zaczynając od 2-3 godzin po transferze poprzez standardowe wyciskanie. Jaja można pozyskiwać mniej więcej co pół godziny, aż samica przestanie składać jaja.</li>
	<li>Zapłodnić w zawiesinie plemników (w ~ 4 mL 1x MMR) przez 4 minuty. Obficie zalać i wypłukać 0.1x MMR. Jaja powinny aktywować się normalnie i zacząć się dzielić ~ 1,5-2 h po zapłodnieniu. Przeniesione jaja często dzielą się nieco później niż jaja gospodarza.</li>
	<li>Usunąć otoczki galaretowate za pomocą cysteiny w sposób standardowy i posegregować embriony do osobnych naczyń. Można to zrobić na dowolnym etapie, w zależności od potrzeb eksperymentu. Zazwyczaj najłatwiej jest zidentyfikować poszczególne kolory w okolicach stadium 4 komórek, a najtrudniej w późnych stadiach blastuli. Hodować jaja przy niskiej gęstości (&lt; 50 na szalkę Petriego) w czystym 0.1x MMR. Od tego momentu embriony można traktować i manipulować nimi w sposób standardowy.</li>
	<li>Przenieść żaby z powrotem do pomieszczenia dla zwierząt i monitorować pod kątem powikłań przez następne kilka dni.</li>
	<li>Alternatywna metoda zapłodnienia; składanie jaj w buforze o wysokim zasoleniu
	<ol class="lroman">
		<li>Po wybudzeniu żaby z narkozy, umieścić ją w ~ 1 L MMR o wysokim zasoleniu (1.2x). Pozostawić samicę, aby składała jaja do buforu przez około 4-6 godzin. Wycisnąć pozostałe jaja, odlać 1.2x MMR i posegregować kolorowe jaja do czystego naczynia; usunąć cały możliwy płyn.</li>
		<li>Obficie przemyć 0.3x MMR i zapłodnić w minimalnej objętości 0.3x MMR/zawiesiny plemników, aż jaja się aktywują (10 minut). Zalać 0.1x MMR i hodować jak opisano powyżej. Ta opcja jest przydatna, gdy potrzebna jest duża liczba jaj w tym samym stadium lub gdy manualne wyciskanie jaj uszkadza oocyty dawcy.</li>
</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+maturation+in+vitro%3A+contribution+of+the+oviduct+to+total+maturation+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Oocyte maturation in vitro: contribution of the oviduct to total maturation in Xenopus laevis.</a> Experientia. 31, 1275-1276 (1975).</li>
<li>Elinson, R. P., Pasceri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+UV-sensitive+targets+in+dorsoanterior+specification+of+frog+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two UV-sensitive targets in dorsoanterior specification of frog embryos.</a> Development. 106, 511-518 (1989).</li>
<li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C., C, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).</li>
<li>Holwill, S., Heasman, J., Crawley, C., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axis+and+germ+line+deficiencies+caused+by+u.v+irradiation+of+Xenopus+oocytes+cultured+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Axis and germ line deficiencies caused by u.v irradiation of Xenopus oocytes cultured in vitro.</a> Development. 100, 735-743 (1987).</li>
<li>Houston, D. W., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+Xdazl%2C+a+germ+plasm-localized+RNA%2C+in+the+differentiation+of+primordial+germ+cells+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A critical role for Xdazl, a germ plasm-localized RNA, in the differentiation of primordial germ cells in Xenopus.</a> Development. 127, 447-456 (2000).</li>
<li>Mir, A., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+mother+can+help%3A+studying+maternal+Wnt+signaling+by+anti-sense-mediated+depletion+of+maternal+mRNAs+and+the+host+transfer+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How the mother can help: studying maternal Wnt signaling by anti-sense-mediated depletion of maternal mRNAs and the host transfer technique.</a> Methods Mol Biol. 469, 417-429 (2008).</li>
<li>Rugh, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRugh%2C+R+%22Experimental+Embryology%3A+Techniques+and+procedures%22">Experimental Embryology: Techniques and procedures</a>. , Burgess. Minneapolis, MN. (1962).</li>
<li>Smith, L. D., Ecker, R. E., Subtelny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+induction+of+physiological+maturation+in+Rana+pipiens+oocytes+removed+from+their+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro induction of physiological maturation in Rana pipiens oocytes removed from their ovarian follicles.</a> Dev Biol. 17, 627-643 (1968).</li>
<li>Smith, L. D., Xu, W., Varnold, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+and+oocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis and oocyte isolation.</a> Methods Cell Biol. 36, 45-60 (1991).</li>
<li>Woolf, T. M., Jennings, C. G., Rebagliati, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability%2C+toxicity+and+effectiveness+of+unmodified+and+phosphorothioate+antisense+oligodeoxynucleotides+in+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The stability, toxicity and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos.</a> Nucleic Acids Res. 18, 1763-1769 (1990).</li>
<li>Wylie, C., Kofron, M., Payne, C., Anderson, R., Hosobuchi, M., Joseph, E., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+beta-catenin+establishes+a+%27dorsal+signal%27+in+early+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Maternal beta-catenin establishes a 'dorsal signal' in early Xenopus embryos.</a> Development. 122, 2987-2996 (1996).</li>
<li>Zhang, J., Houston, D. W., King, M. L., Payne, C., Wylie, C., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+maternal+VegT+in+establishing+the+primary+germ+layers+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of maternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos.</a> Cell. 94, 515-524 (1998).</li>
<li>Zuck, M. V., Wylie, C. C., Heasman, J. Maternal mRNAs in Xenopus embryos: an antisense approach.. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZuck%2C+MV+%22A+comparative+methods+approach+to+the+study+of+oocytes+and+embryos%22">A comparative methods approach to the study of oocytes and embryos</a>. Richter, J. D. , Oxford University Press. Oxford. 341-354 (1998).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami ustanowionymi przez Komitet IACUC Uniwersytetu Iowy.

Pomyślny transfer doprowadzi do zapłodnienia i prawidłowego podziału &gt; 50% oocytów (Rycina 3). Zazwyczaj od 30-60% przetransportowanych oocytów przeżyje etap neuruli. Zazwyczaj transferujemy od 75-150 oocytów na grupę eksperymentalną, co pozwala uzyskać wystarczającą liczbę embrionów do kilku rodzajów analiz (in situ, RT-PCR) oraz do wizualizacji fenotypu. Implantacja znacznie większej liczby oocytów nie wydaje się znacząco zwiększać uzysku. Ponadto, aby zagwarantować, że przynajmniej część embrionów przejdzie przez g...

<table><tbody><tr><td colspan="4">Roztwory i receptury:</td></tr><tr><td colspan="4">OCM (pożywka do hodowli oocytów; zmodyfikowana według Wylie) &lt;em&gt;i wsp.&lt;/em&gt;., 1996)</td></tr><tr><td>70% pożywki Leibovitza&amp;rsquo;pożywka L-15 (zawierająca l-glutaminę)</td><td>Invitrogen</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>0,4 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA; frakcja V)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9418-50g</td><td></td></tr><tr><td>1x penicylina-streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-0781</td><td></td></tr><tr><td>Dostosować pH do wartości 7,6–7,8 za pomocą 5N NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przygotowywać świeże co tydzień, przechowywać w temperaturze 18°C&amp;#x00B0;C.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">10X MMR (Marc&amp;rsquo;modyfikowany roztwór Ringera&amp;rsquo;roztwór s; Zuck &lt;em&gt;i wsp.&lt;/em&gt;., 1998)</td></tr><tr><td>1M NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 mM HEPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dostosować pH do wartości 7,6–7,8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przechowywać w temperaturze 4°C&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Roztwór anestetyczny</td></tr><tr><td>1 g/L ester etylowy kwasu 3-aminobenzoowego (MS222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>0,7 g/L wodorowęglanu sodu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rozpuścić w wodzie uzdatnionej preparatem Amquel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przygotowywać świeże co tydzień</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Roztwory zapasowe progesteronu</td></tr><tr><td>10 mM progesteronu (Sigma P-0130) w 100% etanolu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczyć do stężenia 1 mM w 100% EtOH, aby uzyskać 500-krotny roztwór zapasowy/roboczy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przechowywać w temperaturze -20°C&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Barwniki witalne (zmodyfikowane według Heasmana) &lt;em&gt;i wsp.&lt;/em&gt;., 1991)</td></tr><tr><td>Niebieski: 0,1% Nile Blue A</td><td>Aldrich</td><td>121479-5G</td><td></td></tr><tr><td>Czerwony: 0,25% neutralnej czerwieni</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-6634</td><td></td></tr><tr><td>Brązowy: 1% brązu Bismarcka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-2759</td><td></td></tr><tr><td>Zielony (80 &amp;mu;jasnoniebieski + 80 &amp;mu;jasnobrązowy),</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jasnofioletowy (80 &amp;mu;l blue + 80 &amp;mu;l czerwony).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szósty kolor, pomarańczowy (80 &amp;mu;l red+ 80 &amp;mu;(jasnobrązowego), może być również stosowany, lecz często trudno go odróżnić od brązowego.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Roztwory stokowe Blue, Red i Brown przygotowuje się w wodzie dejonizowanej w probówkach o pojemności 50 ml, inkubuje przez 20 minut w warunkach kołysania, a następnie wiruje w wirówce klinicznej. Nadpłyny rozlewa się do probówek do mikrowirówki i przechowuje w temperaturze -20°C.&amp;#x00B0;C.</td></tr></tbody></table>

zapłodnienie oocytów xenopus metodą transferu do gospodarza

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Badanie roli cząsteczek dziedziczonych w drodze matczynej w wczesnym rozwoju kręgowców jest często utrudnione przez czas i koszty niezbędne do wygenerowania zwierząt z mutacjami efektu matczynego. Ponadto wiele technik nadekspresji lub inhibicji funkcji genów u organizmów takich jak Xenopus i zebrafish nie pozwala na wystarczające celowanie w kluczowe matczyne szlaki sygnalizacyjne, takie jak sygnalizacja Wnt. W przypadku Xenopus manipulacja funkcją genów w hodowanych oocytach, a następnie ich zapłodnienie, może w pewnym stopniu rozwiązać te problemy. Oocyty są manualnie defolikulowane z tkanki jajnika dawcy, wstrzykiwane lub traktowane w hodowli zgodnie z potrzebami, a następnie stymulowane progesteronem w celu indukcji dojrzewania. Następnie oocyty są wprowadzane do jamy ciała owulującej samicy żaby gospodarza, skąd przemieszczają się przez jajowód gospodarza, nabywając modyfikacji i otoczek galaretowatych niezbędnych do zapłodnienia. Powstałe embriony mogą być następnie hodowane do pożądanego stadium i analizowane pod kątem efektów wszelkich zaburzeń eksperymentalnych. Ta metoda transferu do gospodarza okazała się bardzo skuteczna w odkrywaniu podstawowych mechanizmów wczesnego rozwoju i umożliwia szeroki zakres możliwości eksperymentalnych, które nie są dostępne w żadnym innym modelowym organizmie kręgowca.

Procedura zapłodnienia oocytów Xenopus metodą transferu do gospodarza.

Zapłodnienie oocytów Xenopus metodą transferu do gospodarza

Badanie wkładu cząsteczek dziedziczonych w drodze matczynej w wczesny rozwój kręgowców jest często utrudnione przez czas i nakłady finansowe niezbędne do...

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie rozwijających się embrionów pochodzących z miejsc oocytów (OO), które były manipulowane w hodowli. Jest to osiągane poprzez wstępne wyizolowanie miejsc oocytów od jednej samicy-donora i poddanie ich pożądanym manipulacjom w hodowli. Drugim krokiem procedury jest stymulacja dojrzewania tych cyto-komórek przy użyciu progesteronu oraz wstrzyknięcie gonadotropiny potencjalnym samicom-gospodarzom w celu stymulacji składania jaj.Trzecim krokiem procedury jest barwienie cytów dawcy barwnikami witalnymi oraz przygotowanie samicy, która będzie pełnić rolę biorcy. Ostatnim etapem procedury jest chirurgiczne przeniesienie cytów dawcy do jamy ciała biorcy, a po kilku godzinach odzyskanie i zapłodnienie przeniesionych komórek jajowych. W rezultacie otrzymuje się prawidłowo dzielące się embriony pochodzące od eksperymentalnie manipulowanego dawcy.Cytes można pozyskać i analizować w taki sam sposób, jak normalne embriony. Dzień dobry, nazywam się Doug Houston z University of Iowa. Jesteśmy dziś na kursie Xap w Cold Spring Harbor, aby pokazać Państwu, jak przeprowadzić procedurę transferu do gospodarza.W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę w celu z

fertilization-of-xenopus-oocytes-using-the-host-transfer-method

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nawożenie jajników Xenopus za pomocą metody transferu gospodarza

Jaja Xenopus laevis w stanie nienaruszonym, lizowanym i/lub frakcjonowanym są przydatne w szerokim zakresie eksperymentów. Niniejszy protokół przedstawia sposób indukowania składania jaj, ich zbierania i usuwania otoczki galaretowatej, a także sortowania jaj w celu usunięcia osobników uszkodzonych.

Pozyskiwanie komórek jajowych od samic Xenopus laevis

W niniejszym materiale demonstrujemy mikroiniekcję cytoplazmatyczną oocytów Xenopus laevis z substratem importu jądrowego, a także przygotowanie wstrzykniętych oocytów do wizualizacji za pomocą elektronowej mikroskopii sekcji cienkich.<br...

Mikroiniekcja oocytów Xenopus laevis

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Niniejszy protokół wideo prezentuje metodę generowania transgenicznych Xenopus laevis poprzez wprowadzanie transgenów do jąder plemników, a następnie transplantację jąder do niezapłodnionych komórek jajowych.

Produkcja transgenicznych Xenopus laevis poprzez integrację za pośrednictwem enzymów restrykcyjnych i transplantację jąder

Zewnętrzna warstwa ektodermy embrionalnej Xenopus stała się atrakcyjnym modelem do badań polaryzacji komórkowej. Opisano analizę, w której ocenia się subkomórkową dystrybucję białek fluorescencyjnych w komórkach ektodermy. Niniejszy protokół pomoże w odpowiedzi na pytania dotyczące przestrzennej kontroli sygnalizacji.

Polaryzowana translokacja białek fluorescencyjnych w ektodermie Xenopus w odpowiedzi na sygnalizację Wnt

Technika przeszczepiania tkanki twarzy "Extreme Anterior Domain" pomiędzy embrionami Xenopus laevis została opracowana. Tkanka może być przenoszona z jednego tła ekspresji genów do drugiego, co pozwala na badanie lokalnych wymagań dotyczących rozwoju twarzoczaszki i sygnalizowania interakcji między regionami twarzy.

Przeszczepy twarzy w zarodkach Xenopus laevis

Opisujemy metody manipulowania niedojrzałymi oocytami Xenopus laevis, dojrzewania in vitro oocytów do komórek jajowych oraz docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemników. Protokół ten umożliwia degradację niektórych białek matczynych i nadekspresję genów będących przedmiotem zainteresowania podczas zapłodnienia, a zatem jest cenny dla badania ról określonych czynników we wczesnym rozwoju embrionalnym.

Manipulacja i dojrzewanie in vitro oocytów Xenopus laevis, a następnie docytoplazmatyczna iniekcja plemnika w celu zbadania rozwoju embrionalnego

Opisujemy system oocytów i czapeczek zwierzęcych Xenopus do klonowania ekspresji genów zdolnych do wywołania odpowiedzi w kompetentnej ektodermie i omawiamy techniki późniejszej analizy takich genów. System ten jest przydatny w funkcjonalnej identyfikacji szerokiej gamy produktów genowych.

Klonowanie funkcjonalne przy użyciu systemu ekspresji oocytów Xenopus

Opisano zoptymalizowane procedury izolacji pojedynczych pęcherzyków, mikroiniekcji cytoplazmatycznego RNA, usuwania otaczających warstw komórek i ekspresji białek w oocytach Xenopus. Ponadto przedstawiono prostą metodę szybkiej zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych z kanałami jonowymi bramkowanymi ligandem.

Ksenopus (Ksenopus) Oocyty: zoptymalizowane metody mikroiniekcji, usuwania warstw komórek pęcherzykowych i szybkiej zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych

Ten protokół demonstruje metodę opartą na fluorescencji do wizualizacji układu naczyniowego i ilościowego określenia jego złożoności u Xenopus tropicalis. Naczynia krwionośne można obrazować kilka minut po wstrzyknięciu barwnika fluorescencyjnego do bijącego serca zarodka po manipulacjach genetycznych i/lub farmakologicznych w celu zbadania rozwoju układu sercowo-naczyniowego in vivo.

Wizualizacja i analiza ilościowa angiogenezy embrionalnej u Xenopus tropicalis

Geny niezbędne do przetrwania stanowią techniczne przeszkody w tworzeniu linii mutantów. Skakanie pozwala uniknąć śmiertelności, łącząc edycję genomu z przeszczepem pierwotnych komórek rozrodczych w celu stworzenia zwierząt typu dzikiego z mutacjami linii zarodkowej. Leapfrogging pozwala również na efektywne generowanie homozygotycznych mutantów zerowych w pokoleniu F1. Tutaj pokazany jest etap przeszczepu.

Przeszczep pierwotnych komórek rozrodczych w celu przeskoku opartego na CRISPR/Cas9 w Xenopus

Poznaj metodę transferu do żywicielki do zapłodnienia oocytów Xenopus w badaniach biologii rozwoju. Technika ta umożliwia uzyskanie zarodków z manipulowanych komórek jajowych in vivo.

Zapłodnienie oocytów Xenopus metodą transferu do gospodarza

Przeglądaj więcej filmów