Name: Zastosowanie metod kinetyki zatrzymanego przepływu do badania mechanizmu działania białka naprawy DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Poznaj kinetykę wiązania i aktywność ATPazową kompleksu Msh2-Msh6 w naprawie DNA przy użyciu metod kinetyki zatrzymanego przepływu. To podejście pozwala badać mechanizmy naprawy błędów replikacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana przez grant NSF CAREER Award (M.M.H), stypendium Barry M. Goldwater (F.N.B) oraz grant ASBMB Undergraduate Research Award (C.W.D). Klon do nadekspresji PBP został uprzejmie udostępniony przez dr. Martina Webba (MRC, UK).

<ol><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+transient-state+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Advances in transient-state kinetics.</a> Curr Opin Biotechnol. 9 (1), 87-89 (1998).</li>
<li>Johnson, K. A. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+KAE+%22Kinetic+analysis+of+macromolecules%22">Kinetic analysis of macromolecules</a>. , Oxford University Press. (2003).</li>
<li>Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+mismatch+repair+protein+MutS+and+its+complex+with+a+substrate+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA.</a> Nature. 407 (6805), 703-710 (2000).</li>
<li>Lamers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+DNA+mismatch+repair+protein+MutS+binding+to+a+G+x+T+mismatch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G x T mismatch.</a> Nature. 407 (6805), 711-717 (2000).</li>
<li>Warren, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+MutSalpha+DNA+lesion+recognition+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of the human MutSalpha DNA lesion recognition complex.</a> Mol Cell. 26 (4), 579-592 (2007).</li>
<li>Kunkel, T. A. &amp, Erie, D. A. DNA Mismatch Repair. Annu Rev Biochem. 74, 681-710 (2005).</li>
<li>Jiricny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+mismatch-repair+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The multifaceted mismatch-repair system.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (5), 335-346 (2006).</li>
<li>Hsieh, P., Yamane, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+mismatch+repair%3A+Molecular+mechanism%2C+cancer%2C+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing.</a> Mech Ageing Dev. 129 (7-8), 391-407 (2008).</li>
<li>Jacobs-Palmer, E., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+nucleotides+on+MutS-DNA+binding+kinetics+clarify+the+role+of+MutS+ATPase+activity+in+mismatch+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The effects of nucleotides on MutS-DNA binding kinetics clarify the role of MutS ATPase activity in mismatch repair.</a> J Mol Biol. 366 (4), 1087-1098 (2007).</li>
<li>Antony, E., Khubchandani, S., Chen, S., Hingorani, M. M., M, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Msh2+and+Msh6+subunits+to+the+asymmetric+ATPase+and+DNA+mismatch+binding+activities+of+Saccharomyces+cerevisiae+Msh2-Msh6+mismatch+repair+protein%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Contribution of Msh2 and Msh6 subunits to the asymmetric ATPase and DNA mismatch binding activities of Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 mismatch repair protein.</a> DNA Repair (Amst). 5 (2), 153-162 (2006).</li>
<li>Antony, E., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mismatch+recognition-coupled+stabilization+of+Msh2-Msh6+in+an+ATP-bound+state+at+the+initiation+of+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mismatch recognition-coupled stabilization of Msh2-Msh6 in an ATP-bound state at the initiation of DNA repair.</a> Biochemistry. 42 (25), 7682-7693 (2003).</li>
<li>Finkelstein, J., Antony, E., Hingorani, M. M., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overproduction+and+analysis+of+eukaryotic+multiprotein+complexes+in+Escherichia+coli+using+a+dual-vector+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Overproduction and analysis of eukaryotic multiprotein complexes in Escherichia coli using a dual-vector strategy.</a> Anal Biochem. 319 (1), 78-87 (2003).</li>
<li>Zhai, J., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S.+cerevisiae+Msh2-Msh6+DNA+binding+kinetics+reveal+a+mechanism+of+targeting+sites+for+DNA+mismatch+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 680-685 (2010).</li>
<li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct%2C+real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).</li>
<li>Brune, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+inorganic+phosphate+interaction+with+phosphate+binding+protein+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli.</a> Biochemistry. 37 (29), 10370-10380 (1998).</li>
<li>Antony, E., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+ATP+binding+and+hydrolysis+activity+of+the+Thermus+aquaticus+MutS+dimer+is+key+to+modulation+of+its+interactions+with+mismatched+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA.</a> Biochemistry. 43 (41), 13115-13128 (2004).</li>
<li>Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+mismatch+recognition+complex+hMSH2-hMSH6+functions+as+a+novel+molecular+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch.</a> Cell. 91 (7), 995-1005 (1997).</li>
<li>Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Msh6+ATPase+activity+by+mispaired+DNA+induces+a+Msh2%28ATP%29-Msh6%28ATP%29+state+capable+of+hydrolysis-independent+movement+along+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA.</a> Mol Cell. 22 (1), 39-49 (2006).</li>
</ol>

Opisany tutaj przykład białka wiążącego niedopasowania DNA ilustruje potencjał i użyteczność metod kinetyki stanu nieustalonego w badaniu mechanizmów działania cząsteczek biologicznych. Pomiary metodą stopped-flow w skali czasu pojedynczego obrotu dostarczyły jednoznacznych dowodów na szybkie i specyficzne wiązanie białka Msh2-Msh6 do niedopasowanej pary zasad oraz tworzenie długotrwałego kompleksu białko X DNA w reakcji 9. Co więcej, analiza aktywności ATPase metodą stopped-flow (oraz quench-flow) dostarczyła...

<table><tbody><tr><td>37 G</td><td></td><td></td><td>Sekwencja DNA: 5&amp;rsquo;- ATT TCC TTC AGC AGA TAT &lt;silny&gt;G &lt;/strong&gt;T A CCA TAC TGA TTC ACA T -3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>37 T (2-Ap)</td><td></td><td></td><td>Sekwencja DNA: 5&amp;rsquo;- ATG TGA ATC AGT ATG GTA &lt;silny&gt;T&lt;/strong&gt;&lt;em&gt;Ap&lt;/em&gt;T ATC TGC TGA AGG AAA T -3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>37 T</td><td></td><td></td><td>Sekwencja DNA: 5&amp;rsquo;- ATG TGA ATC AGT ATG GTA &lt;silny&gt;&lt;em&gt;T &lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;&lt;em&gt;A &lt;/em&gt;T ATC TGC TGA AGG AAA T -3&amp;rsquo;</td></tr></tbody></table>

zastosowanie metod kinetyki stop-flow w celu zbadania mechanizmu działania białka naprawczego dna

Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein

Analiza kinetyki przejściowej jest niezbędna do zrozumienia działania makrocząsteczek biologicznych, ponieważ podejście to dostarcza informacji mechanistycznych, w tym stężeń centrów aktywnych oraz wewnętrznych stałych szybkości, które regulują funkcję makrocząsteczek. W przypadku enzymów pomiary stanu przejściowego lub stanu przedstacjonarnego pozwalają zidentyfikować i scharakteryzować poszczególne etapy ścieżki reakcji, podczas gdy pomiary stanu stacjonarnego dostarczają jedynie informacji o ogólnej wydajności katalitycznej i swoistości. Pojedyncze zdarzenia, takie jak oddziaływania białko-białko lub białko-ligand oraz limitujące szybkość zmiany konformacyjne, często zachodzą w skali milisekundowej i mogą być mierzone bezpośrednio metodami stopped-flow oraz przepływu z gaszeniem chemicznym. Przy dostępności sygnału optycznego, takiego jak fluorescencja, technika stopped-flow stanowi potężne i dostępne narzędzie do monitorowania przebiegu reakcji – od wiązania substratu, przez uwalnianie produktu, aż po obrót katalityczny1,2.
W niniejszej pracy przedstawiamy zastosowanie kinetyki przepływu zatrzymanego (stopped-flow) do zbadania mechanizmu działania kompleksu Msh2-Msh6, eukariotycznego białka naprawy DNA, które rozpoznaje niedopasowania par zasad oraz pętle insercyjno-delecyjne w DNA i sygnalizuje rozpoczęcie naprawy niedopasowań (MMR)3-5. Dzięki temu Msh2-Msh6 zwiększa dokładność replikacji DNA o trzy rzędy wielkości (częstotliwość błędów spada z ~10-6 do 10-9 zasad), co pomaga w zachowaniu integralności genomu. Nie jest zaskakujące, że zaburzenia funkcji ludzkiego kompleksu Msh2-Msh6 są powiązane z dziedzicznym rakiem jelita grubego bezpolipowatym oraz innymi sporadycznymi nowotworami6-8. Aby zrozumieć mechanizm działania tego kluczowego białka metabolicznego DNA, badamy dynamikę oddziaływań Msh2-Msh6 z niedopasowanym DNA, a także aktywność ATPase, która napędza jego działanie w procesie MMR. Wiązanie DNA mierzy się poprzez szybkie mieszanie Msh2-Msh6 z DNA zawierającym fluorofor 2-aminopuryne (2-Ap) sąsiadujący z niedopasowaniem G:T i monitorowanie w czasie rzeczywistym wynikowego wzrostu fluorescencji 2-aminopuryne. Dysocjację DNA mierzy się poprzez mieszanie wcześniej utworzonego kompleksu Msh2-Msh6 z niedopasowaniem G:T(2-Ap) z nieznakowanym DNA pułapkującym i monitorowanie spadku fluorescencji w czasie9. Kinetykę ATPase w stanie przedstacjonarnym mierzy się na podstawie zmiany fluorescencji białka wiążącego fosforan (MDCC-PBP), znakowanego 7-dietyloamino-3-((((2-maleimidylo)etylo)amino)karbonylo)kumaryną, po związaniu fosforanu (Pi) uwalnianego przez Msh2-Msh6 w wyniku hydrolizy ATP9,10.
Dane wykazują szybkie wiązanie Msh2-Msh6 z niedopasowaniem G:T i tworzenie długożyjącego kompleksu Msh2-Msh6 G:T, co z kolei prowadzi do zahamowania hydrolizy ATP i stabilizacji białka w formie związanej z ATP. Kinetyka reakcji stanowi wyraźne potwierdzenie hipotezy, że związane z ATP Msh2-Msh6 sygnalizuje naprawę DNA po związaniu niedopasowanej pary zasad w podwójnej helisie.
F. Noah Biro i Jie Zhai wnieśli równy wkład w opracowanie tej pracy.

Msh2-Msh6 odpowiada za inicjację naprawy błędów replikacyjnych w DNA. Przedstawiamy tutaj podejście oparte na kinetyce przejściowej, mające na celu zrozumienie mechanizmu działania tego kluczowego białka. Raport ilustruje eksperymenty z zastosowaniem techniki przepływu zatrzymanego (stopped-flow) w celu pomiaru sprzężonej kinetyki wiązania DNA oraz aktywności ATPase, które leżą u podstaw mechanizmu działania Msh2-Msh6 w procesie naprawy DNA.

Zastosowanie metod kinetyki stop-flow w celu zbadania mechanizmu działania białka naprawczego DNA

Analiza kinetyki przejściowej jest niezbędna do zrozumienia funkcjonowania makrocząsteczek biologicznych, ponieważ podejście to pozwala na uzyskanie informacji mechanistycznych...

Niniejsza prezentacja przedstawia dwie metody przepływu zatrzymanego (stopped flow) służące do pomiaru kinetyki reakcji białka naprawy niedopasowań DNA MutS2-MutS6. MutS2-MutS6 rozpoznaje niedopasowania par zasad w DNA i sygnalizuje konieczność naprawy w reakcji napędzanej przez ATP. Pierwsza metoda mierzy wiązanie MutS2-MutS6 do DNA poprzez wzrost fluorescencji 2-aminopuryny umieszczonej obok niedopasowanej pary GT w DNA. Odczynniki są mieszane w urządzeniu do przepływu zatrzymanego i monitorowane w czasie w celu wyznaczenia stałej szybkości reakcji.Druga metoda mierzy aktywność tPA z kompleksu MutS2-MutS6 przy użyciu fluorescencyjnego białka raportującego wiążącego fosforan. Reaktanty są mieszane w systemie przepływu zatrzymanego (stopped-flow) i monitorowane w czasie. W celu wyznaczenia stałych szybkości hydrolizy ATP oraz uwalniania fosforanu, uzyskane dane kinetyczne wyjaśniają mechanizm działania MutS2-MutS6 w naprawie niedopasowań DNA.Cześć, jestem Noah Biro z Laboratorium MONI w departamencie biologii molekularnej i biochemii na Wesleyan University. Cześć, jestem DJ J, również z Laboratorium Man's na Wesleyan University. A ja jestem Chris Dset, także z Laboratorium JI'S.Dzisiaj zaprezentujemy dwa testy oparte na fluorescencji, służące do monitorowania kinetyki reakcji w skali milisekundowej. Metod tych używamy w naszym laboratorium do badania sposobu, w jaki białko naprawcze DNA MutS (MutS), wiąże niedopasowane pary zasad w DNA i inicjuje proces naprawy. Zapraszam do oglądania.Przed rozpoczęciem tej procedury wymagane odczynniki białkowe i DNA muszą być przygotowane. Należy pozyskać białko s visier mush two mush six, które zostało wcześniej nadekspresowane w E. coli i oczyszczone za pomocą chromatografii jonowymiennej oraz powinowactwa. W celu przygotowania odczynników DNA należy zakupić jednoniciowe DNA zmodyfikowane fluorescencyjnym analogiem nukleotydu 2-aminopuryny, oczyścić nici za pomocą denaturującej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, a następnie je wyżarzyć, aby uzyskać niedopasowany dupleks DNA z 2-aminopuryną sąsiadującą z niedopasowaniem GT.W podobny sposób należy przygotować nieznakowane DNA z niemodyfikowanego jednoniciowego DNA. Sekwencje DNA wykorzystane w tej procedurze znajdują się w części opisowej niniejszego protokołu. Przez cały czas trwania procedury należy dbać o wysoką rzetelność eksperymentalną, stosując odczynniki wysokiej czystości w celu zminimalizowania zanieczyszczeń fluorescencyjnych.Należy również przefiltrować wszystkie roztwory zapasowe przez membranę 0.2 µm w celu usunięcia cząstek stałych, które mogłyby zapchać urządzenie do pomiarów przepływu zatrzymanego (stopped flow). Aby przygotować się do eksperymentów wiązania DNA, należy przygotować próbki o końcowej objętości 400 µL na próbkę, co jest wystarczające na około 10 pomiarów kinetyki. Próbki należy przechowywać w lodzie.Aby zachować aktywność białka, należy przygotować próbkę DNA o stężeniu 0,12 µM oraz próbkę Mush2Mush6 o stężeniu 0,8 µM w buforze do wiązania DNA. Po zmieszaniu w stosunku 1:1 w układzie stopped-flow, stężenia końcowe wyniosą 0,06 µM DNA oraz 0,4 µM Mush2Mush6.Urządzenie do pomiarów z zatrzymanym przepływem (stopped flow) wykorzystuje silnik napędowy do jednoczesnego i szybkiego przetłoczenia roztworów substratów ze strzykawek napędowych do urządzenia mieszającego. Następnie zmieszany roztwór wpływa do celi obserwacyjnej w celu gromadzenia danych. Aby przygotować instrument, należy w pierwszej kolejności upewnić się, że komputer i kontroler są wyłączone.Następnie włącz łaźnię wodną z cyrkulacją w celu chłodzenia lampy, a potem zapal lampę. Ustaw monochromator na pożądaną długość fali wzbudzenia, która wynosi 315 nanometrów. W przypadku 2-aminopuryny ustaw szerokość szczeliny SL na pożądaną wartość.Wstaw filtr z odcięciem 350 nanometrów do lampy fotopowielaczowej lub PMT, aby zebrać sygnał fluorescencyjny aminopuryn. Włącz kontroler i komputer. Następnie włącz cyrkulacyjną łaźnię wodną.Wypełnia to płaszcz wodny wokół strzykawek napędowych w celu utrzymania pożądanej temperatury reakcji podczas eksperymentu. Na koniec uruchom program stop-flow w menu sterowania P-M-T-H-V. Ustaw napięcie PMT, które początkowo można zmieniać w celu dostosowania czułości PMT, ale musi pozostać stałe w dalszej części badania.W trakcie eksperymentu zmierz prąd ciemny, aby skorygować tło szumów elektrycznych. Następnie wypłucz strzykawki napędowe układu stopped flow oraz celę obserwacyjną. Ustaw zawór załadunkowy próbek w pozycji załadunku.Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml odfiltrowaną wodą dejonizowaną. Przymocuj strzykawkę do portu załadowczego znajdującego się pod strzykawką napędową i wtłocz wodę pomiędzy obie strzykawki. Powtórz ten proces dwukrotnie dla każdej z nich.Strzykawka napędowa do wykorzystania w doświadczeniu. Następnie należy napełnić strzykawki napędowe wodą w celu wypłukania celi obserwacyjnej. Przełączyć zawór załadunku próbki do pozycji otwartej.Użyj polecenia regulacji napędu strzykawki, aby opuścić płytę napędową i przepchnąć wodę przez celę obserwacyjną do linii wyjściowej. Należy uważać, aby nie dopchnąć tłoka do samego końca strzykawki napędowej. Na koniec podnieś płytę napędową i przełącz zawór w pozycję załadunku.Przepłucz raz buforem reakcyjnym i opróżnij strzykawki. Aby rozpocząć eksperymenty z wiązaniem DNA, przenieś każdą próbkę z probówki do nowej strzykawki o pojemności 1 mL. Podłącz każdą strzykawkę do portu załadowania i wtłocz roztwór do strzykawki napędowej.Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza, ręcznie przesuwając roztwór między dwiema strzykawkami z przerwami. Następnie opuść płytę napędową, aż zetknie się ona z górną częścią strzykawek napędowych. W celu rozpoczęcia zbierania danych otwórz okno ustawiania kanałów czasu.Wybierz tryb kanału zbierania danych dla analizy danych oraz liczbę śladów do zebrania. Wprowadź czas zbierania danych, w trakcie którego zostanie zebranych 1000 punktów danych. Następnie ustaw zawór w pozycji otwartej i kliknij przycisk zbierania danych.Ta czynność inicjuje mieszanie mieszaniny dwa, mieszaniny sześć oraz DNA, po czym reakcja zostaje wprowadzona do komory obserwacyjnej. Monitorowana jest emisja fluorescencji komórkowej z 2-aminopuryny. Należy zebrać co najmniej pięć śladów kinetycznych, aby uzyskać wysokiej jakości zestaw danych, a następnie zapisać plik po zakończeniu eksperymentu.Otwórz każdy plik danych i wyciągnij średnią z wielu krzywych kinetycznych. Następnie zapisz plik ze średnią i wyeksportuj go do programu graficznego w celu przeprowadzenia analizy. Na koniec wyłącz lampę, a strzykawki oraz celę obserwacyjną dokładnie wypłucz wodą.Następnie wyłącz pozostały sprzęt z wyjątkiem cyrkulacyjnej łaźni wodnej. Pozostawia się ją włączoną przez dodatkowe 15 minut w celu schłodzenia lampy. Dane kinetyczne dla wiązania mush two mush six z niedopasowanym DNA najlepiej opisuje pojedyncza funkcja wykładnicza, która daje szybką szybkość asocjacji rzędu 10⁷ M⁻¹s⁻¹; analogiczne eksperymenty z metodą stopped flow pozwalają wyznaczyć szybkość dysocjacji kompleksu mush two mush six z niedopasowanym DNA, która przebiega bardzo powoli, w zakresie 0,01 do 0,02 s⁻¹.Wyniki te stanowią bezpośredni pomiar szybkości i powinowactwa, z jakim MutS2-MutS6 wiąże niedopasowaną parę zasad podczas reakcji naprawy DNA. W następnym kroku zostanie przeprowadzony eksperyment z użyciem przepływu zatrzymanego (stopped-flow), aby zmierzyć aktywność ATPazy kompleksu MutS2-MutS6.W warunkach stanu przedstacjonarnego dla tego testu absolutnie niezbędne jest unikanie stosowania szkła na wszystkich etapach przygotowania odczynników, w tym podczas oczyszczania białek i DNA, aby zminimalizować tło fosforanowe. Jako reporter do pomiaru uwalniania fosforanu po hydrolizie TP wykorzystuje się białko wiążące fosforan (PBP), które zostało oczyszczone z E. coli i znakowane fluoroforem MDCC. MDCC-PBP jest niezawodnym reporterem hydrolizy ATP i kinetyki uwalniania fosforanu w stanie przedstacjonarnym. Wiąże on fosforan szybko i z wysokim powinowactwem, co skutkuje znacznym wzrostem fluorescencji MDCC.Przygotuj próbkę zawierającą 4 µM mush oraz 2 mush 6 protein z dodatkiem lub bez dodatku 6 µM niedopasowanego DNA. Przygotuj kolejną próbkę zawierającą 1 mM świeżo rozpuszczonego HEP oraz 20 µM M-D-C-C-P-V-P w celu usunięcia zanieczyszczającego fosforanu. Do próbek dodaj purynonukleozydofosforylazę oraz 7-metyloguaninę, a następnie inkubuj w lodzie przez co najmniej 20 minut.Przygotuj aparat do pomiarów z zatrzymanym przepływem (stopped-flow) zgodnie z wcześniejszym opisem. Dodatkowo usuń wszelkie zanieczyszczenia fosforanowe z tłoków napędzających za pomocą puryny, nukleozydów, grup fosforylowych oraz siedmiometyloguaniny. Inkubuj przez 20 minut. Ustaw długość fali wzbudzenia na 425 nanometrów i użyj filtra odcinającego 450 nanometrów z PMT do detekcji fluorescencji M-D-C-C-P-B-P.Napełnij strzykawki napędowe próbkami zgodnie z wcześniejszym opisem. Ustaw parametry zbierania danych i kliknij „zbierz dane”, aby zmieszać mush two mush six z TP i M-D-C-C-P-B-P; monitoruj uwalnianie fosforanu przez mush two mush six oraz powiązany wzrost fluorescencji M-D-C-C-P-P-P w czasie. Zbierz co najmniej pięć śladów kinetycznych, aby uzyskać wysokiej jakości zestaw danych, a następnie zapisz plik, uśrednij wiele śladów kinetycznych i wyeksportuj plik z danymi do analizy zgodnie z wcześniejszym opisem. Przygotuj krzywą kalibracyjną w celu określenia liniowej zależności między stężeniem fosforanu a fluorescencją M-D-C-C-P-P-P; najpierw zmieszaj M-D-C-C-P-P-P z różnymi stężeniami fosforanu w tych samych warunkach eksperymentalnych w systemie stop-flow.Następnie naniesie na wykres maksymalną fluorescencję M-D-C-C-P-P-P w funkcji poszczególnych stężeń fosforanu w celu sporządzenia krzywej kalibracyjnej i wykorzystaj nachylenie prostej do określenia stężenia fosforanu w reakcjach mush two mush six. Przedstaw stężenie fosforanu w funkcji czasu i dopasuj dane do funkcji wykładniczej oraz liniowej. Funkcja ta opisuje gwałtowny wyrzut ATP w stanie przedstacjonarnym i uwalnianie fosforanu, po których następuje liniowa faza stacjonarna reakcji. Dane kinetyczne wykazują, że mush two mush six hydrolizuje ATP i szybko uwalnia fosforan z szybkością 1,4 s⁻¹ w pierwszym cyklu katalitycznym.Następnie następuje powolny etap reakcji, który ogranicza kolejne obroty do siedmiokrotnie wolniejszej stałej katalitycznej w stanie stacjonarnym wynoszącej 0,2 na sekundę. Jednakże, gdy MutS6 wiąże się z niedopasowanym DNA, gwałtowna hydroliza ATP i uwalnianie fosforanu zostają zahamowane. Wyniki te bezpośrednio wykazują, że po związaniu niedopasowanej pary zasad i DNA, MutS6 przechodzi w stan związany z ATP.Przełączenie to jest krytycznym etapem reakcji naprawy DNA. Właśnie pokazaliśmy, jak użyć urządzenia do pomiarów stop-flow w celu zmierzenia kinetyki reakcji w czasie rzeczywistym. Takie pomiary poszerzyły naszą wiedzę na temat mechanizmu działania MASH two, MASH six oraz naprawy niedopasowań w DNA.Przeprowadzając tego typu eksperymenty, należy pamiętać o stosowaniu odczynników wysokiej jakości, w tym bardzo czystego DNA i białek, oraz zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć zanieczyszczenia fosforanami w teście ATP. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

application-stopped-flow-kinetics-methods-to-investigate-mechanism

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zastosowanie metod kinetyki przepływowej do badania mechanizmu działania białka naprawczego DNA

W tym filmie opisujemy metodę immunofluorescencji, aby zobrazować lokalizację białek naprawy DNA γH2AX i 53BP1 w miejscach pęknięć dwuniciowego DNA w napromieniowanych jądrach komórkowych.

Oparta na immunofluorescencji wizualizacja interakcji białek naprawy DNA

Tutaj pokazano badanie różnych podejść do rozpoznawania zmian DNA za pomocą obrazowania AFM pojedynczej cząsteczki na przykładzie systemu naprawy wycinania nukleotydów. Opisano procedury przygotowania próbek DNA i białek oraz szczegóły doświadczalne i analityczne dla doświadczeń AFM.

Badania mikroskopii sił atomowych rozpoznawania zmian DNA w naprawie przez wycinanie nukleotydów

Mikronaświetlanie laserowe jest użytecznym narzędziem do badań nad naprawą DNA w żywych komórkach. Przedstawiono metodologiczne podejście do stosowania laserów UVA do wywoływania różnych zmian w DNA. Zoptymalizowaliśmy metodę miejscowego mikronapromieniowania, która utrzymuje normalny cykl komórkowy; W ten sposób napromieniowane komórki przechodzą przez mitozę.

Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA

Celem tego protokołu jest ilościowe określenie naprawy zdefiniowanych wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidowym DNA. Uszkodzone plazmidy są transfekowane do linii komórkowych ssaków biorcy i zbierane o niskiej masie cząsteczkowej w wielu punktach czasowych po transfekcji. Kinetykę naprawy DNA określa się ilościowo za pomocą specyficznego dla nici wydłużania startera, a następnie qPCR.

Prosty, szybki i ilościowy test do pomiaru naprawy wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidach transfekowanych do komórek ssaków

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Opracowano systemy obserwacji w czasie rzeczywistym oparte na transferze energii rezonansu fluorescencji reakcji wymiany nici DNA, w której pośredniczy Rad51. Korzystając z przedstawionych tutaj protokołów, jesteśmy w stanie wykryć powstawanie produktów pośrednich reakcji i ich przekształcanie w produkty, jednocześnie analizując kinetykę enzymatyczną reakcji.

Obserwacja w czasie rzeczywistym reakcji wymiany nici DNA, w której pośredniczy Rad51

Opisano wysoce równoległą metodę pomiaru specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki. Protokół ten demonstruje technikę przy użyciu endonukleazy restrykcyjnej NdeI. Metodę można łatwo zmodyfikować w celu zbadania dowolnego procesu, który prowadzi do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA.

Równoległy, wysokoprzepustowy test kinetyczny pojedynczej cząsteczki do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Ten artykuł przedstawia podstawowe etapy immunobarwienia i immunoprecypitacji chromatyny. Protokoły te są powszechnie stosowane do badania procesów komórkowych związanych z uszkodzeniem DNA oraz do wizualizacji i ilościowego określenia rekrutacji białek zaangażowanych w naprawę DNA.

Wizualizacja i ilościowe określanie uszkodzeń DNA specyficznych dla miejsca na podstawie endonukleazy

Badania genetyczne na drożdżach mogą być wykorzystywane do badania funkcji molekularnych i komórkowych ludzkich genów w komórkowym metabolizmie DNA. Opisano metody genetycznej charakterystyki produktu ludzkiego genu WRN, którego defekt występuje w zespole Wernera – chorobie objawiającej się przedwczesnym starzeniem się, w funkcjonalnie konserwowanych szlakach, wykorzystując drożdże jako przystępny system modelowy.

Badania genetyczne białek naprawy DNA u ludzi z wykorzystaniem drożdży jako systemu modelowego

Poznaj kinetykę wiązania i aktywność ATPazową kompleksu Msh2-Msh6 w naprawie DNA przy użyciu metod kinetyki zatrzymanego przepływu. To podejście pozwala badać mechanizmy naprawy błędów replikacji.

Zastosowanie metod kinetyki stop-flow w celu zbadania mechanizmu działania białka naprawczego DNA

Przeglądaj więcej filmów