Zastosowanie metod kinetyki stop-flow w celu zbadania mechanizmu działania białka naprawczego DNA

Niniejsza prezentacja przedstawia dwie metody przepływu zatrzymanego (stopped flow) służące do pomiaru kinetyki reakcji białka naprawy niedopasowań DNA MutS2-MutS6. MutS2-MutS6 rozpoznaje niedopasowania par zasad w DNA i sygnalizuje konieczność naprawy w reakcji napędzanej przez ATP. Pierwsza metoda mierzy wiązanie MutS2-MutS6 do DNA poprzez wzrost fluorescencji 2-aminopuryny umieszczonej obok niedopasowanej pary GT w DNA. Odczynniki są mieszane w urządzeniu do przepływu zatrzymanego i monitorowane w czasie w celu wyznaczenia stałej szybkości reakcji.

Druga metoda mierzy aktywność tPA z kompleksu MutS2-MutS6 przy użyciu fluorescencyjnego białka raportującego wiążącego fosforan. Reaktanty są mieszane w systemie przepływu zatrzymanego (stopped-flow) i monitorowane w czasie. W celu wyznaczenia stałych szybkości hydrolizy ATP oraz uwalniania fosforanu, uzyskane dane kinetyczne wyjaśniają mechanizm działania MutS2-MutS6 w naprawie niedopasowań DNA.

Cześć, jestem Noah Biro z Laboratorium MONI w departamencie biologii molekularnej i biochemii na Wesleyan University. Cześć, jestem DJ J, również z Laboratorium Man's na Wesleyan University. A ja jestem Chris Dset, także z Laboratorium JI'S.

Dzisiaj zaprezentujemy dwa testy oparte na fluorescencji, służące do monitorowania kinetyki reakcji w skali milisekundowej. Metod tych używamy w naszym laboratorium do badania sposobu, w jaki białko naprawcze DNA MutS (MutS), wiąże niedopasowane pary zasad w DNA i inicjuje proces naprawy. Zapraszam do oglądania.

Przed rozpoczęciem tej procedury wymagane odczynniki białkowe i DNA muszą być przygotowane. Należy pozyskać białko s visier mush two mush six, które zostało wcześniej nadekspresowane w E. coli i oczyszczone za pomocą chromatografii jonowymiennej oraz powinowactwa. W celu przygotowania odczynników DNA należy zakupić jednoniciowe DNA zmodyfikowane fluorescencyjnym analogiem nukleotydu 2-aminopuryny, oczyścić nici za pomocą denaturującej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, a następnie je wyżarzyć, aby uzyskać niedopasowany dupleks DNA z 2-aminopuryną sąsiadującą z niedopasowaniem GT.

W podobny sposób należy przygotować nieznakowane DNA z niemodyfikowanego jednoniciowego DNA. Sekwencje DNA wykorzystane w tej procedurze znajdują się w części opisowej niniejszego protokołu. Przez cały czas trwania procedury należy dbać o wysoką rzetelność eksperymentalną, stosując odczynniki wysokiej czystości w celu zminimalizowania zanieczyszczeń fluorescencyjnych.

Należy również przefiltrować wszystkie roztwory zapasowe przez membranę 0.2 µm w celu usunięcia cząstek stałych, które mogłyby zapchać urządzenie do pomiarów przepływu zatrzymanego (stopped flow). Aby przygotować się do eksperymentów wiązania DNA, należy przygotować próbki o końcowej objętości 400 µL na próbkę, co jest wystarczające na około 10 pomiarów kinetyki. Próbki należy przechowywać w lodzie.

Aby zachować aktywność białka, należy przygotować próbkę DNA o stężeniu 0,12 µM oraz próbkę Mush2Mush6 o stężeniu 0,8 µM w buforze do wiązania DNA. Po zmieszaniu w stosunku 1:1 w układzie stopped-flow, stężenia końcowe wyniosą 0,06 µM DNA oraz 0,4 µM Mush2Mush6.

Urządzenie do pomiarów z zatrzymanym przepływem (stopped flow) wykorzystuje silnik napędowy do jednoczesnego i szybkiego przetłoczenia roztworów substratów ze strzykawek napędowych do urządzenia mieszającego. Następnie zmieszany roztwór wpływa do celi obserwacyjnej w celu gromadzenia danych. Aby przygotować instrument, należy w pierwszej kolejności upewnić się, że komputer i kontroler są wyłączone.

Następnie włącz łaźnię wodną z cyrkulacją w celu chłodzenia lampy, a potem zapal lampę. Ustaw monochromator na pożądaną długość fali wzbudzenia, która wynosi 315 nanometrów. W przypadku 2-aminopuryny ustaw szerokość szczeliny SL na pożądaną wartość.

Wstaw filtr z odcięciem 350 nanometrów do lampy fotopowielaczowej lub PMT, aby zebrać sygnał fluorescencyjny aminopuryn. Włącz kontroler i komputer. Następnie włącz cyrkulacyjną łaźnię wodną.

Wypełnia to płaszcz wodny wokół strzykawek napędowych w celu utrzymania pożądanej temperatury reakcji podczas eksperymentu. Na koniec uruchom program stop-flow w menu sterowania P-M-T-H-V. Ustaw napięcie PMT, które początkowo można zmieniać w celu dostosowania czułości PMT, ale musi pozostać stałe w dalszej części badania.

W trakcie eksperymentu zmierz prąd ciemny, aby skorygować tło szumów elektrycznych. Następnie wypłucz strzykawki napędowe układu stopped flow oraz celę obserwacyjną. Ustaw zawór załadunkowy próbek w pozycji załadunku.

Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml odfiltrowaną wodą dejonizowaną. Przymocuj strzykawkę do portu załadowczego znajdującego się pod strzykawką napędową i wtłocz wodę pomiędzy obie strzykawki. Powtórz ten proces dwukrotnie dla każdej z nich.

Strzykawka napędowa do wykorzystania w doświadczeniu. Następnie należy napełnić strzykawki napędowe wodą w celu wypłukania celi obserwacyjnej. Przełączyć zawór załadunku próbki do pozycji otwartej.

Użyj polecenia regulacji napędu strzykawki, aby opuścić płytę napędową i przepchnąć wodę przez celę obserwacyjną do linii wyjściowej. Należy uważać, aby nie dopchnąć tłoka do samego końca strzykawki napędowej. Na koniec podnieś płytę napędową i przełącz zawór w pozycję załadunku.

Przepłucz raz buforem reakcyjnym i opróżnij strzykawki. Aby rozpocząć eksperymenty z wiązaniem DNA, przenieś każdą próbkę z probówki do nowej strzykawki o pojemności 1 mL. Podłącz każdą strzykawkę do portu załadowania i wtłocz roztwór do strzykawki napędowej.

Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza, ręcznie przesuwając roztwór między dwiema strzykawkami z przerwami. Następnie opuść płytę napędową, aż zetknie się ona z górną częścią strzykawek napędowych. W celu rozpoczęcia zbierania danych otwórz okno ustawiania kanałów czasu.

Wybierz tryb kanału zbierania danych dla analizy danych oraz liczbę śladów do zebrania. Wprowadź czas zbierania danych, w trakcie którego zostanie zebranych 1000 punktów danych. Następnie ustaw zawór w pozycji otwartej i kliknij przycisk zbierania danych.

Ta czynność inicjuje mieszanie mieszaniny dwa, mieszaniny sześć oraz DNA, po czym reakcja zostaje wprowadzona do komory obserwacyjnej. Monitorowana jest emisja fluorescencji komórkowej z 2-aminopuryny. Należy zebrać co najmniej pięć śladów kinetycznych, aby uzyskać wysokiej jakości zestaw danych, a następnie zapisać plik po zakończeniu eksperymentu.

Otwórz każdy plik danych i wyciągnij średnią z wielu krzywych kinetycznych. Następnie zapisz plik ze średnią i wyeksportuj go do programu graficznego w celu przeprowadzenia analizy. Na koniec wyłącz lampę, a strzykawki oraz celę obserwacyjną dokładnie wypłucz wodą.

Następnie wyłącz pozostały sprzęt z wyjątkiem cyrkulacyjnej łaźni wodnej. Pozostawia się ją włączoną przez dodatkowe 15 minut w celu schłodzenia lampy. Dane kinetyczne dla wiązania mush two mush six z niedopasowanym DNA najlepiej opisuje pojedyncza funkcja wykładnicza, która daje szybką szybkość asocjacji rzędu 10⁷ M⁻¹s⁻¹; analogiczne eksperymenty z metodą stopped flow pozwalają wyznaczyć szybkość dysocjacji kompleksu mush two mush six z niedopasowanym DNA, która przebiega bardzo powoli, w zakresie 0,01 do 0,02 s⁻¹.

Wyniki te stanowią bezpośredni pomiar szybkości i powinowactwa, z jakim MutS2-MutS6 wiąże niedopasowaną parę zasad podczas reakcji naprawy DNA. W następnym kroku zostanie przeprowadzony eksperyment z użyciem przepływu zatrzymanego (stopped-flow), aby zmierzyć aktywność ATPazy kompleksu MutS2-MutS6.

W warunkach stanu przedstacjonarnego dla tego testu absolutnie niezbędne jest unikanie stosowania szkła na wszystkich etapach przygotowania odczynników, w tym podczas oczyszczania białek i DNA, aby zminimalizować tło fosforanowe. Jako reporter do pomiaru uwalniania fosforanu po hydrolizie TP wykorzystuje się białko wiążące fosforan (PBP), które zostało oczyszczone z E. coli i znakowane fluoroforem MDCC. MDCC-PBP jest niezawodnym reporterem hydrolizy ATP i kinetyki uwalniania fosforanu w stanie przedstacjonarnym. Wiąże on fosforan szybko i z wysokim powinowactwem, co skutkuje znacznym wzrostem fluorescencji MDCC.

Przygotuj próbkę zawierającą 4 µM mush oraz 2 mush 6 protein z dodatkiem lub bez dodatku 6 µM niedopasowanego DNA. Przygotuj kolejną próbkę zawierającą 1 mM świeżo rozpuszczonego HEP oraz 20 µM M-D-C-C-P-V-P w celu usunięcia zanieczyszczającego fosforanu. Do próbek dodaj purynonukleozydofosforylazę oraz 7-metyloguaninę, a następnie inkubuj w lodzie przez co najmniej 20 minut.

Przygotuj aparat do pomiarów z zatrzymanym przepływem (stopped-flow) zgodnie z wcześniejszym opisem. Dodatkowo usuń wszelkie zanieczyszczenia fosforanowe z tłoków napędzających za pomocą puryny, nukleozydów, grup fosforylowych oraz siedmiometyloguaniny. Inkubuj przez 20 minut. Ustaw długość fali wzbudzenia na 425 nanometrów i użyj filtra odcinającego 450 nanometrów z PMT do detekcji fluorescencji M-D-C-C-P-B-P.

Napełnij strzykawki napędowe próbkami zgodnie z wcześniejszym opisem. Ustaw parametry zbierania danych i kliknij „zbierz dane”, aby zmieszać mush two mush six z TP i M-D-C-C-P-B-P; monitoruj uwalnianie fosforanu przez mush two mush six oraz powiązany wzrost fluorescencji M-D-C-C-P-P-P w czasie. Zbierz co najmniej pięć śladów kinetycznych, aby uzyskać wysokiej jakości zestaw danych, a następnie zapisz plik, uśrednij wiele śladów kinetycznych i wyeksportuj plik z danymi do analizy zgodnie z wcześniejszym opisem. Przygotuj krzywą kalibracyjną w celu określenia liniowej zależności między stężeniem fosforanu a fluorescencją M-D-C-C-P-P-P; najpierw zmieszaj M-D-C-C-P-P-P z różnymi stężeniami fosforanu w tych samych warunkach eksperymentalnych w systemie stop-flow.

Następnie naniesie na wykres maksymalną fluorescencję M-D-C-C-P-P-P w funkcji poszczególnych stężeń fosforanu w celu sporządzenia krzywej kalibracyjnej i wykorzystaj nachylenie prostej do określenia stężenia fosforanu w reakcjach mush two mush six. Przedstaw stężenie fosforanu w funkcji czasu i dopasuj dane do funkcji wykładniczej oraz liniowej. Funkcja ta opisuje gwałtowny wyrzut ATP w stanie przedstacjonarnym i uwalnianie fosforanu, po których następuje liniowa faza stacjonarna reakcji. Dane kinetyczne wykazują, że mush two mush six hydrolizuje ATP i szybko uwalnia fosforan z szybkością 1,4 s⁻¹ w pierwszym cyklu katalitycznym.

Następnie następuje powolny etap reakcji, który ogranicza kolejne obroty do siedmiokrotnie wolniejszej stałej katalitycznej w stanie stacjonarnym wynoszącej 0,2 na sekundę. Jednakże, gdy MutS6 wiąże się z niedopasowanym DNA, gwałtowna hydroliza ATP i uwalnianie fosforanu zostają zahamowane. Wyniki te bezpośrednio wykazują, że po związaniu niedopasowanej pary zasad i DNA, MutS6 przechodzi w stan związany z ATP.

Przełączenie to jest krytycznym etapem reakcji naprawy DNA. Właśnie pokazaliśmy, jak użyć urządzenia do pomiarów stop-flow w celu zmierzenia kinetyki reakcji w czasie rzeczywistym. Takie pomiary poszerzyły naszą wiedzę na temat mechanizmu działania MASH two, MASH six oraz naprawy niedopasowań w DNA.

Przeprowadzając tego typu eksperymenty, należy pamiętać o stosowaniu odczynników wysokiej jakości, w tym bardzo czystego DNA i białek, oraz zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć zanieczyszczenia fosforanami w teście ATP. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.