optyczna mikroskopia rozproszenia oparta na dwuwymiarowych filtrach Gabora
2 czerwca 2010
Demonstrujemy metodę mikroskopii ciemnego pola opartą na filtrowaniu podobnym do Gabora do pomiaru dynamiki subkomórkowej w pojedynczych żywych komórkach. Technika ta jest wrażliwa na zmiany w strukturze organelli, takie jak fragmentacja mitochondriów.
W tym filmie mikroskopia rozproszenia optycznego jest używana do ilościowego określenia fragmentacji mitochondriów podczas apoptozy. Chociaż optyczna mikroskopia rozproszenia zwykle nie wymaga fluorescencji w tym protokole, obrazy fluorescencyjne będą pozyskiwane w celach walidacyjnych. Po skonfigurowaniu systemu obrazowania, komórki są znakowane zielonym trackerem MIT i traktowane zarodniką stor w celu wywołania apoptozy.
Dane optyczne są pozyskiwane w celu wykrycia zmian w orientacji organelli komórkowych w ciągu dwóch godzin. Początek fragmentacji mitochondriów można zmierzyć za pomocą danych rozproszonych optycznie, które wskazują na zmniejszenie stopnia orientacji cząstek subkomórkowych. Dane są następnie weryfikowane poprzez korelację rozproszonych danych optycznych z regionami fluorescencyjnymi zawierającymi mitochondria.
Cześć, nazywam się Nada Bustani i pracuję w Laboratorium Biooptyki na Wydziale Inżynierii Biomedycznej Uniwersytetu Rutgers. Nazywam się Rob Pak i pracuję w Bio Optics Lab, jestem też Deen i pracuję w Bio Lab. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę ilościowego określania subkomórkowej dynamiki morfologicznej przy użyciu metody, która nie opiera się na barwnikach fluorescencyjnych.
Używamy tej techniki w naszym laboratorium do badania dynamicznych zmian w strukturze subkomórkowej podczas apoptozy lub programowania śmierci komórki. Więc zacznijmy. Rozpocznij tę procedurę od sterylizacji rąk w rękawiczkach 70% etanolem.
Następnie umieść przygotowany 100 nanomolowy roztwór podstawowy miot tracker green i wstępnie ogrzanej pożywki do hodowli komórkowych BAEC w kapturze przy wyłączonym świetle i wysterylizuj wszystkie powierzchnie. Następnie umieść pod maską sześciodołkową miskę do hodowli z komórkami pokrytymi na szkle nakrywkowym. Za pomocą pipety do pasty podłączonej do przewodu próżniowego.
Usuń pożywkę komórkową z dołków. Następnie natychmiast dodaj dwa mililitry oznakowanego podłoża do każdej studzienki, aby oznaczyć komórki. Mitochondria. Przykryj płytkę do hodowli tkankowej, aby zapobiec ekspozycji na bezpośrednie światło w pomieszczeniu i szybko umieść komórki z powrotem w inkubatorze.
Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, podczas gdy komórki inkubują. Przygotuj konfigurację optyczną, najpierw włącz łuk rtęciowy clamp. Następnie włącz kamery mikroskopu komputerowego i podłącz laser do cyfrowego mikrolustra lub DMD w wirującym dyfuzorze.
Następnie spójrz przez okular mikroskopu, aby sprawdzić, czy start optyczny jest wyrównany. Pole widzenia powinno być jasno oświetlone światłem lasera. Aby załadować próbkę, umieść jedną lub dwie małe krople olejku immersyjnego na obiektywie zanurzeniowym 63 x w olejku, gdy jest on całkowicie opuszczony.
Następnie na stoliku zamontuj suwak składający się z siatki linii w regularnych odstępach 10 mikrometrów zwanych gradi i podnieś obiektyw tak, aby olej złapał go na ostrości. Następnie skoncentruj sześciokątną krawędź pola skraplacza. Zatrzymaj się, aby znalazł się w centralnym oświetleniu Kohlera.
Sześciokątna krawędź powinna być wyśrodkowana w okularze i ostro skupiona. Następnie za pomocą pokręteł położenia krańca pola skraplacza pośrodku, pole skraplacza zatrzymaj się nad polem view. Uruchom IP lab i wprowadź ustawienia, aby obsługiwać kamerę.
Upewnij się, że aparat jest ustawiony w trybie przesyłania klatek. Uruchom polecenie uzyskania fokusu, aby uruchomić podgląd na żywo. Następnie ustaw prefiks indeksu i lokalizację pliku, w którym obrazy zostaną zapisane.
Następnie zainicjuj obraz RS. Wyznacz ustawienia, aby obsługiwać fajny aparat do robienia zdjęć. Tryb taktowania powinien być ustawiony na normalny.
Uruchom oprogramowanie DMD. Umieść tęczówkę ciemnego pola w menu skryptu. Następnie kliknij załaduj i zresetuj.
Aby ręcznie uruchomić skrypt, ustaw pasek optiv mikroskopu w rzutni na LSM. Spowoduje to wysłanie obrazu przez DMD w wyrównanej optyce. Rzutowanie obrazu ciemnego pola na matrycę CCD kamery Cascade five 12.
Obraz ciemnego pola powinien pojawić się na podglądzie na żywo w laboratorium IP. W razie potrzeby ustaw ostrość obrazu na podglądzie na żywo. Ustaw czas naświetlania na tyle wysoki, aby zapewnić co najmniej 10 000 zliczeń sygnału na obrazie.
Następnie wykonaj migawkę pola widzenia za pomocą pojedynczego polecenia acquire po akwizycji. Użyj polecenia Zapisz jako indeksowany, aby zapisać obraz na dysku. Obraz GTI mierzy wielkość pola widzenia.
Teraz przesuń próbkę GTI tak, aby znalazła się poza polem widzenia i było widoczne tylko tło. Uchwyć obraz tła pola z czasem naświetlania wystarczającym do uzyskania co najmniej 5 000 zliczeń. Ten obraz pomoże w odejmowaniu tła od niefiltrowanych obrazów.
Teraz, aby uzyskać przefiltrowane obrazy tła Gabora, załaduj skrypt Gabor Filter Bank do oprogramowania sterującego DMD. Uruchom cały skrypt, aby zbuforować filtry do wbudowanej pamięci DMD. Może to potrwać kilka minut po zbuforowaniu całego skryptu.
Użyj znaczników start i stop w oprogramowaniu DMD, aby upewnić się, że w danym momencie ładowany jest tylko jeden zestaw filtrów odpowiadający jednemu filtrowi Gabor Like. Uruchom skrypt, aby uzyskać przefiltrowane obrazy tła. Podgląd obrazu na żywo powinien zmienić się z ciemnego pola na przefiltrowany obraz.
Dla tego filtru otwórz skrypt akwizycji w laboratorium własności intelektualnej z dysku. Dostosuj czas ekspozycji, aby upewnić się, że uzyskano co najmniej 2000 zliczeń. Gdy skrypt DMD jest uruchomiony, anuluj podgląd na żywo w laboratorium IP i uruchom skrypt akwizycji.
Spowoduje to automatyczne pobranie, indeksowanie i zapisanie przefiltrowanego obrazu na dysku. Po pobraniu pierwszego obrazu zatrzymaj skrypt uruchomiony w DMD. Usuń użyte polecenia ze skryptu.
Następnie wymień znaczniki start i stop na początku i na końcu następnego zestawu filtrów. Powtarzaj akwizycję w laboratorium IP, aż cały bank filtrów zostanie wykorzystany, a wszystkie przefiltrowane obrazy zostaną pobrane i zapisane. Przygotuj się do płytki ogniw, podłączając lutownicę na stole laboratoryjnym i podgrzewając medium L 15 do 37 stopni Celsjusza.
Zrób stację roboczą z ręcznikiem papierowym i chusteczką Kim, aby wchłonąć rozlane medium i utrzymać obszar w czystości. Przygotuj kilka, rozrywając i obracając chusteczki kimm. będą służyły do przeciągania płynu przez płytkę ogniwa.
Następnie użyj metalowego uchwytu na próbkę, aby stworzyć kanapkę z komórkami. Za pomocą strzykawki nałóż cienką kulkę smaru próżniowego wokół górnego obwodu otworu w obrabianej metalowej płycie, rozciągając się mniej więcej w połowie do końców rowków po każdej stronie. Delikatnie przełóż czystą szkiełko nakrywkowe numer jeden na smar.
Odwróć płytkę i nałóż smar wokół otworu. Wyłącz światła w pokoju, zakładając rękawice próbne NI sterylizowane etanolem. Pobrać komórki z inkubatora.
Usuń szkiełko nakrywkowe, które będzie używane w eksperymencie, z płytki sześciodołkowej. Ostrożnie osusz szkiełko nakrywkowe. Następnie wciśnij komórkę szkiełka nakrywkowego do dołu w natłuszczoną metalową płytkę nad viewotwór.
Umieszczanie komórek na płytce. Upewnij się, że nie pozostały żadne szczeliny powietrzne i że smar utworzył wodoszczelne uszczelnienie, aby można było załadować medium. Teraz odwróć płytkę z powrotem, pipetując jednorazowo 200 mikrolitrów.
Dodaj wstępnie ciepłe podłoże L 15 do kanapki przez rowek między górnym szkiełkiem nakrywkowym a metalową płytką, aż płyn prawie dotrze do rowka po drugiej stronie. Następnie umyj komórki, przytrzymując w przeciwległym rowku i odpipetując dodatkowe 200 mikrolitrów pożywki do kanapki. Medium będzie przepływać z jednej strony na drugą, gdy usuwa stare medium.
Na tym etapie należy uważać, aby w cieczy nie tworzyły się pęcherzyki. Powtórz ten proces dwa do trzech razy, używając nowego do każdego płukania. Teraz ponownie odwróć płytkę, podtrzymując płytkę od krawędzi, tak aby uwięzić ciecz w zbiorniku komórki.
Zanurz lutownicę w zlewce veap, aby szybko stopić część żyłki, która następnie przylgnie do końcówki lutownicy. Za pomocą końcówki lutownicy ostrożnie nałóż żyłkę liniejącą wokół krawędzi dolnego szkiełka nakrywkowego. Kontynuuj zanurzanie i nakładanie na całym obwodzie szkiełka nakrywkowego, uszczelniając je do metalowej płytki.
Tworzy to dobre uszczelnienie mechaniczne, dzięki czemu szkiełko nakrywkowe nie odrywa się od płyty podczas jej oglądania. Usuń wszelkie pozostałości od spodu. Pokryj powierzchnię ślizgu, wycierając chusteczkę kim i czyszcząc okładkę.
Przesuń jednym ruchem przesuwnym, aby upewnić się, że szkiełko nakrywkowe jest najczystsze pośrodku, w którym będzie view. Umieść płytkę z sześcioma ściankami z powrotem w inkubatorze. Zabierz platerowane ogniwa do laboratorium optycznego i zamontuj na obiektywie.
Tak jak poprzednio, znajdź pole zdrowo wyglądających komórek i uzyskaj obraz pola widzenia w ciemnym polu. Następnie ustaw mikroskop w trybie DIC i upewnij się, że czasy naświetlania są odpowiednie. Uzyskaj obraz DIC za pomocą kamery kaskadowej.
W tej konfiguracji obrazy fluorescencyjne są rejestrowane za pomocą chłodnej kamery SNAP, podczas gdy mikroskop jest nadal ustawiony w trybie DIC. Ustaw kąt VAR mikroskopu na jeden x, a rzutnię na 100% lornetkę i przekieruj obraz z okularu do kamery. Umieść niebieską diodę LED nad skraplaczem, aby oświetlić pole.
Następnie wyświetl podgląd pola widzenia na obrazie RSS i dostosuj precyzyjną ostrość. W razie potrzeby pobierz obraz DIC i zapisz go na dysku. Zwróć uwagę, jak bardzo pole widzenia różni się od pola widzenia uzyskanego z kamery kaskadowej.
Obrazy te będą musiały zostać zarejestrowane podczas fazy analizy eksperymentu. Następnie przesuń kostkę filtra fluorescencyjnego na miejsce i uzyskaj obraz fluorescencyjny, na krótko włączając wzbudzenie fluorescencji za pomocą migawki mikroskopu, a następnie wyłącz ją, gdy tylko akwizycja zostanie zakończona. Aby zminimalizować fotowybielanie, zapisz obraz fluorescencji na dysku.
Aby uzyskać przefiltrowane obrazy, zresetuj mikroskop do pozycji pola i wyślij światło przez port LSM. Tak jak poprzednio, uruchom cały skrypt banku filtrów Gabora, tak jak poprzednio, aby zakończyć pobieranie danych dla jednego punktu czasowego, gdy komórki są nadal na stole montażowym i bez zakłócania pola widzenia. Użyj metody odprowadzania wilgoci, aby zamienić zwykłą pożywkę L 15 na taką samą, zawierającą jeden mikromolowy roztwór STS.
W trakcie eksperymentu należy dodać dodatkowe podłoże, aby zapobiec wysychaniu, poprzez pipetowanie pożywki do rowka płytki celi bez wyjmowania jej ze stolika lub zakłócania pola widzenia. Teraz powtarzaj te kroki dla kolejnych punktów czasowych, aż eksperyment zostanie zakończony. Zebrane dane będą zawierały dużą liczbę przefiltrowanych obrazów, które muszą zostać przetworzone w celu wyodrębnienia subkomórkowych danych strukturalnych.
Tutaj pokazane są dwa przykładowe eksperymenty. Rysunek ten przedstawia sekwencyjne obrazy próbki morskich glonów okrzemkowych. Zorientowane cechy są wyraźnie widoczne.
Obrazowanie w ciemnym polu. Optycznie przefiltrowane obrazy oznaczone jako pięć równa się zero stopni do pięciu równych 160 stopni są wyświetlane obok niefiltrowanego obrazu próbki. Dla porównania, zestaw dziewięciu przefiltrowanych obrazów okrzemki Gabora został przetworzony piksel po pikselu pod kątem orientacji obiektu.
Przy każdym pikselu maksymalny sygnał został podzielony przez sygnał średni w funkcji orientacji filtra, aby uzyskać wartość współczynnika proporcji. W tym przypadku współczynnik proporcji zbliżony do tego, który jest oznaczony kolorem niebieskim, występuje w obszarach, w których nie ma preferowanego kąta reakcji. Większe wartości oznaczone kolorem czerwonym wskazują obszary, w których występuje wyższa preferowana reakcja kątowa.
Jasność i znaczenie kodu całkowitej odpowiedzi filtra GABOR, orientacja filtra, dająca maksymalny sygnał w każdym pikselu, odpowiada kierunkowi prostopadłemu do orientacji obiektu znajdującego się poniżej. Orientacja cząstek podbudowy jest zakodowana na wykresie kołczanu, gdzie każda linia ściśle zgadza się z leżącą pod nią lokalną orientacją obiektu widoczną w niefiltrowanym ciemnym polu. Wykres kołczanu pokazuje orientację obiektów o intensywności odpowiedzi większej niż 10% maksimum.
Te ciemne pole i optycznie przefiltrowane obrazy pola zawierały żywe komórki śródbłonka bydła, przefiltrowane obrazy były następnie rejestrowane co 20 minut przez okres trzech godzin po leczeniu induktorem apoptozy stor sporin. Tutaj mapa proporcji w górnym panelu i obrazowanie fluorescencyjne mitochondriów w dolnym panelu są pokazane w funkcji czasu. Odcień koloru reprezentuje stopień orientacji, ponieważ wcześniej te wykresy czasowe porównują spadek stopnia orientacji proporcji cząstek w komórkach śródbłonka potraktowanych s thoro sporin, poszczególne ślady reprezentują wykresy czasowe w pojedynczych komórkach.
Orientacja drop-in jest ograniczona do regionów komórek, które rejestrują się z regionami fluorescencyjnymi. Teraz udało się przeprowadzić walidację pod kątem fluorescencji. Staje się archiwalny.
Tak więc w kolejnych eksperymentach pomiary mitochondrialne można wykonać, pomijając etapy obrazowania fluorescencyjnego i bezpośrednio stosując metodę rozpraszania optycznego. Właśnie pokazaliśmy, jak monitorować fragmentację mitochondriów podczas apoptozy za pomocą sygnatur rozpraszania światła opartych na filtrach Gabora. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby dobrze przygotować się do stylu życia i upewnić się, że konfiguracja optyczna jest dobrze wyrównana i skalibrowana.
Weźmy więc rozsądek do oglądania i eksperymentów z CoLab z interfejsem użytkownika.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie demonstruje metodę mikroskopii pola ciemnego wykorzystującą filtrowanie podobne do Gabora w celu oceny dynamiki subkomórkowej w żywych komórkach. Technika ta jest szczególnie wrażliwa na zmiany w strukturach organelli, takie jak fragmentacja mitochondriów podczas apoptozy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Techniki mikroskopowe
Tło
- Fragmentacja mitochondriów jest kluczowym wskaźnikiem apoptozy.
- Tradycyjne metody mikroskopowe często wymagają fluorescencji, co ogranicza ich zastosowanie.
- Mikroskopia rozpraszania optycznego zapewnia nieinwazyjną alternatywę.
- Zrozumienie dynamiki organelli jest kluczowe dla wnikliwej analizy zdrowia komórkowego.
Cel badania
- Ilościowa ocena fragmentacji mitochondriów przy użyciu mikroskopii rozpraszania optycznego.
- Walidacja danych optycznych technikami obrazowania fluorescencyjnego.
- Zgłębienie zrozumienia dynamiki subkomórkowej podczas apoptozy.
Zastosowanie metod
- Komórki oznakowane zielonym śledzikiem MIT.
- Leczenie stor sporin w celu indukcji apoptozy.
- Zbieranie danych optycznych w celu monitorowania orientacji organelli.
- Korelację danych optycznych z obrazami fluorescencyjnymi w celu walidacji.
Główne wyniki
- Mikroskopia rozpraszania optycznego skutecznie wykrywa fragmentację mitochondriów.
- Dane pokazują zmniejszenie orientacji cząstek subkomórkowych.
- Walidacja fluorescencyjna potwierdza dokładność pomiarów optycznych.
- Metoda zapewnia wgląd w dynamikę organelli podczas apoptozy.
Wnioski
- Metoda filtrowania podobna do Gabora zwiększa wrażliwość mikroskopii pola ciemnego.
- Ta technika może być zastosowana do badania różnych procesów komórkowych.
- Zrozumienie dynamiki mitochondriów jest niezbędne do opracowywania strategii terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Optical scatter microscopy using two-dimensional Gabor filters enables label-free quantification of subcellular structural dynamics, such as mitochondrial fragmentation during apoptosis, providing a non-invasive method to assess organelle morphology and function in living cells. This approach supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery by offering quantitative, reproducible readouts of subcellular changes that correlate with functional outcomes, without reliance on fluorescent labels or complex inverse scattering models. The technique’s compatibility with existing microscopy platforms and rapid screening capability facilitate translational continuity from discovery to preclinical studies, enhancing predictive confidence in pathway modulation and compound screening efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying organelle orientation changes as a functional readout of subcellular stress or death pathways.
- Operational Value: Provides label-free, live-cell compatible measurements that reduce experimental variability and support reproducible target engagement assessments.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking compound-induced morphological changes to apoptotic progression through correlatable optical signatures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative aspect ratio maps from Gabor-filtered images that serve as objective, high-content morphological parameters for compound screening.
- Operational Value: Enables rapid acquisition of filtered images across hundreds of cells without high sampling rates, supporting scalable assay formats.
- Assay Readiness: Outputs are derived directly from the object's field transform, avoiding discretization artifacts and enabling consistent, label-free morphological profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Correlates optical scatter data with fluorescent validation to establish a translatable biomarker of organelle dynamics applicable across model systems.
- Preclinical Utility: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing early, measurable indicators of compound-induced subcellular reorganization.
- Mechanistic Insight: Offers distinctive morphometric parameters that reflect organelle size, shape, and orientation without requiring theoretical scatter models for non-spherical structures.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling label-free assessment of subcellular dynamics from early hypothesis testing through lead optimization, where morphological changes serve as functional proxies for pathway modulation and cellular health.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying organelle orientation shifts linked to apoptosis and differentiation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs (e.g., aspect ratio, orientation maps) that enable comparison of compound effects across populations.
- Analytics: Provides statistical distributions of morphological parameters that help teams compare conditions and identify significant shifts in subcellular organization.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through correlatable optical and fluorescent signals, supporting biomarker alignment for organelle stress responses.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability on existing microscopes, reducing dependency on specialized fluorescence infrastructure.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct, label-free measurement of organelle dynamics.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via platform-agnostic implementation and minimal sample preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling early detection of subcellular changes that precede functional outcomes, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by providing objective, quantitative morphological data to inform advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical setup alignment, including laser illumination, DMD programming, and Kohler adjustment for optimal signal acquisition.
- Dependent on instrumentation capable of spatial light modulation (e.g., DMD) and synchronized image acquisition systems for sequential filter-based imaging.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition protocols, exposure times, and filter bank sequencing to ensure data comparability.
- Adaptation across model systems may require optimization of illumination intensity and filter parameters based on subcellular refractive index and scattering properties.
- Practical limitations include sensitivity to out-of-focus light and the need for stable environmental control during long-term live-cell imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:50
Introduction
1:26
Protocol
2:18
Preparing the Optical Setup
6:57
Plating the Cells
5:26
Loading the Filterbank and Using the Setup to Acquire Filtered-Background Images
9:44
Performing Optical Scatter Microscopy
11:53
Representative Images
14:28
Conclusion
