Name: optyczna mikroskopia rozproszenia oparta na dwuwymiarowych filtrach Gabora (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-02T17:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Poznaj mikroskopię rozproszenia optycznego z filtrowaniem Gabora do badania fragmentacji mitochondriów w żywych komórkach podczas apoptozy. Ta metoda umożliwia nieinwazyjną analizę dynamiki organelli.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Urządzenie z mikrolustrami wykorzystane w niniejszych badaniach zostało sfinansowane z grantu Whitaker Foundation RG-02-0682 przyznanego N. Boustany. Bieżące prace są finansowane z grantu NSF- DBI-0852857 przyznanego N. Boustany. R.M. Pasternack otrzymał częściowe wsparcie w ramach Rutgers Presidential Graduate Fellowship. Pragniemy również podziękować dr E. White za udostępnienie komórek iBMK wykorzystanych w naszych badaniach oraz dr D.N. Metaxas za pomocne dyskusje dotyczące strategii filtrowania optycznego.

<ol><li>Pasternack, R. M., Qian, Z., Zheng, J. -Y., Metaxas, D. N., White, E., Boustany, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Subcellular+Texture+by+Optical+Gabor-Like+Filtering+with+a+Digitial+Micromirror+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Measurement of Subcellular Texture by Optical Gabor-Like Filtering with a Digitial Micromirror Device.</a> Optics Letters. 33 (19), 2209-2211 (2008).</li>
<li>Pasternack, R. M., Qian, Z., Zheng, J. -Y., Metaxas, D. N., Boustany, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+size+discrimination+of+submicron+objects+using+optical+Fourier+filtering+based+on+two-dimensional+Gabor+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive size discrimination of submicron objects using optical Fourier filtering based on two-dimensional Gabor filters.</a> Optics Express. 17 (14), 12001-12012 (2009).</li>
<li>Zheng, J. -Y., Pasternack, R. M., Boustany, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+scatter+imaging+with+a+digital+micromirror+device%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Optical scatter imaging with a digital micromirror device.</a> Optics Express. 17 (22), 20401-20414 (2009).</li>
</ol>

Niektóre aspekty opisanych metod zostały zawarte w zgłoszeniu wynalazku, Rutgers University Docket # 09-049.

Opisana powyżej metoda pozwala na uzyskanie map morfometrycznych obiektu, które mogą kodować na przykład wielkość lub orientację cząstek. Te informacje strukturalne można wykorzystać na kilka sposobów:
<ol>
 <li>Można go wykorzystać jako wstępny screening w celu zidentyfikowania obszarów tkanek lub komórek, które ulegają zmianom podczas określonej terapii, a następnie poddać te obszary dalszej analizie za pomocą specyficznych testów molekularnych i biochemicznych.</li>
 <li>Można go stosować w połączeniu z fluor...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>DMEM z niską zawartością glukozy</td></tr><tr><td>Pożywka Liebowitz L15</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Bez czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Green</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z mózgu bydlęcego</td><td>Clonetics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gemini Bio Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Staurosporyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>DMD</td><td>Texas Instruments</td><td>TI 0.7 XGA DMD 1100</td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>Roper Scientific</td><td>Cascase 512B</td><td>CCD o wysokim zakresie dynamicznym (16 bit)</td></tr><tr><td>CCD</td><td>Roper Scientific</td><td>Coolsnap cf</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroskopia rozproszeniowa optyczna oparta na dwuwymiarowych filtrach gabora

Optical Scatter Microscopy Based on Two-Dimensional Gabor Filters

Prezentujemy instrument mikroskopowy, który pozwala na pomiar tekstury subkomórkowej wynikającej z morfologii i organizacji organelli w niebarwionych żywych komórkach. Proponowane urządzenie zwiększa czułość bezznakowej mikroskopii optycznej na nanoskalowe zmiany wielkości i kształtu organelli i może być wykorzystane do przyspieszenia badań nad związkiem między strukturą a funkcją w odniesieniu do dynamiki organelli leżącej u podstaw fundamentalnych procesów biologicznych, takich jak programowana śmierć komórki czy różnicowanie komórkowe. Mikroskop ten można łatwo zaimplementować na istniejących platformach mikroskopowych, dzięki czemu może on zostać udostępniony poszczególnym laboratoriom, w których naukowcy będą mogli wdrażać i stosować proponowane metody przy nieograniczonym dostępie.
Proponowana technika umożliwia charakteryzację struktur wewnątrzkomórkowych poprzez obserwację komórki za pomocą dwuwymiarowych optycznych filtrów Gabora. Filtry te mogą być dostrojone tak, aby z czułością nanometryczną (rzędu 10 nm) wykrywać specyficzne cechy morfologiczne związane z rozmiarem i orientacją niesferycznych organelli wewnątrzkomórkowych. Choć metoda ta opiera się na kontraście generowanym przez rozpraszanie sprężyste, nie wymaga ona szczegółowego modelu odwrotnego rozpraszania ani teorii Mie do wyznaczenia pomiarów morfometrycznych. Technika ta znajduje więc zastosowanie w przypadku organelli niesferycznych, dla których trudno jest podać precyzyjny teoretyczny opis rozpraszania, i dostarcza charakterystycznych parametrów morfometrycznych, które można uzyskać w niebarwionych żywych komórkach w celu oceny ich funkcji. Przewagą tej metody nad cyfrowym przetwarzaniem obrazu jest to, że operuje ona bezpośrednio na transformacie pola obiektu, a nie na dyskretyzowanej intensywności obiektu. Nie wymaga ona wysokiej częstotliwości próbkowania obrazu, co pozwala na szybki screening aktywności morfologicznej w setkach komórek jednocześnie, znacznie ułatwiając badanie struktury organelli poza zakresem pojedynczej segmentacji i rekonstrukcji organelli za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej obrazów cyfrowych o dużym powiększeniu i ograniczonym polu widzenia.
W niniejszej prezentacji przedstawiamy dane pochodzące z morskiej okrzemki, aby zilustrować zastosowaną metodologię. Prezentujemy również wstępne dane zebrane z żywych komórek, aby ukazać sposób zastosowania tej metody w odpowiednim kontekście biologicznym.

Prezentujemy metodę mikroskopii w ciemnym polu opartą na filtrowaniu typu Gabora do pomiaru dynamiki subkomórkowej w pojedynczych żywych komórkach. Technika ta jest czuła na zmiany w strukturze organelli, takie jak fragmentacja mitochondriów.

Mikroskopia rozproszeniowa optyczna oparta na dwuwymiarowych filtrach Gabora

Prezentujemy instrument mikroskopowy, który umożliwia pomiar tekstury subkomórkowej wynikającej z morfologii i organizacji organelli w niebarwionych żywych...

W tym filmie mikroskopia rozproszeniowa jest wykorzystywana do ilościowej oceny fragmentacji mitochondriów podczas apoptozy. Chociaż mikroskopia rozproszeniowa w ramach niniejszego protokołu zazwyczaj nie wymaga fluorescencji, obrazy fluorescencyjne zostaną wykonane w celu walidacji. Po skonfigurowaniu systemu obrazowania komórki zostaną znakowane barwnikiem MIT tracker green i poddane działaniu staurosporyny w celu indukcji apoptozy.Dane optyczne są pozyskiwane w celu wykrycia zmian w orientacji organelli komórkowych w ciągu dwóch godzin. Początek fragmentacji mitochondriów można zmierzyć przy użyciu danych o rozpraszaniu optycznym, które wykazują spadek stopnia orientacji cząstek podkomórkowych. Następnie dane są walidowane poprzez korelację danych o rozpraszaniu optycznym z fluorescencyjnymi obszarami zawierającymi mitochondria.Witam, jestem Nada Bustani z Laboratorium Bio-Optyki w Katedrze Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie Rutgers. Jestem Rob Pak z Laboratorium Bio-Optyki, a ja jestem Deen, również z Laboratorium Bio-Optyki. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę ilościowej analizy dynamiki morfologicznej struktur subkomórkowych przy użyciu metody, która nie opiera się na barw

optical-scatter-microscopy-based-on-two-dimensional-gabor-filters

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikroskopia optyczna oparta na dwuwymiarowym filtrze Gabora

Źródło: Espinoza, R., et al. Dwukolorowe, stymulowane w czasie rzeczywistym obrazowanie rozpraszania Ramana mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek. J. Vis. exp. (2022).  Film przedstawia dwukolorowe, stymulowane rozpraszanie Ramana (SRS) wycinków tkanki mózgowej myszy. Dwie zsynchronizowane wiązki laserowe są kierowane na przekrój tkanki w celu wzbudzenia drgań molekularnych, co powoduje względną zmianę intensywności wiązek. Lipidy i białka w tkance są wykrywane za pomocą różnych par...

Dwukolorowe, stymulowane obrazowanie rozpraszania Ramana tkanki mózgowej myszy

Prezentujemy nieniszczącą metodę próbkowania zmienności przestrzennej w kierunku światła rozproszonego z materiałów strukturalnie złożonych. Utrzymując materiał w stanie nienaruszonym, zachowujemy rozpraszanie w skali grubej, jednocześnie rejestrując precyzyjne wkłady kierunkowe za pomocą obrazowania o wysokiej rozdzielczości. Wyniki są wizualizowane w oprogramowaniu w biologicznie istotnych pozycjach i skalach.

Pomiar przestrzennego i kierunkowego rozpraszania światła od materiału biologicznego

Demonstrujemy metody wykrywania zniekształceń architektonicznych w poprzednich mammografach. Zorientowane struktury są analizowane za pomocą filtrów Gabora i portretów fazowych w celu wykrycia miejsc promieniowania wzorców tkankowych. Każde miejsce jest scharakteryzowane i sklasyfikowane za pomocą miar reprezentujących wzory spikulacyjne. Metody te powinny pomóc w wykrywaniu raka piersi.

Wykrywanie zniekształceń architektonicznych we wcześniejszych mammografiach poprzez analizę zorientowanych wzorców

Trójwymiarowe lokalizacje słabo rozpraszających obiektów mogą być jednoznacznie zidentyfikowane za pomocą cyfrowej mikroskopii holograficznej (DIHM), która obejmuje niewielką modyfikację standardowego mikroskopu.  Nasze oprogramowanie wykorzystuje prostą heurystykę obrazowania sprzężoną z propagacją wsteczną Rayleigha-Sommerfelda, aby uzyskać trójwymiarowe położenie i geometrię mikroskopijnego obiektu fazowego.

Cyfrowa mikroskopia holograficzna (DIHM) obiektów o słabym rozproszeniu

Opisujemy użycie standardowego mikroskopu optycznego do wykonywania ilościowych pomiarów masy, objętości i gęstości komórek poprzez kombinację jasnego pola i różnicowego kontrastu interferencyjnego.

Ilościowa mikroskopia optyczna: pomiar cech biofizycznych komórek za pomocą standardowego mikroskopu optycznego

Polimeryzacja wytrącająca bez mieszania zapewnia szybkie, powtarzalne podejście do prototypowania syntezy wrażliwych na bodźce mikrożeli poli(N-izopropyloakrylamidowych) o wąskim rozkładzie rozmiarów. W tej syntezie protokołu demonstruje się charakterystykę rozpraszania światła i śledzenie fluorescencji pojedynczych cząstek tych mikrożeli w mikroskopii szerokokątnej.

Kontrolowana synteza i śledzenie fluorescencji wysoce jednorodnych mikrożeli poli(N-izopropyloakrylamidowych)

Ten protokół opisuje implementację systemu mikroskopii optycznej z asymetrycznym wykrywaniem i rozciąganiem w czasie do obrazowania pojedynczych komórek w ultraszybkim przepływie mikroprzepływowym oraz jego zastosowania w obrazowaniu cytometrii przepływowej.

Obrazowanie mikroprzepływowe Cytometria przepływowa za pomocą mikroskopii optycznej z asymetrycznym wykrywaniem i rozciąganiem w czasie (ATOM)

Ogólnym celem tej metodologii jest zapewnienie optymalnych warunków eksperymentalnych od przygotowania próbki do akwizycji i rekonstrukcji obrazu, aby umożliwić wykonanie dwukolorowych obrazów 2D dSTORM mikrotubul i pośrednich włókien w stałych komórkach...

Obrazowanie pośrednich włókien i mikrotubul za pomocą 2-wymiarowej bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej

Przeciwciała, które wiążą się z docelowymi receptorami na powierzchni komórki, mogą powodować zmiany konformacji i grupowania. Te dynamiczne zmiany mają implikacje dla charakterystyki rozwoju leków w komórkach docelowych. Protokół ten wykorzystuje mikroskopię konfokalną i spektroskopię korelacji obrazów za pomocą ImageJ/FIJI w celu ilościowego określenia zakresu grupowania receptorów na powierzchni komórki.

Mikroskopia konfokalna ujawnia agregację receptorów na powierzchni komórki za pomocą spektroskopii korelacji obrazu

W tym protokole przedstawiamy elementy projektu koncepcyjnego i rozwój strukturalny aparatu do pomiaru ostrości olśnienia. Dodatkowo opisano konstrukcję urządzenia do pomiaru dodatnich dysfotopsji (aureole, szprychy) oraz dwupunktowych progów świetlnych.

Pomiar behawioralnych skutków rozproszenia wewnątrzgałkowego

Ten artykuł przedstawia metodę analizy czasoprzestrzennej mobilnych, jednocząsteczkowych sond opartych na transferze energii rezonansu Förstera (smFRET) przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. Nowo opracowany zestaw narzędzi programowych umożliwia wyznaczanie śladów czasowych smFRET poruszających się sond, w tym prawidłowej wydajności FRET i pozycji molekularnych, jako funkcji czasu.

Zautomatyzowana dwuwymiarowa analiza czasoprzestrzenna mobilnych jednocząsteczkowych sond FRET

Poznaj mikroskopię rozproszenia optycznego z filtrowaniem Gabora do badania fragmentacji mitochondriów w żywych komórkach podczas apoptozy. Ta metoda umożliwia nieinwazyjną analizę dynamiki organelli.

Mikroskopia rozproszeniowa optyczna oparta na dwuwymiarowych filtrach Gabora

Przeglądaj więcej filmów