Przeszczepianie blastomerów wykazujących ekspresję GFP w celu obrazowania na żywo rozwoju siatkówki i mózgu w zarodkach chimerycznych danio pręgowanego

Blairy to komórki embrionalne powstające w fazie rozszczepienia rozwoju. W tym przypadku Blairy oznaczone GFP są przenoszone z jednego zarodka danio pręgowanego do drugiego za pomocą igły do przeszczepu. Metoda ta pozwala na śledzenie zachowania i losu bluźnierców ze zmienionym tłem genetycznym w normalnym zarodku lub odwrotnie za pomocą obrazowania mikroskopowego na żywo.

Cześć, nazywam się dr Zoran, pracuję w laboratorium dr Shawe na Wydziale Okulistyki Uniwersytetu w Pittsburghu. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę transportu mial piersi u danio pręgowanego embr. Używamy tej procedury w naszym laboratorium do badania siatkówki i rozwoju mózgu.

Więc zacznijmy. Wieczorem ustaw krzyżówki zegnębionego parami, aby zapobiec przypadkowemu kryciu. Przed pożądanym czasem użyj przegródek, aby oddzielić samicę i samca ryby. Tu.

Ryby transgeniczne wykazujące ekspresję GFP są wykorzystywane jako źródło blastomerów dawcy. Linia transgeniczna PT 1 0 4 wykazuje ekspresję GFP wszechobecnie pod kontrolą promotora EF jeden w celu przygotowania studni agros, które pomieszczą zarodki, wlej stopiony 1% agros przygotowany w wodzie z jaj E trzy do szalki Petriego. Unieś plastikową formę z wypukłościami w kształcie klina na roztworze agros.

Następnie pozwól mu ostygnąć. Aby dokładnie zestalić, usuń pleśń i zanurz grządkę agros w wodzie E trzy. Następnie przygotuj igły do przeszczepu.

Użyj pionowego ściągacza igieł przy ustawieniu mocy 11.5, aby wyciągnąć szklane pipety kapilarne. Dobre końcówki igieł powinny zwężać się z długimi trzonkami. Szlifować końcówki igieł pod kątem 45 stopni za pomocą mikroszlifierki, aż do uzyskania skośnych otworów o średnicy wewnętrznej od 30 do 40 mikrometrów.

Aby oczyścić końcówki igły, przymocuj wąż do końca, podłącz wąż do strzykawki, a następnie zassaj i uwolnij 10% roztwór kwasu fluorowodorowego. Dopóki wszystkie widoczne zanieczyszczenia nie zostaną usunięte. Umyj końcówki wodą destylowaną.

Następnie 100% etanolem wysusz igły na powietrzu, aż cały etanol wyparuje. Ważne jest, aby upewnić się, że końcówki są całkowicie suche. Resztki etanolu zniszczą igły podczas polerowania w wysokiej temperaturze.

Krok drugi, aby zmiękczyć i wypolerować szorstkie krawędzie końcówek igieł, upiecz je z ciepłem wytwarzanym przez filament mikro fałszerza. Nie pozwól, aby końcówki igły dotykały filamentu podczas polerowania ilości energii elektrycznej przechodzącej przez filament i odległości między filamentem a igłą. Końcówki można regulować, aby uzyskać pożądane warunki grzewcze.

Temperatura nie powinna być zbyt wysoka. Spowoduje to stopienie i zdeformację końcówek igieł po wygładzeniu szorstkich krawędzi. Ostrożnie dotknij rozgrzanego filamentu końcówką igły, a następnie delikatnie odciągnij filament, aby uzyskać spiczasty koniec.

Ostra, gładka i czysta igła ma kluczowe znaczenie dla uzyskania nienaruszonych blasterów dawcy bez uszkadzania zarodków gospodarza. Przeciągnij szklaną pipetę nad płomieniem gazowym, aby uzyskać cienką szklaną sondę z wygładzonym końcem. Sonda ta będzie używana do ustawiania zarodków we właściwej orientacji przed przeszczepem.

W dniu eksperymentu usuń przegrody w kasetach krzyżowych, aby umożliwić rybom łączenie się w pary. Osiem. Po 30 minutach zbierz od 100 do 200 zarodków, wlewając je do siatki. Umieść zarodki na szalce Petriego wypełnionej wodą E3.

Następnie za pomocą cienkich kleszczy usuń zarodki coate, ręcznie odrywając COR. Następnie za pomocą szklanej pipety z wygiętym trzonkiem ostrożnie przenieś powlekane zarodki do dołków aros. Nie pozwól, aby zarodki miały kontakt z powietrzem, ponieważ spowoduje to ich pęknięcie.

Pozwól zarodkom rozwijać się w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza w dołkach aros do trzech godzin po zapłodnieniu lub HPF, podczas gdy zarodki się rozwijają. Skonfiguruj aparat do przeszczepu, podłączając igłę do przeszczepu do systemu mikropompowania wypełnionego olejem mineralnym. Upewnij się, że system nie przecieka i nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza.

Wypełnij całą igłę do przeszczepu olejem mineralnym, z wyjątkiem 0,5 do jednego mikrolitra przestrzeni przy otworze końcówki. Wyjmij zarodki z inkubatora i umieść je na stoliku pod mikroskopem, aby przeszczepić bluźnierstwo. Użyj szklanej sondy pozycjonującej, aby ustawić bluźnierczą stronę trzech do czterech zarodków HPF w górę.

Następnie delikatnie włóż igłę do przeszczepu do zarodka dawcy i powoli zassaj od pięciu do 20 bluźnierstw do igły, upewniając się, że końcówka igły nie styka się z powietrzem podczas przeszczepu. Włóż igłę wypełnioną bluźnierstwem do zarodka gospodarza i powoli uwalniaj bluźnierstwo. Miejsce, w którym bluźniercy zostaną uwolnieni, wpłynie na to, gdzie ich potomstwo lokalizuje się w późniejszych stadiach rozwoju, aby przeanalizować rozwój siatkówki i mózgu uwalniające komórki na biegunie zwierzęcym.

Jeżeli ma być analizowany rozwój innych tkanek i narządów, należy odpowiednio rozważyć różne miejsca uwolnienia. Aby zminimalizować uszkodzenia mechaniczne podczas przeszczepu, zarodki gospodarza pozostawia się w studzienkach rolniczych w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza do następnego dnia. Następnie przenieś zarodki mozaiki na 24-dołkowe płytki wstępnie pokryte 0,5 mililitra 1% aros i wypełnione jednym mililitrem wody z trzech jaj E.

Do każdej studzienki należy dodać jeden zarodek, aby zapobiec infekcjom bakteryjnym w 10 mikrolitrach 100 x penicylina i streptomycyna. Do każdego z nich dobrze odważ i przygotuj aros o niskiej temperaturze topnienia lub LMP i trzymaj roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 30 stopni Celsjusza. Przenieś zarodek mozaiki do naczynia floryzowego z dnem ze szkła o grubości 0,17 milimetra.

Usuń nadmiar wody E 3, aby zarodek pozostał przykryty. Następnie w ilości od 30 do 50 mikrolitrów stopionego 1,5% LMP szybko do zarodka, zanim roztwór ARO zestali. Umieść oko lub mózg jak najbliżej szklanego dna.

Po ostygnięciu roztworu dodaj dodatkowy roztwór agros, aby jeszcze bardziej zabezpieczyć zarodki na miejscu. Zanurz zestalony blok agros w dwóch do trzech mililitrach wody jajecznej E trzy do mikroskopii konfokalnej. Używany jest odwrócony obiektyw 40 razy zanurzony w wodzie z dużą głębokością ostrości.

Dodaj kroplę wody na obiektyw i umieść na scenie naczynie do hodowli tkankowej na naczyniu z roślinami i skup się w celu wywołania obrazu. Wykonaj obrazowanie poklatkowe, robiąc zdjęcia zarodków co pięć minut. W zależności od charakteru eksperymentów odstępy czasu między ujęciami można dostosowywać.

Tutaj pokazano reprezentatywny obraz ryby seber o mocy 24 HPF. Wyrażenie GFP podświetla komórki dawcy na zielono. Komórki nabłonka nerwowego siatkówki obejmują całą grubość ściany siatkówki.

Ten film pokazuje ruchy komórek dawcy w mózgu gospodarza przy 24 HPF. Zauważ, że morfologie komórek zmieniają się w czasie. Po prostu pokaż, jak wykonać transport lusterka piersi u danio pręgowanego.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o delikatnym przygotowaniu dobrej igły w obszarze przeszczepionej piersi. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymencie.