Name: Przeszczepianie blastomerów wykazujących ekspresję GFP w celu obrazowania na żywo rozwoju siatkówki i mózgu w zarodkach chimerycznych danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Poznaj metodę przeszczepiania blastomerów GFP w zarodkach danio pręgowanego do obrazowania na żywo rozwoju siatkówki i mózgu. Technika ta umożliwia śledzenie zachowania komórek o zmienionym genotypie w normalnym kontekście rozwojowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to było wspierane przez grant podstawowy National Institutes of Health (NIH) (5P30EY008098) oraz następujące fundusze przyznane X.W.: grant NIH R01EY016099 oraz Research to Prevent Blindness Career Development Award. Dziękujemy Kirze Lathrop za pomoc w obrazowaniu konfokalnym.

Dzień 1. Przygotowanie
1. Przygotowanie krzyżówek ryb
Wieczorem przygotuj pary ryb danioślepych do krzyżowania. Aby zapobiec przypadkowemu kopulowaniu przed wyznaczonym czasem, użyj przegród w kasetach do rozdzielenia samicy i samca. Ryby transgeniczne wykazujące ekspresję GFP służą jako źródło blastomerów dawcy. Wykorzystana w tej procedurze linia transgeniczna pt104 (Zou et al., 208) wykazuje powszechną ekspresję GFP pod kontrolą promotora EF1. Ekspresja GFP umożliwia wizualizację komórek dawcy za pomocą obrazowania na żywo. W zależności od specyficznych potrzeb można zastosować inne linie ryb transgenicznych wykazujące ekspresję odpowiednich białek fluorescencyjnych.
2. Przygotuj klinowe dołki w agarozie do unieruchomienia zarodków
Wlej roztopioną 1% agarozę, przygotowaną w wodzie jajowej E3 (Westerfield, 207), do szalki Petriego. Umieść na powierzchni roztworu agarozy plastikową formę z wypustkami w kształcie klinów i poczekaj, aż roztwór całkowicie zestaleje. Ostrożnie usuń formę i zanurz podłoże agarowe w wodzie E3.
3. Przygotuj igły do transplantacji
Użyj pionowego wyciągacza igieł (David KOPF Instruments) przy ustawieniu mocy 1,5, aby wykonać igły poprzez wyciąganie szklanych pipet kapilarnych (World Precision Instrument). Prawidłowe końcówki igieł powinny być zwężone i posiadać długie trzpienie. Szlifuj końcówki igieł pod kątem 45 stopni za pomocą mikro-szlifierki (Marishige), aż do uzyskania skośnych otworów o średnicy wewnętrznej 40-45μm (Ryc. 1A). Aby oczyścić końcówki igieł, podłącz wąż do tępego końca igły, a następnie podłącz wąż do strzykawki i zasysaj oraz wypuszczaj 10% roztwór kwasu fluorowodorowego, aż do usunięcia wszystkich widocznych zanieczyszczeń. Następnie przemyj końcówki wodą destylowaną, a potem 100% etanolem. Susz igły na powietrzu, aż cały etanol odparuje. Ważne jest upewnienie się, że końcówki są całkowicie suche: pozostały etanol zniszczy igły podczas etapu polerowania w wysokiej temperaturze. Aby zmiękczyć i wypolerować szorstkie krawędzie końcówek igieł, podgrzewaj je ciepłem generowanym przez włókno mikro-kuźni (Marishige). Podczas polerowania nie dopuszczaj do kontaktu końcówek igieł z włóknem. Ilość prądu przepływającego przez włókno oraz odległość między włóknem a końcówkami igieł można regulować, aby uzyskać pożądane warunki nagrzewania. Temperatura nie powinna być zbyt wysoka, ponieważ spowoduje to stopienie i odkształcenie końcówek igieł. Po wygładzeniu szorstkich krawędzi ostrożnie dotknij rozgrzanego włókna końcówką igły, a następnie delikatnie odsuń włókno od igły, aby uformować ostry koniec (Ryc. 1B). Ostra, gładka i czysta igła jest kluczowa dla uzyskania nienaruszonych blastomerów dawcy i uniknięcia uszkodzenia embrionów biorcy.
4. Przygotuj sondę do pozycjonowania zarodka
Wypal szklaną pipetę nad płomieniem gazowym, aby uzyskać cienką szklaną sondę z wygładzonym końcem. Sonda ta będzie służyć do ustawiania embrionów w odpowiedniej orientacji przed transplantacją.
Dzień 2. Transplantacja blastomerów
1. Zebranie i dechorionizacja embrionów
Następnego dnia należy usunąć przegrody w kasetach krzyżowych, aby umożliwić rybom rozmnażanie. Zarodki należy umieścić w szalce Petriego wypełnionej wodą E3. Następnie należy przeprowadzić dechorionację zarodków, ręcznie oddzielając choriony od zarodków za pomocą precyzyjnej pęsety. Do ostrożnego przeniesienia zdechorionowanych zarodków do otworów w agarozie należy użyć szklanej pipety z wygiętą końcówką. Należy unikać kontaktu zarodków z powietrzem, co mogłoby spowodować ich pęknięcie. Zarodki powinny rozwijać się w otworach w agarozie w temperaturze 28.5 °C do 3 godziny po zapłodnieniu (hpf).
2. Przygotuj aparat do transplantacji
Podczas rozwoju embrionów przygotuj aparat do transplantacji, łącząc igłę transplantacyjną z systemem mikropompowym wypełnionym olejem mineralnym. Upewnij się, że system nie przecieka i że w jego wnętrzu nie znajdują się pęcherzyki powietrza. Wypełnij całą igłę transplantacyjną olejem mineralnym, z wyjątkiem przestrzeni o objętości 0,5 - 1 μl przy otworze końcowym.
3. Transplantacja blastomerów
Aby przeprowadzić transplantację blastomerów, należy użyć szklanej sondy pozycjonującej, aby ustawić embriony w wieku 3-4 hpf stroną z blastomerami do góry. Następnie delikatnie wprowadź igłę transplantacyjną do embrionu dawcy i powoli zaciągnij do niej od 5 do 20 blastomerów. Wprowadź wypełnioną blastomerami igłę do embrionu biorcy i powoli je uwolnij. Miejsce, w którym uwolnione zostaną blastomery, wpłynie na lokalizację ich potomstwa w późniejszych etapach rozwoju. Aby analizować rozwój siatkówki i mózgu, uwolnij komórki w biegunie zwierzęcym. Podczas transplantacji upewnij się, że końcówka igły nie ma kontaktu z powietrzem. Aby zminimalizować uszkodzenia mechaniczne, embriony biorców należy pozostawić w dołkach agarowych w temperaturze 28,5 °C do następnego dnia. Następnie przenieś mozaikowe embriony na płytki 24-dołkowe uprzednio pokryte 0,5 ml 1% agarozy, umieszczając jeden embrion w każdym dołku. Do każdego dołka dodaj 1 ml wody E3 do jaj. Aby zapobiec infekcjom bakteryjnym, dodaj do wody E3 10 μl 10X penicyliny i streptomycyny.
Dzień 3. Osadzanie i obrazowanie na żywo embrionów mozaikowych
1. Osadzanie embrionów
Przygotować 1,5% agarozę niskotopliwą (LMP) w wodzie jajecznej E3 i utrzymywać roztwór w kąpieli wodnej o temperaturze 30 °C. Przenieść embrion mozaikowy do naczynia do hodowli tkankowej FluoroDish ze szklanym dnem o grubości 0,17 mm (World Precision Instruments). Usunąć nadmiar wody E3, pozostawiając embrion przykryty jedynie minimalną ilością E3. Dodać 30-50 μl roztopionej 1,5% LMP do embrionu. Szybko ustawić oko lub mózg jak najbliżej szklanego dna, zanim roztwór agarozy stężeje. Po ostygnięciu roztworu dodać kolejną porcję roztworu agarozy, aby dodatkowo unieruchomić embriony w miejscu. Następnie zalać stężały blok agarozy 2-3 ml wody jajecznej E3.
2. Obrazowanie konfokalne
Do mikroskopii konfokalnej wykorzystuje się odwrócony obiektyw z imersją wodną (Olympus, PlanApo, 40 X/0.90 WLSM, Japonia) o dużej głębokości ostrości. Na obiektyw nanosi się kroplę wody, a następnie umieszcza na nim naczynie do hodowli tkankowej FluoroDish. Aby obrazować rozwój, wykonuje się obrazowanie poklatkowe, wykonując zdjęcia embrionów co 5 minut. W zależności od charakteru przeprowadzanych doświadczeń należy dostosować odstępy czasowe między ujęciami.
Reprezentatywne wyniki
Rysunek 2 przedstawia reprezentatywną mozaikową rybkę danio pręgowaną w 24. godzinie rozwoju (24-hpf). Ekspresja GFP zaznacza komórki dawcy na zielono. Neuroepithelialne komórki siatkówki obejmują całą grubość ściany siatkówki.
Film przedstawia ruchy komórek dawcy w mózgu gospodarza w 24 hpf. Zwróć uwagę, że morfologia komórek zmienia się w czasie.
<img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig1.jpg" alt="Porównanie końcówek mikroigieł w mikroskopii; A przedstawia ostrą końcówkę, B przedstawia stępioną końcówkę do penetracji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Kształty końcówek igieł transplantacyjnych. A. Skośny otwór końcówki igły był wolny od zanieczyszczeń po przemyciu kwasem fluorowodorowym. B. Na końcówce igły uformowano ostry koniec.
<img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig2.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej zarodków rybki zebrafish; znakowanie neuronów GFP; detekcja fluorescencji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rycina 2.Wizualizacja komórek donora wykazujących ekspresję GFP w chimerycznych embrionach danio pręgowanego w 24. godzinie po zapłodnieniu (hpf). Panel lewy przedstawia sygnały GFP w mózgu i siatkówce. Panel środkowy to obraz embrionu wykonany w świetle przechodzącym. Panel prawy przedstawia obraz scalony.
Film 1. Obrazowanie na żywo komórek donora pozytywnych pod kątem GFP wykazało rozległe zmiany w morfologii neuroepitelialnych komórek mózgu podczas rozwoju. Pojedyncze klatki filmu były rejestrowane co 5 minut między 24 a 25 hpf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1924/1924_Wei_Movie1.wmv">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film</a>.

<ol><li>Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+RPE+maintained+by+Nok+is+essential+for+retinal+epithelial+polarity+and+cellular+patterning+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%22">THE ZEBRAFISH BOOK</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Ho, R. K., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+action+of+zebrafish+spt-1+mutation+in+specific+mesodermal+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors.</a> Nature. 348, 728-730 (1990).</li>
<li>Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+dou+yan+Mutation+Causes+Patterning+Defects+and+Extensive+Cell+Death+in+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina.</a> Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).</li>
</ol>

W niniejszym filmie prezentujemy metodę transplantacji blastomerów w celu analizy rozwoju siatkówki i mózgu u danio pręgowanego. Protokół ten można również wykorzystać do analizy rozwoju innych tkanek i narządów, przenosząc blastomery dawcy w odpowiednie miejsca w embrionach biorcy. Znakowanie cząsteczkami GFP zapewnia czystsze tło niż znakowanie dekstranem sprzężonym z barwnikiem fluorescencyjnym (Ho and Kane 1990). Wynika to z faktu, że pozostałości barwników dekstranowych z martwych komórek dawcy utrzymują się znaczni...

<table><tbody><tr><td>5 &amp;#190;&quot; Pipeta szklana</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-30</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara z borokrzemianowego szkła</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>FluoroDish</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>FD35</td><td></td></tr><tr><td>Pionowy wyciągacz igieł/pipet</td><td>Instrumenty David Kopf</td><td>Model 720</td><td></td></tr><tr><td>Mikromłynek</td><td>Marishige</td><td>EG-400</td><td></td></tr><tr><td>Micro Forge</td><td>Marishige</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Ręczna pompa mikrostrzykawkowa</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MMP</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11232-20</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fluorowodorowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A147-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Research Products International Corp.</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;&gt;woda jajeczna E3:&lt;/p&gt; &lt;ul&gt; &lt;li&gt;5 mM NaCl&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0,17 mM KCl&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0,33 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0,33 mM MgSO4&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0,1% błękitu metylowego&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;ul&gt; &lt;li&gt;5 mM NaCl&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0,17 mM KCl&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0,33 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0,33 mM MgSO4&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0,1% błękitu metylenowego&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;µl&gt; &lt;li&gt;5 mM NaCl&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0,17 mM KCl&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0,33 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0,33 mM MgSO4&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0,1% błękitu metylenowego&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

transplantacja blastomerów wykazujących ekspresję gfp w celu obrazowania na żywo rozwoju siatkówki i mózgu w chimerycznych embrionach danio pręgowanego

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

W trakcie embriogenezy komórki przechodzą rozległe zmiany w zakresie ich lokalizacji i właściwości. Zmiany te są regulowane przez oddziaływania między komórkami a ich środowiskiem. Embriony chimeryczne, składające się z komórek o różnym podłożu genetycznym, stanowią doskonałe narzędzia do badania oddziaływań międzykomórkowych pośredniczących w działaniu genów będących przedmiotem zainteresowania. Przezroczystość embrionów danio pręgowanego (*zebrafish*) we wczesnych etapach rozwoju umożliwia bezpośrednią wizualizację morfogenezy tkanek i narządów na poziomie komórkowym. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół generowania chimerycznych siatkówek i mózgów w embrionach danio pręgowanego oraz prowadzenia obrazowania na żywo komórek dawcy. Protokół obejmuje przygotowanie igieł do transplantacji, transplantację blastomerów dawcy wykazujących ekspresję GFP do biorców niewykazujących ekspresji GFP oraz badanie zachowania komórek dawcy przy użyciu konfokalnej mikroskopii na żywo. Po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji protokół ten może być również wykorzystany do badania rozwoju embrionalnego innych tkanek i narządów u danio pręgowanego. Omówiono również zalety wykorzystania GFP do znakowania komórek dawcy.

Prezentujemy protokół generowania chimerycznych embrionów rybek danio w celu obrazowania na żywo zachowania komórek podczas embriogenezy.

Transplantacja blastomerów wykazujących ekspresję GFP w celu obrazowania na żywo rozwoju siatkówki i mózgu w chimerycznych embrionach danio pręgowanego

Komórki ulegają znacznym zmianom w zakresie lokalizacji i właściwości podczas embriogenezy. Zmiany te są regulowane przez oddziaływania między komórkami a ich ...

Blastymerami są komórki embrionalne powstające podczas etapu podziałów w rozwoju. W tym doświadczeniu blastymery znakowane GFP są przenoszone z jednego zarodka danio przebrudnego do drugiego przy użyciu igły do transplantacji. Metoda ta pozwala na śledzenie zachowania i losu blastymerów o zmienionym tle genetycznym w zarodku prawidłowym lub odwrotnie, za pomocą obrazowania mikroskopowego na żywo.Witajcie, jestem dr Zoran z laboratorium dr. Shawe w Departamencie Okulistyki na Uniwersytecie w Pittsburghu. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę transportu embrionów zebrafish. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania rozwoju siatkówki oraz mózgu.Zacznijmy zatem. Wieczorem przygotuj krzyżówki parzyste danio pręgowanych, aby zapobiec przypadkowym kojarzeniom. Przed wyznaczonym czasem użyj przegród, aby odseparować samice od samców. Tutaj.Transgeniczne ryby wykazujące ekspresję GFP są wykorzystywane jako źródło blastomerów donorskich. Linia transgeniczna PT 1 0 4 wykazuje powszechną ekspresję GFP pod kontrolą promotora EF one. Aby przygotować dołki z agarozy do osadzenia embrionów, wlej stopioną 1% agarozę przygotowaną w wodzie do jaj E three do szalki Petriego. Na roztworze agarozy umieść plastikową formę z klinowatymi wypustkami.Następnie pozostawić do ostygnięcia. Aby ostrożnie utwardzić materiał, wyjąć formę i zanurzyć podłoże agros w wodzie E three. Następnie przygotować igły do transplantacji.Do wyciągania szklanych pipet kapilarnych należy użyć pionowego wyciągacza igieł przy ustawieniu mocy 11,5. Prawidłowo przygotowane końcówki igieł powinny zwężać się, tworząc długie trzony. Końcówki igieł należy szlifować pod kątem 45 stopni za pomocą mikro-szlifierki, aż do uzyskania ściętych otworów o średnicy wewnętrznej od 30 do 40 micrometers.Aby oczyścić końcówki igieł, przymocuj wąż do tępego końca, połącz wąż ze strzykawką, a następnie zaciągnij i wypuść 10% roztwór kwasu fluorowodorowego. Powtarzaj czynność do czasu usunięcia wszystkich widocznych zanieczyszczeń. Przemyj końcówki wodą destylowaną.Następnie, używając 100% etanolu, wysusz igły na powietrzu do całkowitego odparowania etanolu. Ważne jest, aby upewnić się, że końcówki są całkowicie suche. Pozostałości etanolu zniszczą igły podczas polerowania w wysokiej temperaturze.W drugim kroku, aby wygładzić i wypolerować ostre krawędzie końcówek igieł, należy podgrzać je ciepłem generowanym przez włókno mikrokuźni. Podczas polerowania nie wolno dopuścić do zetknięcia się końcówek igieł z włóknem; należy kontrolować natężenie prądu przepływającego przez włókno oraz odległość między włóknem a igłą. Parametry te można dostosować w celu uzyskania pożądanych warunków grzania.Temperatura nie powinna być zbyt wysoka, aby zapobiec stopieniu i odkształceniu końcówek igieł po wygładzeniu szorstkich krawędzi. Należy ostrożnie dotknąć rozgrzanego włókna końcówką igły, a następnie delikatnie odsunąć włókno, aby utworzyć zaostrzony koniec.Ostra, gładka i czysta igła jest kluczowa dla uzyskania nienaruszonych blastocyst dawcy bez uszkadzania embrionów biorcy. Wyciągnij pipetę szklaną nad płomieniem gazowym, aby utworzyć cienką szklaną sondę z wygładzonym końcem. Sonda ta będzie służyć do ustawienia embrionów w odpowiedniej orientacji przed transplantacją.W dniu eksperymentu należy usunąć przegrody w kasetach krzyżowych, aby umożliwić rybom rozród. Osiem. Po 30 minutach należy zebrać od 100 do 200 embrionów, przelewając je przez siatkę. Embriony należy umieścić w szalce Petri wypełnionej wodą E3.Następnie, używając precyzyjnej pęsety, odwarstwij osłonki embrionów poprzez manualne odrywanie COR. Następnie za pomocą pipety szklanej z wygiętym trzonem ostrożnie przenieś osłonięte embriony do dołków aros. Nie dopuść do kontaktu embrionów z powietrzem, ponieważ spowoduje to ich pęknięcie.Pozostaw embriony do rozwoju w temperaturze 28,5 °C w dołkach aros do czasu upływu trzech godzin po zapłodnieniu (HPF). Przygotuj aparat do transplantacji, łącząc igłę transplantacyjną z mikrosystemem pompowym wypełnionym olejem mineralnym. Upewnij się, że system nie przecieka i nie zawiera uwięzionych pęcherzyków powietrza.Wypełnij całą igłę do transplantacji olejem mineralnym, pozostawiając od 0,5 do 1 µL wolnej przestrzeni przy otworze końcowym. Wyjmij embriony z inkubatora i umieść je na stoliku mikroskopu w celu transplantacji blastomerów. Użyj szklanej sondy pozycjonującej, aby zorientować stronę z blastomerami trzech do czterech embrionów w stadium HPF górą.Następnie delikatnie wprowadź igłę transplantacyjną do embrionu dawcy i powoli zassij od pięciu do 20 blastomerów do igły, upewniając się, że końcówka igły nie miała kontaktu z powietrzem podczas transplantacji. Wprowadź igłę wypełnioną blastomerami do embrionu gospodarza i powoli je uwolnij. Miejsce, w którym uwolnione zostaną blastomery, będzie wpływać na lokalizację ich potomstwa w późniejszych etapach rozwoju; aby analizować rozwój siatkówki i mózgu, uwolnij komórki w biegunie zwierzęcym.Jeśli planowana jest analiza rozwoju innych tkanek i narządów, należy odpowiednio dobrać miejsca uwalniania. Aby zminimalizować uszkodzenia mechaniczne podczas transplantacji, embriony gospodarza pozostawia się w dołkach agros w temperaturze 28,5 °C do następnego dnia. Następnie należy przenieść embriony mozaikowe na płytki 24-dołkowe, uprzednio pokryte 0,5 ml 1% agros i wypełnione 1 ml wody jajowej E3.Do każdego dołka należy dodać jeden zarodek, aby zapobiec infekcjom bakteryjnym, stosując 10 µL 100 x penicyliny i streptomycyny. Do każdego dołka odważyć i przygotować agar o niskiej temperaturze topnienia (LMP) i utrzymywać roztwór w kąpieli wodnej o temperaturze 30 °C. Przenieść zarodek mozaikowy do szalki Flora z szklanym dnem o grubości 0,17 mm.Usunąć nadmiar wody E3, tak aby zarodek był zaledwie przykryty. Następnie szybko dodać do zarodka od 30 do 50 µl roztopionego 1,5% LMP, zanim roztwór ARO zastygnie. Ustawić oko lub mózg jak najbliżej szklanego dna.Po ostygnięciu roztworu należy dodać dodatkowy roztwór agros, aby jeszcze bardziej unieruchomić zarodki. Zastygły blok agros należy zanurzyć w dwóch do trzech mililitrów wody do jaj E3 w celu przeprowadzenia mikroskopii konfokalnej. Do badań wykorzystuje się inwertowany obiektyw imersyjny 40 x z dużą głębią ostrości.Na obiektyw nanieś kroplę wody, a następnie umieść na stole naczynie do kultur tkankowych z florą i ustaw ostrość w celu uzyskania obrazu. Wykonaj obrazowanie time-lapse, fotografując embriony co pięć minut. W zależności od charakteru doświadczeń odstępy czasowe między zdjęciami mogą zostać dostosowane.Tutaj przedstawiono reprezentatywny obraz 24-godzinnego zarodka ryby danio-zebry. Ekspresja GFP wyróżnia komórki dawcy na zielono. Neuroepitelialne komórki siatkówki obejmują całą grubość ściany siatkówki.Ten film przedstawia przemieszczanie się komórek dawcy w mózgu gospodarza w 24 HPF. Zwróć uwagę, że morfologia komórek zmienia się w czasie. Prezentujemy sposób przeprowadzenia transplantacji lustrzanego odbicia piersi u rybek zebrafish.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o delikatnym przygotowaniu odpowiedniej igły w obszarze transplantacji piersi. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymencie.

transplantation-gfp-expressing-blastomeres-for-live-imaging-retinal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przeszczepienie blastomerów ekspresujących GFP w celu obrazowania na żywo rozwoju siatkówki i mózgu w chimerycznych zarodkach rybki labiryntowej

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Przewodnik krok po kroku po generowaniu ukierunkowanych chimerycznych zarodków danio przewrotnego poprzez transplantację w stadium blastuli lub gastruli.

Generowanie chimerycznych embrionów ryby danio przez transplantację

Transplantacja komórek u rybek zebrafish umożliwia połączenie genetyki i embriologii w celu generowania chimer specyficznych dla danej tkanki. Niniejsze wideo demonstruje transplantacje komórek na etapie gastruli, które pozwoliły naszemu laboratorium zbadać role populacji astroglialnych oraz specyficznych sygnałów prowadzących podczas formowania się spoiw w przedmózgowiu.

Chimery embrionalne z ukierunkowaniem tkankowym: transplantacja komórek gastruli rybki danio-pręgawki

W tym filmie przedstawiono techniki wielokolorowego konfokalnego obrazowania time-lapse oraz celowanej ablacji komórek. Obrazowanie time-lapse jest wykorzystywane do monitorowania zachowania wielu wybranych typów komórek in vivo. Celowana ablacja komórek ułatwia badanie funkcji obwodów neuronalnych oraz paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla danej grupy komórek.

Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznych rybek zebrafish: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

Obumierające komórki są usuwane z tkanek nabłonkowych poprzez skoordynowany skurcz komórek sąsiednich, bez naruszania funkcji barierowej. Przejrzystość optyczna rozwijających się rybek danio przymrużonych stanowi doskonały system do wizualizacji procesu ekstruzji w żywych nabłonkach. W niniejszej pracy opisujemy metody indukcji i obrazowania ekstruzji w naskórku larw rybek danio przymrużonych z rozdzielczością komórkową.

Obrazowanie na żywo ekstruzji komórek z naskórka rozwijającego się danio pręgowanego

Regeneracja siatkówki danio pręgowanego była głównie badana przy użyciu stałych siatek oka. Jednak dynamiczne procesy, takie jak interkinetyczna migracja jądrowa, zachodzą podczas odpowiedzi regeneracyjnej i wymagają obrazowania żywych komórek w celu zbadania mechanizmów leżących u ich podstaw. W tym miejscu opisujemy warunki hodowli i obrazowania w celu monitorowania międzykinetycznej migracji jądrowej (INM) w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Hodowla dorosłych transgenicznych eksplantatów siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii wielofotonowej

Śledzenie na żywo poszczególnych komórek progenitorowych siatkówki WT w różnych tłach genetycznych pozwala na ocenę udziału nieautonomicznej sygnalizacji komórek podczas neurogenezy. W tym celu wykorzystano kombinację knockdownu genów, generowania chimer poprzez przeszczep zarodka i poklatkowego obrazowania konfokalnego in vivo.

In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek

Kombinacja zaawansowanych technik optycznych laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o długich falach została zaimplementowana do przechwytywania wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowego obrazowania w czasie rzeczywistym migracji grzebieni nerwowych w zarodkach zebry pręgowanego Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP).

Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Ta praca opisuje protokół dla modułowego systemu transgenezy Tol2, metody klonowania opartej na bramie, służącej do tworzenia i wstrzykiwania transgenicznych konstruktów do embrionów zebranego.

System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepiania komórek o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej w zarodkach i larwach danio pręgowanego na każdym etapie, między co najmniej 1 a 7 dniem po zapłodnieniu.

Przeszczep komórek w wysokiej rozdzielczości u embrionów i larw danio pręgowanego

Poznaj metodę przeszczepiania blastomerów GFP w zarodkach danio pręgowanego do obrazowania na żywo rozwoju siatkówki i mózgu. Technika ta umożliwia śledzenie zachowania komórek o zmienionym genotypie w normalnym kontekście rozwojowym.

Przeszczepianie blastomerów wykazujących ekspresję GFP w celu obrazowania na żywo rozwoju siatkówki i mózgu w zarodkach chimerycznych danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal

Transplantacja blastomerów wykazujących ekspresję GFP w celu obrazowania na żywo rozwoju siatkówki i mózgu w chimerycznych embrionach danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów