Name: Test odpowiedzi na wydłużenie trąby (PER) u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 28 min 40 s
Description: Poznaj test odpowiedzi na wydłużenie trąby (PER) u Drosophila do badania zachowań smakowych. Ta metoda pozwala analizować preferencje pokarmowe owadów w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Paulowi Grahamowi za pracę w charakterze operatora kamery podczas prezentacji wideo.

Głodzenie
<ol>
<li>Najpierw należy zagłodzić muchy.</li>
<li>Do pustej fiolki włóż mały kawałek chusteczki Kim-wipe nasączonej wodą.</li>
<li>Przenieś 20-30 dobrze odżywionych much do pustej fiolki.</li>
<li>Co 12-24 godzin sprawdzaj, czy papier jest wilgotny.</li>
<li>Głodź muchy przez 36-72 godziny.</li>
</ol>
Unieruchom muchę
<ol>
<li>Pochwyć jedną muchę za pomocą aspiratora.</li>
<li>Umieść żółty końcówkę o pojemności 200 µl nad otworem. Jednocześnie obracając aspirator i dmuchając w niego, wtłocz muchę do wnętrza żółtej końcówki.</li>
<li>Delikatnie dmuchnij, aby przesunąć muchę w górę do punktu, w którym nie będzie mogła się już poruszać.</li>
<li>Używając żyletki, zrób zaznaczenie mniej więcej na wysokości oka muchy, następnie wciągnij muchę z powrotem i odetnij końcówkę.</li>
<li>Delikatnie wydmuchaj muchę z powrotem na miejsce, ale tuż przed dotarciem do samego końca wykonaj skośne cięcie w miejscu, w którym będzie znajdować się trąba. Można pominąć to skośne cięcie, ale z pewnością ułatwi ono kolejny etap procesu.</li>
</ol>
Przygotuj knoty sacharozowe
<ol>
<li>Skręć pasek papieru Kimwipes® o szerokości 6 mm w nić, a następnie rozerwij go na małe kawałki w kształcie stożkowych knotów (&lt; 1 cm).</li>
<li>Knoty te zanurzano w roztworach sacharozy lub wodzie, a następnie przykładano do trąbki owada, umożliwiając kontakt.</li>
</ol>
Przygotuj zwierzęta kontrolne i doświadczalne
<ol>
<li>Przed testowaniem jakichkolwiek substancji smakowych podaj muszce 4% roztwór sacharozy. Służy on jako kontrola pozytywna. Odrzuć każdą muszkę, która nie zareagowała.</li>
<li>Następnie przetestuj dH2O na muszce. Służy to jako kontrola negatywna. Odrzuć muszkę, jeśli zareagowała.</li>
<li>Kontrole te należy przeprowadzić po przetestowaniu substancji smakowych.</li>
</ol>

<ol><li>Dethier, V. G. The Hungry Fly. , Harvard University Press. Cambridge. (1976).</li>
</ol>

W niniejszej prezentacji omówiliśmy wszystkie etapy badania odruchu wyprostnego trąbka (Proboscis extension response assay). Metoda ta wydaje się dość prosta, jednak podobnie jak w wielu innych testach behawioralnych, wiele drobnych szczegółów może wpłynąć na niepowodzenie badania. Przeanalizowaliśmy wiele takich kroków, które wymagają szczególnej uwagi. Poniżej ponownie podkreślam niektóre z najważniejszych czynników.
Jednym z takich czynników jest kształt knota. Przedstawiłem kilka bardzo d...

<table><tbody><tr><td>HDR-HC1</td><td>Kamera</td><td>Sony Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMZ800</td><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-IBSS</td><td>Adapter kamery</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DC10LN</td><td>Adapter kamery</td><td>Optem, Qioptiq Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>257010</td><td>Adapter kamery</td><td>Optem, Qioptiq Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TREKKER Mk2</td><td>Statyw</td><td>BENBO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gorillapod SLR</td><td>Statyw</td><td>Joby</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMac G5</td><td>Komputer</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power Mac G5</td><td>Komputer</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMovie</td><td>Oprogramowanie</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MPEG Streamclip</td><td>Oprogramowanie</td><td>SQUARED 5</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

test odpowiedzi wyciągania trąbka (per) u drosophila

Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila

Odruch wyciągania trąbki (PER) to test zachowania smakowego, który był stosowany zarówno u much, jak i u pszczół miodnych.
Na powierzchni aparatu gębowego muchy (labellum) znajdują się struktury przypominające włoski, zwane sensillami, w których znajdują się neurony smakowe. Gdy substancja atrakcyjna styka się z labellum, mucha wysuwa trąbek, aby spożyć materiał. Test reakcji wysuwania trąbki (Proboscis Extension Response, PER) pozwala zmierzyć tę behawioralną odpowiedź smakową i jest użyteczną metodą badania preferencji pokarmowych pojedynczej muchy. Roztwory różnych cukrów, takich jak sacharoza, glukoza i fruktoza, są dla muchy bardzo atrakcyjne. Można również testować wpływ substancji awersyjnych, obserwując redukcję PER po ich zmieszaniu z roztworem słodkim.Mimo prostoty podstawowej procedury, istnieje wiele czynników, które mogą utrudnić jej prawidłowy przebieg. Jednym z aspektów wymagających uwagi jest stan reaktywności muchy. Wymagany czas głodzenia w celu doprowadzenia muchy do odpowiedniego stanu reaktywności znacznie się różni i wynosi od 36 do 72 godzin. Wprowadziliśmy serię kontroli służących do oceny stanu muchy, co pozwala na odrzucenie osobników niereaktywnych lub nadreaktywnych. Kolejnym istotnym czynnikiem jest siła uderzenia oraz miejsce kontaktu z labellum, co byłoby trudne do opisania słowami. Niniejsza prezentacja wideo demonstruje wszystkie te elementy wraz z kilkoma innymi ulepszeniami, które zwiększą powtarzalność tej metody.

Odruch wysuwania cycylka, znany jako PER, to test zachowań smakowych stosowany u muszek oraz pszczół miodnych. Gdy cycylek zetknie się z substancją atrakcyjną, mucha wysuwa go, aby spożyć tę substancję. Roztwory różnych cukrów są dla muchy bardzo atrakcyjne.

Test odpowiedzi wyciągania trąbka (PER) u Drosophila

Odruch wysuwania trąbka (PER) to test behawioralny smaku, który był stosowany zarówno u much, jak i u pszczół miodnych.
Na powierzchni aparat otworu gębowego muchy...

Witajcie. W tej prezentacji chcielibyśmy pokazać Wam, jak przeprowadzić badanie reakcji wysuwania proboscis u muszkach owocowych. Badanie reakcji wysuwania proboscis, znane jako PER (proboscis extension response), to test zachowań smakowych stosowany zarówno u muszek, jak i u pszczół miodnych. Gdy proboscis styka się z substancją atrakcyjną, mucha wysuwa proboscis, aby skonsumować tę substancję.Roztwory różnych cukrów, takich jak sacharoza, glukoza i fruktoza, są bardzo atrakcyjne dla muchy. Odpowiedź proboscis (PR) może być również obserwowana w wyniku kontaktu z nogą, jednak w tej prezentacji chcielibyśmy skupić się na kontakcie proboscis. Dlatego pierwszym krokiem w badaniu PR jest zagłodzenie muchy.Optymalizacja warunków głodzenia jest jednym z najważniejszych czynników w tym teście. Istnieją tutaj dwie kluczowe kwestie. Pierwszą jest czas głodzenia, a drugą wielkość ciała muchy przed rozpoczęciem głodzenia.Wydaje się, że między tymi dwiema wartościami istnieje dodatnia korelacja. Jeśli mucha jest duża i tuczna, należy ją dłużej głodzić. Wielkość ciała zależy od pożywienia muchy oraz gęstości populacji much w fiolce.Pozwólcie, że pokażę wam dobry przykład. W tej fiolce widać, że muchy nie są zbyt zagęszczone. Znajduje się tu, sprawdźmy, około 100 do 150 PPE w fiolce.Gdy tylko muchy wyklują się z pożywki, należy utrzymywać je na świeżym pożywieniu przez kolejne trzy do pięciu dni, a następnie przenieść do pustej fiolki zawierającej kawałek papieru. Papier ten musi być przez cały czas utrzymywany w stanie wilgotnym, a czas głodzenia może wynosić od 24 do 96 godzin. Szczegóły dotyczące czasu głodzenia zostaną opisane w dalszej części.Oto sposób na unieruchomienie muchy do PER. Najpierw należy przygotować jedną muchę oraz aspirator. Następnie nad otworem aspiratora należy umieścić żółty tip o pojemności 200 µL.Teraz jednocześnie obracaj i dmuchaj w instrument. Można delikatnie przesunąć muchę w górę, w stronę żółtej końcówki, a następnie powoli wdmuchać powietrze, aby docisnąć muchę do miejsca, w którym nie będzie mogła się już poruszać. Za pomocą żyletki zaznacz miejsce w przybliżeniu na wysokości oka muchy, następnie wciągnij muchę z powrotem i odetnij końcówkę. Teraz delikatnie wdmuchaj powietrze, aby przywrócić muchę na miejsce.Jednak tuż przed dotarciem do samego końca, wykonaj cięcie SL w miejscu, w którym ma znajdować się probos. Można zrezygnować z cięcia SL, ale jego wykonanie zdecydowanie ułatwi kolejny etap procesu. Teraz odetnij żółtą końcówkę poniżej muchy, wypełnij dół gliną i ustaw pionowo.Ostateczną regulację można przeprowadzić, dodając więcej glinki na czubek. Ważne jest, aby nie dociskać muchy zbyt mocno. Skupię się teraz i przesunę ją może nieco wyżej.Zatem głowa muchy powinna znajdować się nieco powyżej tego miejsca. Tak wyglądałoby to pod mikroskopem podczas próby; jest to widok z boku oraz widok z przodu. Teraz można przystąpić do testowania pr.WIC, który wykorzystujemy do dostarczania próbki, jest przygotowywany w następujący sposób. Używamy chusteczek Kim, które przepuszczamy przez niszczarkę, aby uzyskać paski o takim wyglądzie. Szerokość paska wynosi około sześciu milimetrów, mniej więcej od pięciu do sześciu milimetrów.W tym momencie należy skręcić ten pasek, aby stworzyć nitkę, skręcając go mocno. Skręcam go i w ten sposób otrzymujemy nitkę o takim wyglądzie. Następnie za pomocą pęsety oddzielamy te małe włókna od nitki.W ten sposób wywołujemy reakcję przebudzenia. W tym klipie wideo chcielibyśmy zaprezentować właściwe miejsce kontaktu z Pro Bois. Użyjemy do tego nasyconego wątku z 4% sacharozą i chcielibyśmy pokazać różnice w wrażliwości poprzez dotykanie różnych obszarów wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej.Środek labellum jest tutaj najbardziej czułym punktem. Należy więc zawsze starać się nawiązać kontakt z jego środkową częścią w ten sposób. Jeśli dotknie się samej góry lub obszaru grzbietowego labellum, mucha nie zareaguje.Nawiązaliśmy zatem kontakt, ale widać, że mucha nie wysuwa ssis. To samo dzieje się po dotknięciu najbardziej brzusznej części labum. Jest to nieco trudniejsze, ale sprawdźmy, czy uda nam się uzyskać dobry kontakt z najniższą częścią labum.Zastosujemy bardzo delikatne podejście. Sprawdźmy teraz. Ponownie dotknę środka, aby upewnić się, że mucha nadal tam jest.Zainteresowano się analizą smaku słodkiego. W przypadku lumy należy zawsze dotykać środka, czyli tego obszaru w centrum. Patrząc pionowo na test, środek lumy jest skierowany w tym kierunku, nieco w dół.Zatem gdy zbliżamy się do legum w poziomie, czyli w tym kierunku, w tym kierunku, najbliższy punkt znajdzie się pomiędzy obszarem wrażliwym a niewrażliwym. W takim przypadku wystąpi odpowiedź. Jeśli jednak zbliżymy się nieco powyżej, reakcji nie będzie.Pozwólcie, że sprawdzę. W pierwszym rzędzie silla nie ma odpowiedzi, w drugim rzędzie również nie, w trzecim rzędzie – tak. Należy więc zejść co najmniej poniżej trzeciego rzędu silla.Teraz wykonam analogiczne badanie od dołu. Jest to nieco trudniejsze. Dotykam drugiego rzędu od dołu.Teraz przeniosę się wyżej. Trzeci rząd, czwarty rząd, nie, nie reaguje. Piąty rząd.Należy dotknąć co najmniej od czwartego do piątego rzędu wosku od dołu. Oznacza to, że należy stale uderzać w samo centrum, w przeciwnym razie znacznie zwiększy to wariancję uzyskanych danych. Warto ćwiczyć tę czynność wielokrotnie.Kluczowym czynnikiem jest nawiązanie kontaktu nieco poniżej najbliższego punktu przy podejściu poziomym, który znajduje się tutaj. Następnie chciałbym zaprezentować różnicę w czułości między przyśrodkowym a bocznym obszarem labum. Zmieniam pozycję muchy tak, aby w tym ujęciu była skierowana górą do góry.Najpierw dotknę środkowej lub przyśrodkowej części labrum muchy i możecie zobaczyć, że mucha reaguje prawidłowo. Teraz dotknę sensora znajdującego się w najbardziej bocznej części labrum i możecie zobaczyć, że tutaj mucha nie reaguje. Teraz przeprowadzę próbę od boku do środka, dotykając samej krawędzi bocznej.Przesuwam się powoli w stronę środka. Jak widać, gdy tylko dotrę do samego centrum, mucha zareaguje. Powtórzę to teraz, przesuwając się z boku w stronę środka.Dlatego ważne jest, aby dotknąć środka poziomu w obu kierunkach: pionowo i poziomo. W tej sekcji chciałbym zademonstrować, jak nawiązać kontakt z osis. W ujęciu ogólnym kontakt ten powinien być jak najdelikatniejszy.Dobrym wskaźnikiem siły uderzenia jest wynikający z niego ruch głowy muchy. Idealne dotknięcie to takie, przy którym głowa w ogóle nie cofa się do tyłu. Innym ważnym czynnikiem jest kształt knota.Przedstawię kilka przykładów. Kształt knota w tym przypadku jest bardzo dobry. Nie jest on ani zbyt gruby, ani zbyt cienki.Jeśli jest zbyt gruba, trudno jest nawiązać precyzyjny kontakt, a siła uderzenia ma tendencję do wzrostu. Jeśli jest zbyt cienka, nie będzie można stwierdzić, czy roztwór został prawidłowo dostarczony do samego czubka, co jest gorsze niż w przypadku zbyt grubej warstwy. Pozwólcie, że dotknę labum tym kilka razy.I tutaj, tutaj, tutaj – niemal w ogóle nie widać żadnego ruchu głowicy w miejscu kontaktu. Czasami otrzymuje się knot, który wygląda w ten sposób. Wówczas część wierzchołkowa jest wyraźnie zbyt cienka.Nie masz pewności, czy stężenie na końcówce jest zgodne z tym, które chcesz dostarczyć. W takim przypadku możesz użyć żółtej części końcówki i kilkakrotnie ją zagiąć w ten sposób, nadając jej taki kształt; pozwólcie, że dotknę tego. Widać teraz, że ruchy głowicy są minimalne.Wystąpił tam niewielki ruch biodra, ale tak, to kolejny dobry przykład. Nie zawsze trzeba wyrzucać tych grubszych, o ile można nawiązać precyzyjny, delikatny kontakt. Te również można nadal wykorzystać.Ruch głowicy może być nieco większy niż w przypadku cieńszych, ale dopóki masz pewną rękę, wciąż możesz uzyskać ładny kontakt, taki jak ten. Tego egzemplarza nie należy używać. Wypływa z niego zbyt wiele włókien i trudno jest je zebrać w pęczek.Należy wyrzucić te i znaleźć inne. Ten również nie nadaje się do użycia. Końcówka jest zbyt cienka i zbyt krótka, aby ją zagiąć i stworzyć grubszą.Otaczające części są zbyt grube, aby zapewnić precyzyjny kontakt. Należy je również odrzucić. Problemem w tym przypadku jest zbyt duża ilość cieczy, co utrudnia uzyskanie precyzyjnego kontaktu.Pozostawiłoby to większą ilość cieczy na podłożu, co mogłoby zakłócić dalszy przebieg procedury. Nawet przy zastosowaniu bardzo dobrego knotka, brak delikatnego kontaktu byłby niekorzystny. Oto przykład błędnego wykonania.Widać, że głowa muchy jest gwałtownie poruszana. Silny wstrząs mógłby zniechęcić muchę do reagowania na substancję, a owad może łatwo stracić zainteresowanie kolejnymi próbami smakowymi. W dalszej kolejności chciałbym przekazać kilka wskazówek, jak zmniejszyć siłę tego uderzenia.Najpierw zatrzymaj knot nad żółtą końcówką tuż przed zetknięciem. W ten sposób możesz zaobserwować amplitudę drżenia dłoni w danej chwili. Analizując to, możesz zwizualizować odległość końcowego podejścia i przesunąć knot tak, aby maksymalny punkt drżenia dłoni osiągał luki w pergaminie.Oczywiście najlepiej byłoby całkowicie uniknąć kontaktu fizycznego między osobnikami. Jednak ta metoda pozwala na pracę w takich warunkach i ogranicza ogólny wpływ tego zjawiska. Zauważyliśmy, że nawet jeśli proces uruchamia się dla tej samej grupy much w tym samym czasie, powstaje grupa osobników, które w ogóle nie reagują ze względu na niewystarczający czas głodzenia.Z drugiej strony może się zdarzyć, że trafi się grupa much, z których wszystkie padły. Dlatego badanie much po ustalonym czasie głodówki, bez względu na ich stan, nie jest zbyt rozsądne. Mogłoby to zwiększyć wariancję danych do tego stopnia, że przesłoniłoby zjawisko, które starasz się zaobserwować.Aby poprawić tę sytuację, chcielibyśmy przedstawić serię kontroli służących do oceny stanu muchy. Pierwszym krokiem jest przetestowanie PER w przypadku kontroli pozytywnej, którą jest 4% sacharoza. Stężenie to jest wystarczająco wysokie, aby wywołać odpowiedź.W przypadku większości much z grupy kontrolnej, jeśli mucha nie reaguje na tę kontrolę pozytywną, oznacza to, że albo wymaga ona dłuższego czasu głodzenia, albo jest nieaktywna z różnych innych powodów, takich jak obrażenia. Takie muchy należy odrzucić. Jeśli natomiast zareagowały, należy przeprowadzić kontrolę negatywną, stosując wodę.Jeśli mucha zareagowała na wodę, oznacza to, że jest spragniona, reaguje na każdy bodziec lub została uwarunkowana do zjadania wszystkiego, co się do niej zbliża. Jest to wynik podania substancji atrakcyjnej jako kontroli pozytywnej. Mucha nauczyła się, że zbliżający się obiekt jest prawdopodobnie słodki.Staramy się zatem zmierzyć zachowanie smakowe, a nie proces uczenia się. Należy uniknąć sytuacji, w której poprzedna próba wpływa na kolejną z powodu uczenia się. Wydaje się, że gdy w ramach kontroli pozytywnej stosuje się wyższe stężenie, wzrasta prawdopodobieństwo wystąpienia reakcji na próbę negatywną.W tej chwili można przetestować odpowiedź muchy na bodźce (PER) z użyciem dowolnej substancji lub w wybranych warunkach, jednak po zakończeniu testu należy ponownie sprawdzić kontrolę pozytywną i negatywną. Jeśli mucha nie zareaguje na kontrolę pozytywną, oznacza to, że w trakcie testu straciła zainteresowanie stymulantami, a w konsekwencji brak reakcji podczas badania może wynikać z ogólnego braku zainteresowania muchy. Następnie, jeśli mucha zareaguje na kontrolę negatywną, oznacza to, że poczuła pragnienie lub została uwarunkowana reakcją na zbliżający się obiekt. Jeśli natomiast mucha nie zareaguje na kontrolę negatywną, uzyskane dane można ostatecznie włączyć do zbioru wyników.Zazwyczaj to okno trwa od około 5 do 10 lub 15 minut. W niektórych przypadkach zauważyłem, że okno to może trwać nawet do 30 minut. Po pewnym czasie zdaliśmy sobie z tego sprawę; ten wykres przedstawia zależność między czasem ekspozycji na rozgwiazdę a śmiertelnością.Oto oś czasu oraz procent żywych much w fiolce. Oczywiście z czasem zaczną one ginąć, a tempo tego procesu będzie się znacznie różnić. Zauważyłem jedną rzecz: do pewnego momentu nie będzie żadnych much reagujących na kontrolę pozytywną, ale nagle zacznie pojawiać się mucha, która zacznie wykazywać reakcję.Oczywiście z czasem można nadal z niego korzystać. Jednak w pewnym momencie zauważyliśmy, że coraz więcej much reaguje na kontrolę negatywną. Zatem jest to przedział czasowy, który należy zachować, aby przeprowadzić ERs.Pytanie brzmi: kiedy to nastąpi? Z mojego doświadczenia wynika, że przy bardzo dobrych warunkach zazwyczaj dzieje się to po około 36 do może 48 godzin, ale czasami może to potrwać do 72 godzin i jest to bardzo zmienne. Warto zatem przygotować wiele fiolek, aby móc uchwycić to krótkie okno czasowe.Ponownie, nawet przy tych samych czasach głodzenia, tym samym pokarmie i identycznych pozostałych warunkach, wyniki te bardzo się różnią. Zatem nawet przy tym samym, bardzo podobnym tle genetycznym, zjawisko to wykazuje dużą zmienność. Jest to kwestia, na którą należy szczególnie uważać.Omówiliśmy muchy, które zostały uwarunkowane na bodźce i obecnie reagują na wszystko. Jednym ze sposobów zapobieżenia temu zjawisku jest rezygnacja z wielokrotnego podawania atraktora smakowego oraz wprowadzanie pomiędzy próbami kontroli negatywnych. Pozwólcie, że pokażę wam, jak to działa.Jest to zatem kontrola pozytywna. Jest to 4% sucrose, którą podaliśmy tutaj dwukrotnie. Jeśli będziemy kontynuować podawanie tej słodkiej substancji wielokrotnie, w końcu dojdzie do uwarunkowania.Zatem teraz, zamiast tego, dodamy kontrolę negatywną. Jak widać, nie wykazuje ona reakcji na kontrolę negatywną. Pozwólcie, że zrobię to jeszcze raz.Pierwsza kontrola pozytywna, 4% z 4% sacharozą. Pozwólcie, że lekko to zegnę. Ponownie bardzo silna i bardzo szybza reakcja na odgięcie.A teraz ponownie przejdziemy do kontroli negatywnej. Zobaczmy, nie ma tutaj dobrego... pozwólcie, że obrócę to. Dobrze, tutaj.Oto woda jako kontrola negatywna. Zatem widać, że nie zareagowałaby ona na kontrolę negatywną. Teraz pokażę Państwu przykład błędnego wykonania.Zatem podajemy 8% sacharozy, co jest stężeniem wyższym niż w przypadku użytej przez nas kontroli pozytywnej. Mucha bardzo to lubi i stara się to odnaleźć; pozwólcie, spróbujmy jeszcze raz. Zobaczmy, delikatny kontakt.Organizm ten bardzo aktywnie poszukuje celu, wciąż wysuwając wypustki. Odczekajmy chwilę i spróbujmy ponownie nawiązać kontakt w tym miejscu.O, tutaj. Więc, tak, wciąż go szukam. Szukam go.Upewnijmy się, tak, nadal jest w porządku. I może jeszcze raz, jeszcze raz, raz jeszcze. O, tutaj, tak, to bardzo silna odpowiedź.Teraz zamiast 8% sacharozy podajmy kontrolę negatywną. Przesuńmy zatem ten knot tutaj. Jest on nieco zbyt cienki.Pozwólcie, że złożę to i ułożę w formie schodków. Jednak tutaj znajduje się woda. Można zatem zaobserwować przypadek, w którym mucha reaguje na wodę.W tym przykładzie podaliśmy substancję atrakcyjną pięć razy. Nie oznacza to, że dwukrotna aplikacja byłaby niewystarczająca, a pięciokrotna zła. Istnieje wiele przypadków, w których mucha zostaje uwarunkowana już po jednym podaniu 4% glukozy lub nawet przy zastosowaniu niższej koncentracji.Ważnym przesłaniem jest dążenie do zmniejszenia liczby powtórnych aplikacji substancji wabiącej. W przypadku stosowania serii stężeń substancji wabiącej bezpieczniej jest rozpocząć od najniższego stężenia i przechodzić do wyższych, szybko cofając smak, aby mucha nie mogła go w znacznym stopniu skonsumować, co ograniczyłoby proces warunkowania muchy. Witajcie, w tej prezentacji omówiliśmy wszystkie etapy testu reakcji proboscis extension response.Sama metoda brzmi dość prosto, jednak podobnie jak w przypadku wielu innych testów behawioralnych, istnieją drobne szczegóły, które mogą sprawić, że badanie nie przyniesie oczekiwanych rezultatów. Przeszliśmy przez wiele z tych kroków, które wymagają szczególnej uwagi. Chciałbym teraz ponownie podkreślić niektóre z najważniejszych czynników.Pierwszą kwestią jest kształt knota. Przedstawiłem kilka zdjęć bardzo dobrych przykładów, ale w rzeczywistości wszystko będzie mieścić się w szerokim spektrum – od bardzo dobrych do bardzo złych wyników. Na początku mogą Państwo używać czegoś z zakresu bardzo dobrych przykładów, ale z dnia na dzień może dojść do przesunięcia w stronę tych gorszych.Zdarza się, że tygodnie, w których prowadzisz badania, mogą zacząć przesuwać się w stronę zakresu mniej optymalnego. Ludzkie postrzeganie tak zwanego „dobrego” wyniku może zmienić się bardzo łatwo, bez zauważenia tego. Jednym ze sposobów zapobiegania temu zjawisku jest wykonanie jednego dobrego zdjęcia WIC, który działa bardzo dobrze, i przeglądanie tego zdjęcia bezpośrednio przed testowaniem P. Drugim ważnym czynnikiem jest wpływ.Jest to łatwiejsze do opanowania, ponieważ optymalny kontakt, czyli uderzenie, to taki, przy którym głowa w ogóle się nie przemieszcza. Zatem, jeśli uda się wykonać to tak delikatnie, jak to możliwe, i nie zauważy się żadnego przesunięcia głowy muchy, będzie to najlepszy rezultat. Teraz warunki głodówki, trzecia kwestia, stanowią najtrudniejszy do kontrolowania czynnik.W wielu testach behawioralnych dotyczących smaku lub węchu bardzo często stosuje się czas głodzenia wynoszący 24 godziny, co może być bardzo wygodne dla badacza prowadzącego eksperyment. Jednakże, jeśli muchy są hodowane w bardzo dobrych warunkach, 24 godziny to okres zbyt krótki. Nawet przy zastosowaniu bardzo bogatej pożywki dla much i precyzyjnej kontroli ich zagęszczenia, to okno eksperymentalne może wynosić od 36 do 72 godzin.Jeśli chodzi o sam eksperyment, muszę przyznać, że jest on bardzo uciążliwy dla osób go przeprowadzających, jednak istnieje kolejny czynnik, który dodatkowo utrudnia pracę eksperymentatorom. W rzeczywistości w wielu partiach okno eksperymentalne może być bardzo krótkie lub może w ogóle nie wystąpić. Istnieją zatem pewne poważne przeszkody, które należy pokonać.Najważniejszymi elementami są jednak kontrola pozytywna i kontrola negatywna. Rygorystyczne przestrzeganie tych standardów pozwoli na zgromadzenie wiarygodnych zestawów danych.

proboscis-extension-response-per-assay-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test reakcji wydłużania trąbki (PER) u muchówek owocowych

Reakcje elektrofizjologiczne neuronów sensorycznych węchu na odoranty u owadów można mierzyć za pomocą rejestracji z pojedynczych sensyli. W tym artykule wideo zademonstrujemy, jak przeprowadzić rejestrację z pojedynczych sensyli w czułkach muszki owocowej (Drosophila melanogaster) oraz w palpach szczękowych komara malarycznego (Anopheles gambiae).

Rejestracja z pojedynczych sensyli u owadów Drosophila melanogaster oraz Anopheles gambiae

Muszka owocówka, Drosophila melanogaster, wysuwa swój trąbek w celu żerowania w odpowiedzi na bodziec cukrowy działający na trąbek lub tarsus. Połączyłem obserwacje reakcji wysuwania trąbka (PER) z techniką obrazowania wapnia, co pozwala nam monitorować aktywność neuronów w mózgu równocześnie z obserwacją behawioralną.

Jednoczesna rejestracja sygnałów wapniowych z zidentyfikowanych neuronów i zachowań żerowania Drosophila melanogaster

Muszki owocowe mają złożony system węchowy, potrafią rozróżniać setki substancji zapachowych i używać swojego węchu do kierowania decyzjami behawioralnymi. Ten film opisuje czterokierunkowy test olfaktometryczny, metodę badania węchowych reakcji behawioralnych u much. Prezentowany klip protokołu pokazuje, jak radzić sobie z muchami testowymi i jakie są krytyczne kroki podczas wykonywania testu.

Czterokierunkowy test olfaktometryczny: metoda oceny reakcji zapachowych u Drosophila

Ten film opisuje metodę testowania węchowych zachowań eksploracyjnych u muszki owocowej, zwaną labiryntem Y. Prezentowany klip z protokołem pokazuje, jak skonfigurować i przeprowadzić test.

Drosophila Test labiryntu Y: metoda oceny reakcji węchowych u much

W tym artykule wideo opisujemy zautomatyzowany test do pomiaru wpływu głodu lub sytości na zależne od węchu zachowanie związane z poszukiwaniem pokarmu u dorosłej muszki owocowej Drosophila melanogaster.

Test pojedynczej muchy na zachowania żerowe u Drosophila

Protokół warunkowania Proboscis Extension Response (PER), opracowany dla pszczół miodnych (Apis mellifera), dostarcza ekologicznie istotnych i łatwo mierzalnych środków do badania kilku różnych mechanizmów uczenia się u wielu gatunków owadów.

Protokół odpowiedzi na wydłużenie trąby do badania plastyczności behawioralnej u owadów: zastosowanie do badań podstawowych, biomedycznych i rolniczych

Przedstawiamy test wyboru, który ma na celu ujawnienie wpływu odorantów na zachowanie Drosophila za pomocą testu Y-labirynt.

Testowanie węchu Drosophila za pomocą testu Y-maze

Aby zidentyfikować nowe mutacje wpływające na mechanosensację, zaprojektowaliśmy test, który mierzy reakcję behawioralną na stymulację dotykową szczeciny muchy u zmutowanych klonów generowanych metodą MARCM. Połączenie technik pozwala na identyfikację mutacji mechanowrażliwych, które w przeciwnym razie byłyby śmiertelne.

Test behawioralny do mechanosensacji klonów opartych na MARCM u Drosophila melanogaster

Ten protokół analizuje zachowanie nawigacyjne larwy Drosophila w odpowiedzi na jednoczesną optogenetyczną stymulację jej neuronów węchowych. Światło o długości fali 630 nm służy do aktywacji pojedynczych neuronów węchowych wyrażających rodopsynę z przesuniętym ku czerwieni kanałem. Ruch larw jest jednocześnie śledzony, rejestrowany cyfrowo i analizowany za pomocą specjalnie napisanego oprogramowania.

Śledzenie zachowań larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację neuronów węchowych

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak przeprowadzić ulepszony test mechanicznej nocycepcji u larw Drosophila. Używamy tutaj testu, aby wykazać, że nadwrażliwość mechaniczna (allodynia i hiperalgezja) występuje u larw Drosophila.

Ulepszony test i narzędzia do pomiaru mechanicznej nocycepcji u larw Drosophila

Ten artykuł przedstawia metody manipulacji optogenetycznej u Drosophila melanogaster, wykorzystując CsChrimson i GtACR2 do aktywacji i wyciszania określonych neuronów. Opisano cztery eksperymenty wykorzystujące optogenetykę do badania zachowań termotaktycznych i smakowych, dostarczając wglądu w podstawowe mechanizmy neuronalne rządzące tymi procesami.

Testy behawioralne do optogenetycznej manipulacji obwodami neuronalnymi u Drosophila melanogaster

Poznaj test odpowiedzi na wydłużenie trąby (PER) u Drosophila do badania zachowań smakowych. Ta metoda pozwala analizować preferencje pokarmowe owadów w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

Test odpowiedzi wyciągania trąbka (PER) u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów