Szybka homogeniczna detekcja w testach biologicznych z wykorzystaniem systemu biosensingu z modulacją magnetyczną

Magnetyczna modulacja biosensyjna (ang. Magnetic modulation BIOSENSING) lub MMB to nowatorska technika detekcji cząsteczek biologicznych. Przedstawiono tutaj test potwierdzający zasadę działania, w którym wykrywana jest interleukina 8; gdy interleukina 8, nazywana również IL 8, zostanie dodana do mieszaniny reakcyjnej zawierającej koraliki magnetyczne powlekane przeciwciałami przeciwko IL 8 oraz znakowaną fluorescencyjnie streptadyną, powstaje kanapka molekularna, która skutecznie łączy cząsteczkę fluorescencyjną z koralikiem magnetycznym.

Reakcję umieszcza się w zmiennym polu magnetycznym. Gradienty są przykładane za pomocą dwóch biegunów elektromagnetycznych, które wprawiają kuleczki w ruch oscylacyjny. Periodyczny ruch kuleczki z przyłączonymi białkami fluorescencyjnymi w głąb i poza ortogonalną wiązkę lasera generuje sygnał fluorescencyjny, który jest zbierany przez PMT i demodulowany.

Przy użyciu wzmacniacza synchronicznego ruch kulek można wizualizować, zastępując PMT kamerą CCD; ruch synchroniczny jest widoczny w próbkach, w których kulki magnetyczne zostały połączone z białkami fluorescencyjnymi za pomocą IL8. Cześć, jestem Adia z Laboratorium Optyki Nieliniowej i Laserów na Wydziale Elektroniki Fizycznej Uniwersytetu Telawiwskiego. Jestem NoGo z Wydziału Nauk Biologicznych Uniwersytetu w Chicago, a ja jestem Marcelo Erlich z Wydziału Badań Komórkowych i Immunologii Uniwersytetu Telawiwskiego.

Dzisiaj zaprezentujemy metodę szybkiej, homogenicznej detekcji w testach biologicznych z wykorzystaniem systemu biosensingu z modulacją magnetyczną. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do wykrywania specyficznych białek oraz sekwencji DNA o niskich stężeniach. Zapraszamy do oglądania.

Rozpocznij procedurę od przygotowania i oznakowania probówek dla każdej reakcji, w tym dla próbki docelowej oraz kontrolnej próbki niedocelowej. Do każdej probówki dodaj po kolei następujące składniki testu cytokin bio plex Precision Pro: koraliki magnetyczne, przeciwciało detekcyjne IL eight, streptawidynę PE oraz IL eight.Target. Uzupełnij objętość do 100 microliters buforem do testu, a następnie inkubuj przez 30 minut na kompaktowym wstrząsaczu orbitalnym.

Po 30-minutowym wstrząsaniu próbek w temperaturze pokojowej, należy umieścić je bezpośrednio w kuwetach do analizy. Należy oczyścić kuwety systemu MMB za pomocą chusteczek do czyszczenia soczewek i 70% etanolu. Przyrząd wykorzystywany do analizy składa się z lasera z podwojoną częstotliwością o długości fali 488 nanometrów, służącego jako źródło światła wzbudzenia, które jest kierowane za pomocą dichroicznego dzielnika wiązki o długości 562 nanometra na obiektyw mikroskopu.

Obiektyw mikroskopu skupia laser do wiązki o szerokości 27 µm w rurce z krzemianowego szkła borowego o szerokości 400 µm. Emitowane światło jest filtrowane spektralnie za pomocą dwóch następujących po sobie filtrów przepustowych, wykrywane przez fotopowielacz (PMT) i demodulowane przy użyciu wzmacniacza lock-in. Samoróbny modulator prądu jest używany do dostarczania fali prostokątnej sukcesywnie do każdego elektromagnesu.

Amplituda powinna wynosić 1,4 amps przy częstotliwości od jednej do sześciu hertz, ponieważ kuleczki wchodzą i wychodzą z wiązki laserowej dwukrotnie w każdym cyklu. Częstotliwość demodulacji w wzmacniaczu lock-in wynosi od dwóch do 12 hertz. Uruchom system, przekręcając klucz lasera 488 nanometer do pozycji on i włączając zasilanie.

Następnie ustaw moc lasera na minimum, około 4–6 mW. Włącz oscyloskop, a następnie włącz PMT. Następnie umieść próbkę między dwoma biegunami elektromagnetycznymi.

Użyj stopnia obrotowego vete, aby upewnić się, że wiązka lasera przechodzi przez vete i nie uderza w jego ścianki. Użyj stopnia translacyjnego XY, Z vete, aby zmienić jego pozycję względem obiektywu i biegunów elektromagnetycznych. Aby zoptymalizować sprzężenie światła fluorescencyjnego z detektorem, vete należy ustawić nieco za linią biegunów.

Następnie ustaw oscyloskop w trybie pomiaru przebiegu czasowego. Ustaw kontrolę wzmocnienia PMT na 0,5 V. Następnie włącz modulator prądu i ustaw częstotliwość na 3 Hz.

Odczekać 30 sekund, aby umożliwić agregację i kondensację kulek. Kulki magnetyczne zaczną oscylować, przemieszczając się w stronę przedniej części probówki. Gdy wiązka lasera trafi w oscylujące kulki, powinno być widoczne migotanie odbitego światła laserowego z kulek.

Zauważmy, że koraliki poruszają się szybciej wraz ze wzrostem modulacji prądu i wolniej w przypadku jej zmniejszenia. Pozycję koralików w probówce można dostosować za pomocą stolic sterowanych mikrometrycznie. Aby monitorować ruch koralików w kierunku biegunów, można go wizualizować przy użyciu kamery CCD umieszczonej w miejsce PMT.

Oscyloskop wykrywa sygnał okresowy z fluorescencyjnie sprzężonych kulek; zarejestrowano przebieg czasowy z oscyloskopu. Zapisane dane można analizować za pomocą programu MATLAB. Mieszaniny reakcyjne z dodatkiem i bez dodatku IL eight przebadano metodą MMB. we wszystkich reakcjach z celem kulki utworzyły pojedynczy, gęsty agregat, który przemieszczał się w obszarze wiązki lasera w sposób synchroniczny.

Jednakże, w przypadku braku celu, kulek ulegało mniej agregacji, a ich ruch był mniej skoordynowany. Tutaj zegar modulacji bieguna pokazany na żółto oraz sygnał wyjściowy PMT pokazany na purpurowo przedstawiają częstotliwość modulacji dla każdego bieguna wynoszącą dwa hertz. Zatem częstotliwość demodulacji wynosi cztery hertz, zgodnie z teoretycznymi oczekiwaniami.

Gdy kuleczki przechodzą przez wiązkę lasera, PMT wykrywa światło fluorescencyjne, a w wyjściowym napięciu PMT pojawia się piki, gdy sygnał z PMT oraz zegar podwójnej modulacji są przesyłane do wzmacniacza lock-in. Czuły detektor fazy synchronizuje wyniki z wysokim napięciem. Dwa kolory oznaczają dwa różne skany dla tej samej stężenia celu.

Czarne linie reprezentują średnią każdego sygnału. W przypadku badania próbki kontrolnej wzmacniacz lock-in nie wykrył żadnego sygnału. W tym przypadku wzmacniacz lock-in nie dostarczył żadnego sygnału zsynchronizowanego.

Ten fakt, wraz z wizualną różnicą w agregacji, sugeruje, że system MMB oraz różnica w pomiarach przebiegu czasowego sygnału wyjściowego PMT mogą jednoznacznie zidentyfikować obecność celu ILH. Właśnie pokazaliśmy, jak szybko i homogenicznie wykrywać cząsteczki biologiczne przy użyciu modulacji magnetycznej, posługując się IL eight jako przykładem biosensingu.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest przestrzeganie zasad bezpieczeństwa przy pracy z laserem. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.