Name: Strefa podkomorowa en-face: barwienie całościowe i przepływ wyściółki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T16:22:00.000+00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: Poznaj technikę całomontażową ścian komory bocznej w badaniach neurogenezy u myszy. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę przepływu płynu mózgowo-rdzeniowego i aktywności komórek wyściółkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca finansowana z grantu NIH HD-32116, Sandler Family Supporting Foundation, The John Bowes Stem Cell Fund, MEXT, MHLW oraz HFSP. Z.M. otrzymał wsparcie od Carlos Baldoceda Foundation i stypendium UCSF Krevans Fellowship. A.A.-B. piastuje stanowisko Heather and Melanie Muss Endowed Chair.

<ol><li>Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+of+tangential+pathways+for+neuronal+migration+in+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14895-14900 (1996).</li>
<li>Shen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+SVZ+stem+cells+lie+in+a+vascular+niche%3A+a+quantitative+analysis+of+niche+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions.</a> Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).</li>
<li>Tavazoie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+vascular+niche+for+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A specialized vascular niche for adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 279-288 (2008).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+confer+unique+pinwheel+architecture+to+the+ventricular+surface+in+neurogenic+regions+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain.</a> Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Han, Y. G., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia+organize+ependymal+planar+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cilia organize ependymal planar polarity.</a> J Neurosci. 30, 2600-2610 (2010).</li>
<li>Doetsch, F., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+a+germinal+layer+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 11619-11624 (1999).</li>
<li>Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+neurons+follow+the+flow+of+cerebrospinal+fluid+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain.</a> Science. 311, 629-632 (2006).</li>
<li>Coskun, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2B+neural+stem+cells+in+the+ependyma+of+mammalian+postnatal+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">CD133+ neural stem cells in the ependyma of mammalian postnatal forebrain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 1026-1031 (2008).</li>
<li>Merkle, F. T., Mirzadeh, Z., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+organization+of+neural+stem+cells+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mosaic organization of neural stem cells in the adult brain.</a> Science. 317, 381-384 (2007).</li>
<li>Young, K. M., Fogarty, M., Kessaris, N., Richardson, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone+stem+cells+are+heterogeneous+with+respect+to+their+embryonic+origins+and+neurogenic+fates+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone stem cells are heterogeneous with respect to their embryonic origins and neurogenic fates in the adult olfactory bulb.</a> J Neurosci. 27, 8286-8296 (2007).</li>
<li>Waclaw, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zinc+finger+transcription+factor+Sp8+regulates+the+generation+and+diversity+of+olfactory+bulb+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The zinc finger transcription factor Sp8 regulates the generation and diversity of olfactory bulb interneurons.</a> Neuron. 49, 503-516 (2006).</li>
<li>Kohwi, M., Osumi, N., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax6+is+required+for+making+specific+subpopulations+of+granule+and+periglomerular+neurons+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pax6 is required for making specific subpopulations of granule and periglomerular neurons in the olfactory bulb.</a> J Neurosci. 25, 6997-7003 (2005).</li>
<li>Kohwi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subpopulation+of+olfactory+bulb+GABAergic+interneurons+is+derived+from+Emx1-+and+Dlx5%2F6-expressing+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A subpopulation of olfactory bulb GABAergic interneurons is derived from Emx1- and Dlx5/6-expressing progenitors.</a> J Neurosci. 27, 6878-6891 (2007).</li>
<li>Hack, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+fate+determinants+of+adult+olfactory+bulb+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal fate determinants of adult olfactory bulb neurogenesis.</a> Nat Neurosci. , (2005).</li>
<li>Ventura, R. E., Goldman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+radial+glia+generate+olfactory+bulb+interneurons+in+the+postnatal+murine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dorsal radial glia generate olfactory bulb interneurons in the postnatal murine brain.</a> J Neurosci. 27, 4297-4302 (2007).</li>
<li>Kelsch, W., Mosley, C. P., Lin, C. W., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mammalian+precursors+are+committed+to+generate+neurons+with+defined+dendritic+projection+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct mammalian precursors are committed to generate neurons with defined dendritic projection patterns.</a> PLoS Biol. 5, e300(2007).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+centrosome+inheritance+maintains+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asymmetric centrosome inheritance maintains neural progenitors.</a> Nature. 461, 947-955 (2009).</li>
</ol>

Większość badań nad neurogenezą w strefach komorowej i podkomorowej opierała się na klasycznych technikach sekcjonowania w celu zbadania mikroanatomii i relacji komórkowych w tych obszarach. Opisujemy tutaj alternatywną technikę, po raz pierwszy zastosowaną do analizy sieci łańcuchów migrujących neuroblastów generowanych w SVZ 1, następnie wykorzystaną do badania regeneracji populacji progenitorów SVZ po leczeniu antymitotycznym 6, a ostatnio użytą do badania precyzyjnych apikalnych i bazalnych oddziaływań międzykomórkowych dorosłych komórek macierzystych SVZ 2,3,4. Co ciekawe, technika ta ujawniła, że komórki macierzyste, czyli komórki typu B1, w dorosłej SVZ są częścią mieszanego neuroepithelium wraz z zróżnicowanymi, niedzielącymi się komórkami ependymalnymi. Obrazowanie en-face z wykorzystaniem preparatów całych organów (wholemounts) wykazało, że to mieszane neuroepithelium posiada architekturę przypominającą wiatraczek, składającą się z zakończeń apikalnych komórek typu B1 otoczonych dużymi powierzchniami apikalnymi komórek ependymalnych 4. Ta analiza en-face wyjaśniła nasze rozumienie linii komórek macierzystych w mózgach embrionalnych i dorosłych jako składającej się z komórek z zakończeniami apikalnymi na powierzchni komory i wypustkami bazalnymi kontaktującymi się z niszą naczyniową. Osiągnięcie tych wyników byłoby niemal niemożliwe przy użyciu klasycznych technik sekcjonowania. Preparaty całych organów ułatwiają również identyfikację komórek macierzystych poprzez ich kontaktującą z komorą wypustkę apikalną. W miarę odkrywania bardziej specyficznych markerów dla tych komórek macierzystych, technika wholemount stanie się integralną częścią identyfikacji i analizy zachowania komórek macierzystych układu nerwowego.
Preparaty całych tkanek (wholemounts) ścian komór bocznych zapewniają również idealną perspektywę do badania polarności planarnej komórek ependymalnych. Komórki ependymalne to wielorzęskowe komórki wyścielające komory, których funkcją jest koordynowane przemieszczanie płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF). Dzięki technice wholemount cały nabłonek ependymalny jest wyeksponowany en-face, co pozwala na jego kompleksowe barwienie i badanie od granic przednich do tylnych oraz od grzbietowych do brzusznych. Co więcej, testy przepływu ependymalnego przeprowadzone na świeżo wypreparowanych, żywych preparatach wholemount wyraźnie wykazują polarny planarny przepływ generowany przez rzęski ependymalne. Niedawne prace z wykorzystaniem podejścia wholemount ujawniły komórkowe determinanty tej planarnej polarności ependymalnej 5. Co ciekawe, badania wholemount sugerują również, że generowany przez komórki ependymalne przepływ CSF tworzy gradienty chemorepellentów, które kierują migracją młodych neuronów w strefie podkomorowej (SVZ) 7. Podejścia wholemount, które początkowo pozwoliły zidentyfikować sieć migrujących łańcuchów neuronalnych, w dalszym ciągu dostarczają wiedzy na temat mechanizmów regulujących migrację łańcuchową.
Analiza VZ i SVZ za pomocą obrazowania preparatów całych (wholemount imaging) wprowadza nowe podejście do przyszłych badań oraz sposób na doprecyzowanie rozumienia wyników dotychczasowych analiz. Na przykład niedawne badanie sugerowało, że komórkami macierzystymi neuronów w dorosłym SVZ są komórki CD133+/CD24- stykające się z komorą 8. Na podstawie barwień immunohistochemicznych w przekrojach, autorzy ci stwierdzili, że komórki te stanowią subpopulację wielorzęskowych komórek ependymalnych. Jednak w naszym badaniu z wykorzystaniem podejścia wholemount, które zapewnia bardziej kompleksowy wgląd w cały nabłonek ependymalny, stwierdziliśmy, że wszystkie komórki ependymalne wykazują ekspresję CD24, a jedynymi komórkami stykającymi się z komorą, które były CD133+/CD24-, był podzbiór komórek typu B1 4. Co więcej, technika wholemount rokuje użyteczność w przyszłych badaniach nad niedawno opisaną mozaikową organizacją komórek macierzystych neuronów w dorosłym mózgu 9. Kilka badań wykazało, że komórki macierzyste neuronów w dorosłym mózgu nie są populacją jednorodną, lecz są specyficzne regionalnie i zazwyczaj wytwarzają jedynie konkretne podtypy interneuronów opuszki węchowej. W badaniach tych zasugerowano, że różne subpopulacje komórek macierzystych neuronów można rozróżnić albo na podstawie ekspresji specyficznych czynników transkrypcyjnych 10,11,12,13,14, a w inny sposób na podstawie ich regionalizacji wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej i przednio-tylnej ściany bocznej 9,15,16. W miarę identyfikacji kolejnych markerów molekularnych regionalnie specyficznych subpopulacji dorosłych komórek macierzystych neuronów, obrazowanie wholemount powinno zapewnić kompleksowy wgląd w podział tych różnych domen progenitorowych wzdłuż ściany komory.
Przedstawione tutaj techniki sekcji całego preparatu oraz obrazowania mogą być również wykorzystane do analizy ścian komór w zarodku. Sekcję bocznej ściany zarodkowej przeprowadza się krok po kroku w ten sam sposób. Występują jedynie niewielkie różnice w poziomie trudności; komory zarodkowe są względnie większe, co ułatwia sekcję, jednak tkanka jest bardziej miękka, co utrudnia manipulację. W szczególności, podobną ekspozycję komory bocznej można zastosować u zarodków, aby wypreparować ścianę korową komory w celu badania neurogenezy korowej. Niedawne dowody sugerują, że asymetryczne dziedziczenie centrosomów utrzymuje glej promienisty na powierzchni komorowej podczas neurogenezy korowej 17. Obrazowanie en-face powierzchni apikalnych gleju promieniściego może dostarczyć informacji o tym, w jaki sposób centrosomy w tych dzielących się komórkach są dziedziczone asymetrycznie.
Jak w przypadku większości technik, zwłaszcza tych wymagających precyzji manualnej, opanowanie metody wymaga praktyki. Istnieje jednak kilka elementów sekcji, które są kluczowe dla uzyskania lepszych wyników: 1) oświetlenie – regulacja oświetlenia próbki w celu stworzenia cieni zapewnia nieoceniony kontrast podczas sekcji tkanek, które w przeciwnym razie są stosunkowo jednorodne, 2) używanie pęsety jak dwóch szpilek entomologicznych – w tej technice pęsety nigdy nie służą do ściskania lub podnoszenia tkanki, lecz są wykorzystywane jako ruchome szpilki, które można stale repositionować w celu stabilizacji tkanki podczas cięcia, 3) równowaga między delikatną retrakcją a cięciem – nóż powinien służyć nie tylko do przecinania, ale także do delikatnej retrakcji w celu rozdzielenia ścian przyśrodkowej i bocznej, pamiętając, że większość tej sekcji jest w rzeczywistości wykonywana poprzez delikatną retrakcję, a cięcia są jedynie przerywane.

strefa podkomorowa en-face: barwienie całego preparatu i przepływ ependymalny

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

Ściany komór bocznych zawierają największy region zarodkowy w dorosłym mózgu ssaków. Strefa podkomorowa (SVZ) w tych ścianach jest szeroko badanym systemem modelowym służącym do zrozumienia zachowania neuralnych komórek macierzystych oraz regulacji neurogenezy u osobników dorosłych. Tradycyjnie badania te opierały się na klasycznych technikach sekcjonowania w analizie histologicznej. Przedstawiamy tutaj alternatywne podejście – technikę preparatów całych (wholemount), która zapewnia kompleksowy widok en-face tego regionu zarodkowego. W porównaniu z przekrojami, preparaty całe zachowują pełną cytoarchitekturę i zależności komórkowe w obrębie SVZ. Podejście to wykazało niedawno, że dorosłe neuralne komórki macierzyste, czyli komórki typu B1, są częścią mieszanego neuroepithelium wraz z zróżnicowanymi komórkami ependymalnymi wyścielającymi komory boczne. Ponadto metoda ta była wykorzystywana do badania polaryzacji planarnej komórek ependymalnych oraz generowanego przez nie przepływu płynu mózgowo-rdzeniowego w komorze. W obliczu niedawnych dowodów wskazujących, że dorosłe neuralne komórki macierzyste stanowią heterogenną populację o specyfice regionalnej, technika preparatów całych będzie prawdopodobnie niezbędnym narzędziem do zrozumienia organizacji i parcelacji tej niszy komórek macierzystych.

Ściany komór bocznych zawierają największy region zarodkowy w dorosłym mózgu ssaków. Tradycyjnie badania nad neurogenezą w tym obszarze opierały się na klasycznych technikach sekcjonowania do analizy histologicznej. Przedstawiamy tutaj alternatywne podejście — technikę preparatów całych (wholemount), która zapewnia kompleksowy widok en-face tego regionu zarodkowego.

Strefa podkomorowa en-face: barwienie całego preparatu i przepływ ependymalny

Ściany komór bocznych zawierają największy obszar zarodkowy w dorosłym mózgu ssaków. Strefa podkomorowa (SVZ) znajdująca się w tych ścianach jest ...

Cześć, jestem Zaman. Jestem z zespołem Arturo Alvareza. Jesteśmy dziś w laboratorium Arturo, które funkcjonuje w ramach Katedry Neurochirurgii oraz Eli Edith Broad Center for Regeneration Medicine and Stem Cell Research, i pokażemy wam, jak przygotowujemy preparaty całych fragmentów ścian komór bocznych.Takie preparaty całych organów mogą być wykorzystywane zarówno po utrwaleniu do barwienia immunocytochemicznego, jak i w formie preparatów żywych do analizy przepływu płynu. Technika przygotowania całych preparatów, którą Mann zaprezentuje dzisiaj, była opracowywana w laboratorium przez lata i udoskonalona w celu badania całej ściany komory bocznej, w tym komórek splotowych oraz towarzyszącej im aktywności zarodkowej w strefie podkomorowej, w której znajdują się neuralne komórki macierzyste. Została ona pierwotnie opracowana przez Fiona Dutch, a następnie udoskonalona przez HIE Victor i Casu Moto.Wszystkie z nich nie znajdują się już w laboratorium. Poniższe schematy ilustrują sposób przygotowania preparatu całego fragmentu ściany bocznej komory bocznej. Mózg zostaje najpierw podzielony na dwie półkule.Wykonuje się cięcie wieńcowe w części tylnej, aby odsłonić hipokamp i przekrój poprzeczny pokazany tutaj na fioletowo. Ściana przyśrodkowa, pokrywająca hipokamp i zaznaczona kolorem fioletowym, jest następnie oddzielana od ściany bocznej, która pokrywa ciałomózgowia i jest pokazana na różowo. Obie ściany zostaną rozchylone od siebie, podobnie jak przy otwieraniu książki, a następnie ściana przyśrodkowa zostanie odcięta, pozostawiając odsłoniętą ścianę boczną.Pierwsza część tego filmu omawia sekcję preparatu w całości, jednak nie musi to być pierwszy krok. Chronologicznie, jeśli planowana jest analiza przepływu w prączku, należy zapoznać się ze szczegółami w protokole pisemnym. Przed każdą sekcją należy upewnić się, że wszystkie narzędzia są sterylne i znajdują się pod ręką. Sześcicentymetrową szalkę do sekcji z medium L 15 leitz o temperaturze 37 °C należy umieścić pod fluorescencyjnym stereomikroskopem sekcyjnym, a następnie przełożyć świeżo wypreparowany mózg myszy do szalki pod mikroskopem.Za pomocą pęsety precyzyjnej odseparować opary węchowe. Używając noża do nacięć, podzielić mózg na dwie półkule. Wykonać cięcie wieńcowe na tylnym końcu jednej z półkul.Aby odsłonić grzbietowy hipokamp i wykonać jego przekrój poprzeczny, należy wprowadzić nóż do małej przestrzeni komorowej między korą a hipokampem, a następnie przeciąć tkankę, aby uwolnić korę w miejscu jej grzbietowego połączenia z hipokampem. Wyciąć klin kory w narożniku i za pomocą precyzyjnej pęsety powoli oddzielić ją od hipokampu. Kontynuować oddzielanie kory wzdłuż jej przebiegu aż do brzusznej krawędzi hipokampu.Za pomocą noża do nakłuwania odseparuj hipokamp od brzusznych części kory. Używając noża i precyzyjnej pęsety, odsunie hipokamp od kory. Przesuwaj się ostrożnie w kierunku przednim, aby nie uszkodzić ścian komór.Dwie ściany powinny rozchylać się na zewnątrz. Podobnie jak w przypadku książki, należy odciąć za pomocą noża części kory wystające poza ścianę boczną. Aby lepiej uwidocznić tę powierzchnię w miarę wzrostu oporu przy odsuwaniu tkanek, konieczne będzie wykonanie dwóch dodatkowych cięć.Jedno cięcie grzbietowo, w miejscu styku ścian przyśrodkowej i bocznej, oraz analogiczne cięcie brzusznie. Do wykonania tych nacięć należy użyć krótkich ruchów noża do nakłuwania. Dodatkowe cięcia te pozwalają na dalsze odsuniecie ściany przyśrodkowej, aby odsłonić przednią część komory.Dostosuj oświetlenie tak, aby cienie ukazały miejsce styku ścian przyśrodkowej i bocznej, przypominające dolinę między dwiema ścianami. Za pomocą noża wykonaj cięcie dokładnie w tej dolinie, usuwając wzgórze oraz wszelkie nawisające fragmenty kory.Preparaty z otworem powinny zostać wykorzystane niezwłocznie do analizy przepływu płynu. W przypadku przygotowywania preparatów z otworem do barwienia immunocytochemicznego, można przeprowadzić sekcję wielu próbek podczas jednej sesji, pod warunkiem zanurzania ich w utrwalaczu natychmiast po zakończeniu preparacji. Kolejna część filmu zaprezentuje sposób przeprowadzania testów przepływu płynu generowanego przez rzęski komórek nabłonka oponowego.Zastosowanie fluorescencyjnych mikrokulek. Świeżo wypreparowany otwór w ścianie bocznej jest najpierw mocowany do szalki sekcyjnej za pomocą dwóch szpilek entomologicznych. Następnie końcówka szklanej mikropipety wypełnionej fluorescencyjnymi mikrokulkami jest opuszczana na powierzchnię preparatu w całości, a fluorescencyjne kulki są delikatnie naniesione na powierzchnię podczas rejestracji time-lapse.Wideo rejestruje ruch kulek w teście przepływu wyrostków. Przed przeprowadzeniem preparacji całego preparatu należy przygotować szklaną mikropipetę, zgodnie z opisem zawartym w części pisemnej niniejszego protokołu. Gotowa pipeta powinna mieć gładki, płytki stożek oraz skos pod kątem 45 stopni z średnicą wewnętrzną wynoszącą około 100 micrometers.Wypełnij pipetę olejem mineralnym w połowie jej długości, wykorzystując zjawisko kapilarne. Wprowadź tłok nasmarowany smarem próżniowym do tylnej części pipety. Następnie dociśnij go, aby przesunąć menisk oleju aż do końcówki pipety.Zamocuj pipetę z tłokiem do mikromanipulatora na regulowanym ramieniu. Napełnij pipetę od przodu roztworem zawierającym 50% fluorescencyjnych mikrokulek, 5% glicerolu i 45% wody. Wykonaj świeżą preparację z otworem zgodnie z wcześniejszym opisem i przenieś ją stroną komór upar do czystej szalki sekcyjnej wypełnionej roztworem o temperaturze 37 °C.W medium Leitz unieruchom uchwyt w naczyniu do sekcji, używając dwóch szpilek entomologicznych w wzgórzu oraz w przedniej części kory grzbietowej. Umieść podstawę statywu z mikromanipulatorem obok stereomikroskopu, utrzymując ramię w górze, aby uniknąć złamania igły mikropipety. Zanurz końcówkę mikropipety w probówce z medium, aby oczyścić jej zewnętrzną stronę z mikrokulek.Należy uważać, aby nie złamać końcówki. Umieść końcówkę pipety nad powierzchnią grzbietową ściany bocznej i opuść ramię tak, aby końcówka pipety znalazła się tuż nad powierzchnią tkanki. Ustaw ostrość na pole widzenia obejmujące przednią połowę uchwytu z otworem i rozpocznij rejestrację pożądanych obrazów.Użyj tłoka, aby wprowadzić około pięciu litrów mikrokulek na powierzchnię mocowania otworu. Gdy początkowa porcja kulek zostanie usunięta z powierzchni przez przepływ osłonowy, użyj tłoka, aby wprowadzić kolejne serie mikrokulek o objętości pięciu nanolitrów. Przepływ, kierunek i prędkość można przeanalizować na podstawie zarejestrowanego materiału wideo.Ostatnia część tego filmu demonstruje sposób immunobarwienia preparatów z całego otworu (hole mounts) oraz ich montażu na szkiełkach do obrazowania konfokalnego. Świeżo wypreparowane preparaty są najpierw przenoszone do płytki 24-dołkowej i utrwalane poprzez imersję w paraformaldehydzie. Następnie przeprowadzana jest seria inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi, a następnie z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z fluorochromem, z przerywającymi je etapami przemywania.Po barwieniu preparaty całych organów poddaje się mikrodysekcji, aby oddzielić cienką warstwę ściany bocznej zawierającą strefę podkomorową od pozostałej części preparatu obejmującej leżące poniżej warstwy i korę. Ten cienki, płaski fragment tkanki zostaje następnie przeniesiony na szkiełko i przykryty szkiełkiem nakrywką, aby utrwalić preparaty do barwienia immunocytochemicznego. Płytka 24-dołkowa zawierająca 4% paraformaldehydu i 0,1% Triton X 100 w lodzie.W dygestorium chemicznym delikatnie zanurz preparat komory brzusznej zamocowany w otworze (hole mount), stroną komorową do góry, w jednej z dolek płytki. Próbkę utrwalaj przez noc w temperaturze 4 °C, odessij utrwalacz, a następnie za pomocą pipety transferowej ostrożnie przemyj preparat w roztworze XPBS z 0,1% Triton X 100 trzy razy po pięć minut. Podczas wszystkich etapów przenoszenia cieczy pipetuj delikatnie przy ściance dołki, aby uniknąć obrócenia preparatu i uszkodzenia tkanki.Dodaj roztwór blokujący zawierający Triton X oraz 10% normalnej surowicy koziej w XPBS, stosując do 2% Triton X, w zależności od wymaganej głębokości penetracji przeciwciał. Inkubuj cały preparat w roztworze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie usuń roztwór blokujący.Dodać przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym i inkubować w temperaturze 4°C przez 24 lub 48 godzin, w zależności od badanego antygenu. Przemyć, wykonując dwa szybkie płukania w 1x PBS z tritonem X, a następnie przeprowadzić trzy przemycia po 20 minut każde w temperaturze pokojowej. Dodać przeciwciała drugorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym i inkubować w temperaturze 4°C przez taki sam czas, jak w przypadku przeciwciał pierwszorzędowych. Przemyć w ten sam sposób, co w przypadku przeciwciał pierwszorzędowych. Kolejna seria kroków demonstruje, jak wypreparować samą ścianę boczną z pozostałej części preparatu całego jako pojedynczy płaski okaz. Może on następnie zostać zamontowany do obrazowania o wysokiej rozdzielczości.Przenieś preparat całego mózgu po barwieniu immunologicznym do czystej szalki sekcyjnej wypełnionej 1x PBS, pod mikroskop stereo, przesuwając się od strony tylnej do przedniej. Za pomocą noża do nakłuwania usuń korę grzbietową oraz leżące pod nią białe ciałomóżdżkowe, aby uwidocznić granicę między strefą podkomorową a prążkowiem. Następnie wykonaj długie poziome cięcie wzdłuż brzusznej strony całego preparatu.Za pomocą pęsety precyzyjnej ułożyć tkankę na nowej płaskiej krawędzi tak, aby powierzchnia grzbietowa była skierowana ku górze. Strefa podkomorowa stanowi cienki pas jednorodnej różowej tkanki, podczas gdy prążkowie jest nacieknięte pasmami istoty białej. Użyć pęsety jak dwóch pinezek w obszarze stri AUM, aby przymocować tkankę, nie uszkadzając ściany komory.Zacznij od strony przedniej. Używając noża do nacięć (stab knife), ostrożnie rozpocznij cięcie pomiędzy prążkowiem a strefą podkomorową. Ważne jest, aby prowadzić cięcia równolegle do powierzchni komory i zachować stałą grubość preparowanego tkanki.W miarę jak strefa podkomorowa cieńszeje w kierunku tylnym, należy ostrożnie usunąć z preparatów typu hole mount wszystkie otaczające tkanki, które nie stanowią części ściany komory. Preparat hole mount powinien mieć jednorodną grubość od 200 do 300 micrometers.Za pomocą pęsety unieść fragment tkanki od dołu i przenieść go na szkiełko przedmiotowe. Nanieść medium montażowe, a następnie przykryć szkiełkiem nakrywkowe. Należy starać się nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.Przechowywać preparaty poziomo w albumie do szkiełek w temperaturze 4 °C przez jeden do dwóch dni, aby szkiełka nakrywkowe osiadły przed obrazowaniem próbek. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki immunobarwienia całego preparatu oraz analizy przepływu. Pierwszy obraz to widok przy niskim powiększeniu barwienia całego preparatu na doublecortin, marker neuroblastów, który obrazuje sieć łańcuchów migrujących młodych neuronów w dorosłej strefie podkomorowej.Następnie przedstawiono kolejny obraz przy małym powiększeniu preparatu całego organu, w którym KI 67 wybarwiono na zielono, a naczynia krwionośne na czerwono, co przy większym powiększeniu ilustruje niedawno opisane bliskie oddziaływanie między dzielącymi się komórkami a układem naczyniowym w strefie podkomorowej. Kolejny obraz przedstawia zdjęcie konfokalne powierzchni komory, gdzie powierzchnia apikalna komórek wyścielających komorę została obrysowana beta-kateniną (barwienie na zielono), a ciałka podstawne tych komórek zostały oznakowane gamma-tubuliną (na czerwono). Ostatni obraz przy dużym powiększeniu jest maksymalną projekcją stosu konfokalnego wykonanego z barwienia preparatu całego organu na GFAP, ukazującą długie, dodatnie pod kątem GFAP włókna podstawne komórek typu B1 strefy SVZ, służące do analizy przepływu, kierunku i prędkości CSF na powierzchni komory.Kolejne klatki z filmów przepływu dodatku mogą zostać połączone w jeden obraz kompozytowy. Obrazy kompozytowe te pokazują pozycję pojedynczych kulek w różnych punktach czasowych podczas przemieszczania się przez dodatek lub powierzchnię. Oto przykład tego, jak wyglądają gotowe wyniki.Właśnie zaprezentowano sposób przygotowania preparatów całych warstw (whole mounts) z strefy podkomorowej bocznej ściany komory bocznej. Metoda ta zapewnia widok całej ściany i umożliwiła dokonanie wielu odkryć na przestrzeni lat, w tym zaobserwowanie, że ta strefa komorowa jest zorganizowana jako sieć szlaków dla migracji łańcuchowej. Pozwoliło to również na zbadanie przepływu płynu w tej części, a pośrednio zasugerowało sposoby, w jakie komórki te kierują swoją migrację poprzez tę niezwykle rozbudowaną sieć szlaków.W ostatnim czasie technika ta pozwoliła nam odkryć, że strefa podkomorowa jest zorganizowana w postaci tzw. kółek (pin wheels), z komórkami macierzystymi w ich centrum, co ujawnia optyczne zakończenie komórek macierzystych w obrębie tej struktury. Ponieważ preparaty całych organów (whole mount) umożliwiają pełną perspektywę strefy komorowej, zapewniają one wgląd, którego nie dają skrawki, dlatego udostępniamy tę metodę wszystkim, gdyż powinna okazać się przydatna w wielu innych badaniach. Istnieje kilka kluczowych zasad, o których należy pamiętać podczas przygotowywania preparatów całych organów, aby usprawnić proces sekcji.Po pierwsze, należy zapewnić odpowiednie oświetlenie – dostosuj je tak, aby rzucało cień na uchwyt otworu. Zapewni to kontrast i wskaże miejsca, w których należy wykonać cięcia. Po drugie, użyj pęsety jako dwóch ruchomych pinów.Nie należy używać pęsety do ściskania lub podnoszenia tkanki. Należy ją traktować raczej jako dwa ruchome punkty podparcia, które zabezpieczą tkankę podczas cięcia. Po trzecie, należy stosować kombinację ogólnej retrakcji i cięcia.Jak można zauważyć podczas preparowania, w rzeczywistości wykonuje się bardzo niewiele nacięć tkanek. Większość preparacji odbywa się poprzez ogólną retrakcję podczas drugiej rundy sekcji, kiedy oddziela się ścianę boczną od pozostałej części preparatu całego.Najważniejsze jest wykonanie cięć w płaszczyźnie równoległej do płaszczyzny powierzchni komory. Zapewni to jednolitą grubość tkanki w przekroju przednio-tylnym wzdłuż ściany bocznej. Pozwoli to również uzyskać obrazy skupione w jednej płaszczyźnie podczas obrazowania konfokalnego o wysokiej rozdzielczości.Mamy nadzieję, że ten film okaże się pomocny w Państwa studiach. Powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

the-subventricular-zone-en-face-wholemount-staining-and-ependymal-flow

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Strefa podkomorowa En-face: Barwienie całej preparacji i przepływ ependymalny

Obwody neuronalne są zorganizowane topograficznie w przedziały funkcjonalne o specyficznych profilach molekularnych. W niniejszej pracy przedstawiamy praktyczne i techniczne kroki służące do ujawnienia globalnej topografii mózgu z wykorzystaniem wszechstronnego podejścia opartego na barwieniu immunohistochemicznym całych preparatów (wholemount). Demonstrujemy użyteczność tej metody, wykorzystując dobrze poznaną cytoarchitekturę i obwody móżdżku.

Immunohistochemia całego preparatu w celu ujawnienia złożonej topografii mózgu

Opisano metodę wprowadzania barwników wskaźnikowych wapnia do komórek strefy podkomorowej (SVZ) w celu rejestracji aktywności wapniowej. Potnatalna SVZ zawiera gęsto upakowane komórki, w tym komórki progenitorowe neuronów oraz neuroblasty. Zamiast ładowania metodą kąpielową, barwnik wstrzykiwano pod ciśnieniem bezpośrednio do tkanki, co pozwoliło na lepszą dyfuzję barwnika.

Przygotowanie ostrych skrawków strefy podkomorowej do obrazowania wapnia

Korzystając z rezonansu magnetycznego (człowieka), oprogramowania do obrazowania 3D i analizy immunohistologicznej, dokumentujemy zmiany w bocznych komorach mózgu. Podłużne mapowanie 3D zmian objętości komór bocznych i charakterystyka okołokomorowych zmian komórkowych, które zachodzą w ludzkim mózgu z powodu starzenia się lub choroby, są następnie modelowane u myszy.

Modelowanie 3D komór bocznych i charakterystyka histologiczna tkanki okołokomorowej u ludzi i myszy

Tutaj opisujemy procedurę opartą na wykorzystaniu cząsteczek lentiwirusowych do długoterminowej modyfikacji genetycznej nerwowych komórek macierzystych i/lub ich sąsiadujących komórek wyściółkowych w dorosłej komorowo-podkomorowej niszy neurogennej, która pozwala na oddzielną analizę autonomicznych i nieautonomicznych, zależnych od niszy efektów na neuronalne komórki macierzyste.

Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół oparty na mikroskopii do obrazowania w wysokiej rozdzielczości oraz trójwymiarową rekonstrukcję mysiego układu nerwowo-naczyniowego i bariery krew-mózg za pomocą swobodnie pływających odcinków mózgu. Metoda ta pozwala na wizualizację, analizę i kwantyfikację organelli wewnątrzkomórkowych w BBB.

Obrazowanie konfokalne bariery krew-mózg w wysokiej rozdzielczości: obrazowanie, rekonstrukcja 3D i kwantyfikacja transcytozy

Celem tego protokołu jest odizolowanie mikronaczyń z wielu regionów ośrodkowego układu nerwowego kręgowców lizencefalicznych i gyrencefalicznych.

Niezawodna izolacja mikronaczyń ośrodkowego układu nerwowego w pięciu grupach kręgowców

Ten artykuł przedstawia krok po kroku protokół bezpośredniego wszczepienia kaniuli w cisterna magna świń.<br...

Bezpośrednia implantacja kaniuli w Cisterna magna świń

Ten protokół opisuje skuteczne i powtarzalne podejście do badań histologicznych mózgu myszy, w tym perfuzję, sekcję mózgu, swobodne barwienie immunologiczne, montowanie tkanek i obrazowanie.

Swobodne barwienie immunologiczne mózgów myszy

Sekcja kriogeniczna pozwala na świeże, zamrożone przygotowanie największej niszy neurogennej w mysim mózgu do głębokiej ilościowej analizy proteomu. Metoda jest precyzyjna, skuteczna i powoduje minimalne zaburzenia tkanek. Dlatego idealnie nadaje się do badania mikrośrodowiska molekularnego tej niszy, a także innych narządów, regionów i gatunków.

Kriosekcja strefy podwyściółkowej dorosłego osobnika w celu dokładnej i głębokiej ilościowej analizy proteomu

Splot naczyniówkowy (CP), niedostatecznie zbadana tkanka w neurobiologii, odgrywa kluczową rolę w zdrowiu i chorobie ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje technikę mikrodysekcji w celu wyizolowania CP i zastosowanie skaningowej mikroskopii elektronowej w celu uzyskania ogólnego obrazu jego struktury komórkowej.

Mikrodysekcja i skaningowa mikroskopia elektronowa z całym mocowaniem Wizualizacja splotu naczyniówkowego myszy

Metoda izolacji nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych oligodendrocytów z mózgów żywych szczurów jest tutaj przedstawiona w szczegółach eksperymentalnych. Pozwala to na wielokrotne pobieranie tych komórek od tych samych zwierząt bez uszczerbku dla ich dobrostanu.

Metoda "dojenia mózgu" do izolacji nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych oligodendrocytów od żywych szczurów

Poznaj technikę całomontażową ścian komory bocznej w badaniach neurogenezy u myszy. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę przepływu płynu mózgowo-rdzeniowego i aktywności komórek wyściółkowych.

Strefa podkomorowa en-face: barwienie całego preparatu i przepływ ependymalny

Przeglądaj więcej filmów