Strefa podkomorowa en-face: barwienie całego preparatu i przepływ ependymalny

Cześć, jestem Zaman. Jestem z zespołem Arturo Alvareza. Jesteśmy dziś w laboratorium Arturo, które funkcjonuje w ramach Katedry Neurochirurgii oraz Eli Edith Broad Center for Regeneration Medicine and Stem Cell Research, i pokażemy wam, jak przygotowujemy preparaty całych fragmentów ścian komór bocznych.

Takie preparaty całych organów mogą być wykorzystywane zarówno po utrwaleniu do barwienia immunocytochemicznego, jak i w formie preparatów żywych do analizy przepływu płynu. Technika przygotowania całych preparatów, którą Mann zaprezentuje dzisiaj, była opracowywana w laboratorium przez lata i udoskonalona w celu badania całej ściany komory bocznej, w tym komórek splotowych oraz towarzyszącej im aktywności zarodkowej w strefie podkomorowej, w której znajdują się neuralne komórki macierzyste. Została ona pierwotnie opracowana przez Fiona Dutch, a następnie udoskonalona przez HIE Victor i Casu Moto.

Wszystkie z nich nie znajdują się już w laboratorium. Poniższe schematy ilustrują sposób przygotowania preparatu całego fragmentu ściany bocznej komory bocznej. Mózg zostaje najpierw podzielony na dwie półkule.

Wykonuje się cięcie wieńcowe w części tylnej, aby odsłonić hipokamp i przekrój poprzeczny pokazany tutaj na fioletowo. Ściana przyśrodkowa, pokrywająca hipokamp i zaznaczona kolorem fioletowym, jest następnie oddzielana od ściany bocznej, która pokrywa ciałomózgowia i jest pokazana na różowo. Obie ściany zostaną rozchylone od siebie, podobnie jak przy otwieraniu książki, a następnie ściana przyśrodkowa zostanie odcięta, pozostawiając odsłoniętą ścianę boczną.

Pierwsza część tego filmu omawia sekcję preparatu w całości, jednak nie musi to być pierwszy krok. Chronologicznie, jeśli planowana jest analiza przepływu w prączku, należy zapoznać się ze szczegółami w protokole pisemnym. Przed każdą sekcją należy upewnić się, że wszystkie narzędzia są sterylne i znajdują się pod ręką. Sześcicentymetrową szalkę do sekcji z medium L 15 leitz o temperaturze 37 °C należy umieścić pod fluorescencyjnym stereomikroskopem sekcyjnym, a następnie przełożyć świeżo wypreparowany mózg myszy do szalki pod mikroskopem.

Za pomocą pęsety precyzyjnej odseparować opary węchowe. Używając noża do nacięć, podzielić mózg na dwie półkule. Wykonać cięcie wieńcowe na tylnym końcu jednej z półkul.

Aby odsłonić grzbietowy hipokamp i wykonać jego przekrój poprzeczny, należy wprowadzić nóż do małej przestrzeni komorowej między korą a hipokampem, a następnie przeciąć tkankę, aby uwolnić korę w miejscu jej grzbietowego połączenia z hipokampem. Wyciąć klin kory w narożniku i za pomocą precyzyjnej pęsety powoli oddzielić ją od hipokampu. Kontynuować oddzielanie kory wzdłuż jej przebiegu aż do brzusznej krawędzi hipokampu.

Za pomocą noża do nakłuwania odseparuj hipokamp od brzusznych części kory. Używając noża i precyzyjnej pęsety, odsunie hipokamp od kory. Przesuwaj się ostrożnie w kierunku przednim, aby nie uszkodzić ścian komór.

Dwie ściany powinny rozchylać się na zewnątrz. Podobnie jak w przypadku książki, należy odciąć za pomocą noża części kory wystające poza ścianę boczną. Aby lepiej uwidocznić tę powierzchnię w miarę wzrostu oporu przy odsuwaniu tkanek, konieczne będzie wykonanie dwóch dodatkowych cięć.

Jedno cięcie grzbietowo, w miejscu styku ścian przyśrodkowej i bocznej, oraz analogiczne cięcie brzusznie. Do wykonania tych nacięć należy użyć krótkich ruchów noża do nakłuwania. Dodatkowe cięcia te pozwalają na dalsze odsuniecie ściany przyśrodkowej, aby odsłonić przednią część komory.

Dostosuj oświetlenie tak, aby cienie ukazały miejsce styku ścian przyśrodkowej i bocznej, przypominające dolinę między dwiema ścianami. Za pomocą noża wykonaj cięcie dokładnie w tej dolinie, usuwając wzgórze oraz wszelkie nawisające fragmenty kory.

Preparaty z otworem powinny zostać wykorzystane niezwłocznie do analizy przepływu płynu. W przypadku przygotowywania preparatów z otworem do barwienia immunocytochemicznego, można przeprowadzić sekcję wielu próbek podczas jednej sesji, pod warunkiem zanurzania ich w utrwalaczu natychmiast po zakończeniu preparacji. Kolejna część filmu zaprezentuje sposób przeprowadzania testów przepływu płynu generowanego przez rzęski komórek nabłonka oponowego.

Zastosowanie fluorescencyjnych mikrokulek. Świeżo wypreparowany otwór w ścianie bocznej jest najpierw mocowany do szalki sekcyjnej za pomocą dwóch szpilek entomologicznych. Następnie końcówka szklanej mikropipety wypełnionej fluorescencyjnymi mikrokulkami jest opuszczana na powierzchnię preparatu w całości, a fluorescencyjne kulki są delikatnie naniesione na powierzchnię podczas rejestracji time-lapse.

Wideo rejestruje ruch kulek w teście przepływu wyrostków. Przed przeprowadzeniem preparacji całego preparatu należy przygotować szklaną mikropipetę, zgodnie z opisem zawartym w części pisemnej niniejszego protokołu. Gotowa pipeta powinna mieć gładki, płytki stożek oraz skos pod kątem 45 stopni z średnicą wewnętrzną wynoszącą około 100 micrometers.

Wypełnij pipetę olejem mineralnym w połowie jej długości, wykorzystując zjawisko kapilarne. Wprowadź tłok nasmarowany smarem próżniowym do tylnej części pipety. Następnie dociśnij go, aby przesunąć menisk oleju aż do końcówki pipety.

Zamocuj pipetę z tłokiem do mikromanipulatora na regulowanym ramieniu. Napełnij pipetę od przodu roztworem zawierającym 50% fluorescencyjnych mikrokulek, 5% glicerolu i 45% wody. Wykonaj świeżą preparację z otworem zgodnie z wcześniejszym opisem i przenieś ją stroną komór upar do czystej szalki sekcyjnej wypełnionej roztworem o temperaturze 37 °C.

W medium Leitz unieruchom uchwyt w naczyniu do sekcji, używając dwóch szpilek entomologicznych w wzgórzu oraz w przedniej części kory grzbietowej. Umieść podstawę statywu z mikromanipulatorem obok stereomikroskopu, utrzymując ramię w górze, aby uniknąć złamania igły mikropipety. Zanurz końcówkę mikropipety w probówce z medium, aby oczyścić jej zewnętrzną stronę z mikrokulek.

Należy uważać, aby nie złamać końcówki. Umieść końcówkę pipety nad powierzchnią grzbietową ściany bocznej i opuść ramię tak, aby końcówka pipety znalazła się tuż nad powierzchnią tkanki. Ustaw ostrość na pole widzenia obejmujące przednią połowę uchwytu z otworem i rozpocznij rejestrację pożądanych obrazów.

Użyj tłoka, aby wprowadzić około pięciu litrów mikrokulek na powierzchnię mocowania otworu. Gdy początkowa porcja kulek zostanie usunięta z powierzchni przez przepływ osłonowy, użyj tłoka, aby wprowadzić kolejne serie mikrokulek o objętości pięciu nanolitrów. Przepływ, kierunek i prędkość można przeanalizować na podstawie zarejestrowanego materiału wideo.

Ostatnia część tego filmu demonstruje sposób immunobarwienia preparatów z całego otworu (hole mounts) oraz ich montażu na szkiełkach do obrazowania konfokalnego. Świeżo wypreparowane preparaty są najpierw przenoszone do płytki 24-dołkowej i utrwalane poprzez imersję w paraformaldehydzie. Następnie przeprowadzana jest seria inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi, a następnie z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z fluorochromem, z przerywającymi je etapami przemywania.

Po barwieniu preparaty całych organów poddaje się mikrodysekcji, aby oddzielić cienką warstwę ściany bocznej zawierającą strefę podkomorową od pozostałej części preparatu obejmującej leżące poniżej warstwy i korę. Ten cienki, płaski fragment tkanki zostaje następnie przeniesiony na szkiełko i przykryty szkiełkiem nakrywką, aby utrwalić preparaty do barwienia immunocytochemicznego. Płytka 24-dołkowa zawierająca 4% paraformaldehydu i 0,1% Triton X 100 w lodzie.

W dygestorium chemicznym delikatnie zanurz preparat komory brzusznej zamocowany w otworze (hole mount), stroną komorową do góry, w jednej z dolek płytki. Próbkę utrwalaj przez noc w temperaturze 4 °C, odessij utrwalacz, a następnie za pomocą pipety transferowej ostrożnie przemyj preparat w roztworze XPBS z 0,1% Triton X 100 trzy razy po pięć minut. Podczas wszystkich etapów przenoszenia cieczy pipetuj delikatnie przy ściance dołki, aby uniknąć obrócenia preparatu i uszkodzenia tkanki.

Dodaj roztwór blokujący zawierający Triton X oraz 10% normalnej surowicy koziej w XPBS, stosując do 2% Triton X, w zależności od wymaganej głębokości penetracji przeciwciał. Inkubuj cały preparat w roztworze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie usuń roztwór blokujący.

Dodać przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym i inkubować w temperaturze 4°C przez 24 lub 48 godzin, w zależności od badanego antygenu. Przemyć, wykonując dwa szybkie płukania w 1x PBS z tritonem X, a następnie przeprowadzić trzy przemycia po 20 minut każde w temperaturze pokojowej. Dodać przeciwciała drugorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym i inkubować w temperaturze 4°C przez taki sam czas, jak w przypadku przeciwciał pierwszorzędowych. Przemyć w ten sam sposób, co w przypadku przeciwciał pierwszorzędowych. Kolejna seria kroków demonstruje, jak wypreparować samą ścianę boczną z pozostałej części preparatu całego jako pojedynczy płaski okaz. Może on następnie zostać zamontowany do obrazowania o wysokiej rozdzielczości.

Przenieś preparat całego mózgu po barwieniu immunologicznym do czystej szalki sekcyjnej wypełnionej 1x PBS, pod mikroskop stereo, przesuwając się od strony tylnej do przedniej. Za pomocą noża do nakłuwania usuń korę grzbietową oraz leżące pod nią białe ciałomóżdżkowe, aby uwidocznić granicę między strefą podkomorową a prążkowiem. Następnie wykonaj długie poziome cięcie wzdłuż brzusznej strony całego preparatu.

Za pomocą pęsety precyzyjnej ułożyć tkankę na nowej płaskiej krawędzi tak, aby powierzchnia grzbietowa była skierowana ku górze. Strefa podkomorowa stanowi cienki pas jednorodnej różowej tkanki, podczas gdy prążkowie jest nacieknięte pasmami istoty białej. Użyć pęsety jak dwóch pinezek w obszarze stri AUM, aby przymocować tkankę, nie uszkadzając ściany komory.

Zacznij od strony przedniej. Używając noża do nacięć (stab knife), ostrożnie rozpocznij cięcie pomiędzy prążkowiem a strefą podkomorową. Ważne jest, aby prowadzić cięcia równolegle do powierzchni komory i zachować stałą grubość preparowanego tkanki.

W miarę jak strefa podkomorowa cieńszeje w kierunku tylnym, należy ostrożnie usunąć z preparatów typu hole mount wszystkie otaczające tkanki, które nie stanowią części ściany komory. Preparat hole mount powinien mieć jednorodną grubość od 200 do 300 micrometers.

Za pomocą pęsety unieść fragment tkanki od dołu i przenieść go na szkiełko przedmiotowe. Nanieść medium montażowe, a następnie przykryć szkiełkiem nakrywkowe. Należy starać się nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.

Przechowywać preparaty poziomo w albumie do szkiełek w temperaturze 4 °C przez jeden do dwóch dni, aby szkiełka nakrywkowe osiadły przed obrazowaniem próbek. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki immunobarwienia całego preparatu oraz analizy przepływu. Pierwszy obraz to widok przy niskim powiększeniu barwienia całego preparatu na doublecortin, marker neuroblastów, który obrazuje sieć łańcuchów migrujących młodych neuronów w dorosłej strefie podkomorowej.

Następnie przedstawiono kolejny obraz przy małym powiększeniu preparatu całego organu, w którym KI 67 wybarwiono na zielono, a naczynia krwionośne na czerwono, co przy większym powiększeniu ilustruje niedawno opisane bliskie oddziaływanie między dzielącymi się komórkami a układem naczyniowym w strefie podkomorowej. Kolejny obraz przedstawia zdjęcie konfokalne powierzchni komory, gdzie powierzchnia apikalna komórek wyścielających komorę została obrysowana beta-kateniną (barwienie na zielono), a ciałka podstawne tych komórek zostały oznakowane gamma-tubuliną (na czerwono). Ostatni obraz przy dużym powiększeniu jest maksymalną projekcją stosu konfokalnego wykonanego z barwienia preparatu całego organu na GFAP, ukazującą długie, dodatnie pod kątem GFAP włókna podstawne komórek typu B1 strefy SVZ, służące do analizy przepływu, kierunku i prędkości CSF na powierzchni komory.

Kolejne klatki z filmów przepływu dodatku mogą zostać połączone w jeden obraz kompozytowy. Obrazy kompozytowe te pokazują pozycję pojedynczych kulek w różnych punktach czasowych podczas przemieszczania się przez dodatek lub powierzchnię. Oto przykład tego, jak wyglądają gotowe wyniki.

Właśnie zaprezentowano sposób przygotowania preparatów całych warstw (whole mounts) z strefy podkomorowej bocznej ściany komory bocznej. Metoda ta zapewnia widok całej ściany i umożliwiła dokonanie wielu odkryć na przestrzeni lat, w tym zaobserwowanie, że ta strefa komorowa jest zorganizowana jako sieć szlaków dla migracji łańcuchowej. Pozwoliło to również na zbadanie przepływu płynu w tej części, a pośrednio zasugerowało sposoby, w jakie komórki te kierują swoją migrację poprzez tę niezwykle rozbudowaną sieć szlaków.

W ostatnim czasie technika ta pozwoliła nam odkryć, że strefa podkomorowa jest zorganizowana w postaci tzw. kółek (pin wheels), z komórkami macierzystymi w ich centrum, co ujawnia optyczne zakończenie komórek macierzystych w obrębie tej struktury. Ponieważ preparaty całych organów (whole mount) umożliwiają pełną perspektywę strefy komorowej, zapewniają one wgląd, którego nie dają skrawki, dlatego udostępniamy tę metodę wszystkim, gdyż powinna okazać się przydatna w wielu innych badaniach. Istnieje kilka kluczowych zasad, o których należy pamiętać podczas przygotowywania preparatów całych organów, aby usprawnić proces sekcji.

Po pierwsze, należy zapewnić odpowiednie oświetlenie – dostosuj je tak, aby rzucało cień na uchwyt otworu. Zapewni to kontrast i wskaże miejsca, w których należy wykonać cięcia. Po drugie, użyj pęsety jako dwóch ruchomych pinów.

Nie należy używać pęsety do ściskania lub podnoszenia tkanki. Należy ją traktować raczej jako dwa ruchome punkty podparcia, które zabezpieczą tkankę podczas cięcia. Po trzecie, należy stosować kombinację ogólnej retrakcji i cięcia.

Jak można zauważyć podczas preparowania, w rzeczywistości wykonuje się bardzo niewiele nacięć tkanek. Większość preparacji odbywa się poprzez ogólną retrakcję podczas drugiej rundy sekcji, kiedy oddziela się ścianę boczną od pozostałej części preparatu całego.

Najważniejsze jest wykonanie cięć w płaszczyźnie równoległej do płaszczyzny powierzchni komory. Zapewni to jednolitą grubość tkanki w przekroju przednio-tylnym wzdłuż ściany bocznej. Pozwoli to również uzyskać obrazy skupione w jednej płaszczyźnie podczas obrazowania konfokalnego o wysokiej rozdzielczości.

Mamy nadzieję, że ten film okaże się pomocny w Państwa studiach. Powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.