Name: Cienkie cięcie preparatów plastrów do immunohistochemii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Naucz się cienkiego cięcia preparatów plastrów do immunohistochemii w małych próbkach tkanek mózgu. Ta metoda zapewnia powtarzalne wyniki i ułatwia badania w neurobiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol>
<li>Przygotować formę z taśmy dla platformy OCT.</li>
<li>Wypełnić formę związkiem OCT. Zamrozić w kriostacie lub przy użyciu kruszonego suchego lodu.</li>
<li>Usunąć taśmę z wokół zamrożonej platformy OCT.</li>
<li>Wyrównać oznaczenia na uchwycie mrożącym i stole montażowym kriostatu, a następnie zablokować w uchwycie.</li>
<li>Przeciąć platformę OCT aż do uzyskania płaskiej powierzchni.</li>
<li>Wyjąć wyrównaną platformę OCT i umieścić ją na stole mrożącym kriostatu.</li>
<li>Umieścić próbkę tkanki (wcześniej krio konserwowaną w 30% glicerolu lub sacharozie w PBS) w OCT.</li>
<li>Przygotować kolumnę mrożącą z zewnętrznym pierścieniem wystającym około 5 mm ponad górną krawędź kolumny, tworząc wgłębienie dla OCT.</li>
<li>Ostrożnie umieścić próbkę tkanki w centrum powierzchni kolumny mrożącej i powoli dodawać OCT, aż wgłębienie zostanie wypełnione.</li>
<li>Otoczyć kolumnę mrożącą kruszonym suchym lodem. Tkanka i OCT powinny całkowicie zamarznąć w ciągu 20-60 sekund.</li>
<li>W miarę wzrostu temperatury preparatu, zewnętrzny pierścień można usunąć, podczas gdy próbka pozostaje zamrożona.</li>
<li>Zsunąć próbkę z kolumny mrożącej bokiem i umieścić w kriostacie.</li>
<li>Nanieść kroplę OCT na powierzchnię platformy OCT i umieścić preparat (tkanką do dołu), wywierając silny nacisk. Preparat szybko zamarznie na platformie OCT.</li>
<li>Zabezpieczyć uchwyt na stole montażowym kriostatu z wyrównanymi oznaczeniami.</li>
<li>Przeciąć warstwę OCT znajdującą się nad preparatem tkankowym.</li>
<li>Przenieść cienkie przekroje metodą thaw-mount na szkiełka przedmiotowe i przechowywać w stanie zamrożonym lub w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Reakcje immunochemiczne można przeprowadzać dla tkanek zamontowanych na szkiełkach przedmiotowych.</li>
<li>Odczyn zostaje naniesiony na szkiełko, można go delikatnie mieszać, a w przypadku substancji światłoczułych – przykryć.</li>
<li>Kolejne etapy reakcji wykonuje się łatwo poprzez odwrócenie szkiełka nad pojemnikiem na odpady, osuszenie krawędzi szkiełka i naniesienie kolejnego odczynnika.</li>
</ol>

<ol><li>Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+fixation+of+research+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Today%22%5BJournal%5D)">Perfusion fixation of research animals.</a> Microsc. Today. 14, 26-33 (2006).</li>
<li>Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diminished+serotonergic+innervation+of+adult+medial+prefrontal+cortex+after+6-OHDA+lesions+in+the+newborn+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Dev.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat.</a> Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).</li>
</ol>

Przedstawiony tutaj protokół dostarcza badaczom zwięzłego i łatwego do naśladowania opisu sposobu uzyskiwania cienkich przekrojów kriostatowych z małych, trudnych do manipulacji fragmentów tkanek, takich jak biopsje i plastry mózgu, do dalszych badań, m.in. za pomocą różnych metod barwienia, hybrydyzacji in situ lub immunohistochemii.

<table><tbody><tr><td>O. C. T.</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>27050</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór glicerolu</td><td></td><td></td><td>30% roztwór glicerolu w PBS w/v</td></tr><tr><td>Roztwór sacharozy</td><td></td><td></td><td>30% roztwór sacharozy w PBS w/v</td></tr></tbody></table>

przygotowywanie cienkich przekrojów z preparatów slice do immunohistochemii

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Wiele badań w dziedzinie neuronauki, jak i w innych dyscyplinach, wiąże się z analizą niewielkich, lecz makroskopowych fragmentów lub przekrojów tkanek, które zostały utrwalone, pobrane na świeżo lub wycięte, lecz utrzymane przy życiu, jak ma to miejsce w preparatach skrawków tkanki mózgowej. Późniejsze badania mikroskopowe tego materiału mogą być problematyczne ze względu na trudności w manipulowaniu próbkami tkanki. Przedstawiona tutaj metoda pozwala na uzyskanie cienkich cięć tkanki za pomocą kriotomu, o grubości wynoszącej od 0,2 do 5,0 mm. Standardowo wykonujemy seryjne cięcia koronalne o grubości 5–10 mikronów z plastrów mózgu o grubości 400 mikronów, wyciętych za pomocą wibratomu. Plastry te są zazwyczaj najpierw wykorzystywane w eksperymentach elektrofizjologicznych, a następnie wymagają analizy mikroskopowej cytoarchitektoniki regionu, z którego uzyskano zapisy. Skonstruowaliśmy proste urządzenie, które umożliwia kontrolowane i powtarzalne przygotowanie oraz pozycjonowanie skrawka tkanki. Urządzenie to składa się z cylindra o długości 5 cm i średnicy 1,2 cm, który służy jako podłoże do zamrażania skrawka. Pierścień ciasno nasuwa się na cylinder, tworząc ścianki wokół skrawka, co pozwala na zanurzenie tkanki w środku do zamrażania (np. OCT). Następnie próbka jest szybko zamrażana za pomocą kruszonego suchego lodu, a powstały dysk można łatwo ustawić do cięcia w kriotomie. Cienkie skrawki można zamontować na powlekłych szkiełkach przedmiotowych poprzez rozmrażanie, co umożliwia przeprowadzenie dalszych badań, takich jak różne metody barwienia, hybrydyzacja in situ lub immunohistochemia, co zostało tutaj zademonstrowane.

Przedstawiona metoda umożliwia powtarzalne wykonywanie seryjnych cięć w kriosztacie z małych, trudnych w obsłudze fragmentów tkanek, takich jak biopsjaty i skrawki mózgu. Wykorzystujemy prosty aluminiowy blok mrożący, aby ułatwić manipulację tkanką, oraz standardowy kriosztat do rutynowego przygotowywania seryjnych przekrojów o grubości 5-10 micron z fragmentów mózgu o grubości 400 micron.

Przygotowywanie cienkich przekrojów z preparatów slice do immunohistochemii

Wiele badań w neuronauce, jak i w innych dyscyplinach, wiąże się z analizą małych, lecz makroskopowych fragmentów lub przekrojów tkanek, które zostały ...

Witam, nazywam się Jun Park, jestem pracownikiem naukowym w Harvard Medical School oraz studentem medycyny w Y University College of Medicine, Severance Hospital w Korei Południowej. Są to materiały do przygotowania cienkich przekrojów preparatów slice. Przygotowuję formę z taśmy dla platformy OCT.Wypełniam formę OCT i mrożę ją w kriostacie lub używam kruszonego suchego lodu, usuwając TAFE z obszaru wokół zamrożonej platformy OCT. Pokazuję znaki wyrównawcze na mrożonej kredzie i stole montażowym kriostatu, a następnie blokuję kredę. Wykonuję skrawanie przez platformę OCT.Powierzchnia Ontario jest płaska. Usuwam przemyte platformę OCT i umieszczam ją na stole mrożącym kriotomu. Umieszczam tę próbkę w OCT; próbka ta była wcześniej krioskonserwowana w 30% glicerolu lub sacharozie w PBS.Jest to etap przygotowania kolumny mrożącej z pierścieniem zewnętrznym wystającym około pięciu milimetrów ponad górną krawędź formy kolumny, tworząc zagłębienie na OCT. Ostrożnie umieszczam próbkę tkanki na środku powierzchni kolumny mrożącej i powoli dodaję OCT, aż zagłębienie zostanie wypełnione. Następnie otaczam kolumnę mrożącą kruszonym suchym lodem.Tkanka i OCT powinny całkowicie zamarznąć w ciągu 20 do 60 sekund. W miarę jak preparat ogrzewa się, można usunąć zewnętrzny pierścień, podczas gdy próbka pozostaje zamrożona. Jest to etap przesuwania próbki z kolumny mrożącej w bok i umieszczania jej w kriostacie.Nakładam kroplę OCT na powierzchnię platformy OCT i umieszczam próbkę, wywierając nacisk, aby próbka szybko zamarzła na platformie OCT. Jest to etap zabezpieczania próbki na stole montażowym kriostatu z wyrównaniem znaczników. Wykonuję skrawanie przez warstwę OCT nad powierzchnią tkanki próbki.Przenoszę cienkie przekroje tkanek na szkiełka przedmiotowe i przechowuję je w zamrożeniu lub w temperaturze pokojowej; reakcje mogą być przeprowadzane dla tkanek zamocowanych na szkiełkach przedmiotowych. Odczynnik naniesiony na szkiełko można delikatnie wymieszać, a w przypadku substancji światłoczułych – przykryć. Kolejne etapy reakcji wykonuje się łatwo poprzez odwrócenie szkiełka nad pojemnikiem na odpady, opróżnienie szkiełka, a następnie naniesienie kolejnego odczynnika.

thin-sectioning-of-slice-preparations-for-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Cięcie cienkie na preparatach do immunohistologii

Poniższy film opisuje, jak zachować morfologię tkanki za pomocą utrwalania formaliny i zatapiania parafiny.

Konserwacja tkanek zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE): metoda badania morfologii tkanek

Ten protokół wprowadzający opisuje odczynniki, sprzęt i techniki wymagane do przeprowadzenia immunohistochemicznego barwienia mózgów gryzoni, używając jako przykładu markerów dla mikrogleju i elementów neuronalnych.

Podstawa immunohistochemii na kriowyciętej tkance mózgowej szczura: przykładowe barwienie mikrogleju i neuronów

Protokół immunofluorescencji pośredniej opisany w tym artykule pozwala na wykrywanie i lokalizację białek w gruczole sutkowym myszy. Podano kompletną metodę przygotowania próbek gruczołu mlecznego, przeprowadzenia immunohistochemii, obrazowania skrawków tkanek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz rekonstrukcji obrazów.

Immunofluorescencja pośrednia na zamrożonych odcinkach mysiego gruczołu sutkowego

Wiele typów ludzkich guzów mózgu jest zlokalizowanych w określonych regionach mózgu i są trudne do wyhodowania w kulturze. Protokół ten odnosi się do roli mikrośrodowiska guza i bada nowe terapie lekowe poprzez analizę fluorescencyjnych pierwotnych komórek guza mózgu rosnących w organotypowym wycinku mózgu myszy.

System kohodowli guzów mózgu/organotypowych plastrów do badania mikrośrodowiska guza i celowanych terapii lekowych

Tutaj oferujemy łatwy, tani i efektywny czasowo protokół chemicznego utrwalania tkanki mózgowej naczelnych za pomocą utrwalacza akroleiny, co pozwala na długoterminową konserwację, która jest zgodna z immunohistochemią dla transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Przygotowanie tkanki mózgowej naczelnych innych niż ludzie do wstępnego zatopienia immunohistochemii i mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół mający na celu poprawę podziału parafiny. Metoda ta łączy cięcie i pływanie za pomocą prostej studzienki termostatycznej, aby uniknąć procesu przenoszenia wymaganego przez metodę konwencjonalną. W rezultacie znacznie poprawiła się wydajność i liczba nienaruszonych skrawków parafiny.

Metoda cięcia i pływania tkanki zatopionej w parafinie do cięcia

Udostępniamy metodę generowania, hodowli i systematycznej analizy wycinków organotypowych pochodzących z mysich guzów płuc. Opisujemy również, jak zoptymalizować grubość plastra i jak dobrać stężenia leków do leczenia plastrów guza.

Ustalenie i analiza eksplantatów plastrów guza jako warunek wstępny do badań diagnostycznych

Przedstawiono protokół przygotowania swobodnie pływających kultur warstwowych z dorosłego ludzkiego mózgu. Protokół jest odmianą szeroko stosowanej metody hodowli plastrowej z wykorzystaniem wkładek membranowych. Jest prosty, opłacalny i zalecany do przeprowadzania krótkoterminowych testów mających na celu rozwikłanie mechanizmów neurodegeneracji stojących za chorobami mózgu związanymi z wiekiem.

Krótkoterminowe, swobodnie unoszące się w powietrzu kultury warstwowe z dorosłego ludzkiego mózgu

Technika swobodnego pływania pozwala badaczom na wykonywanie barwień histologicznych, w tym immunohistochemii na stałych odcinkach tkanki, w celu wizualizacji struktur biologicznych, typu komórki oraz ekspresji i lokalizacji białek. Jest to wydajna i niezawodna technika histochemiczna, która może być przydatna do badania wielu tkanek, takich jak mózg, serce i wątroba.

Barwienia histologiczne z wykorzystaniem swobodnie unoszących się skrawków tkanek

Ten protokół opisuje niezawodną metodę uzyskiwania wysokiej jakości kriosekcji całych oczu królika. Szczegółowo opisuje procedury sekcji, fiksacji, osadzania i cięcia oczu królika, które można łatwo dostosować do użycia w dowolnym badaniu wykorzystującym immunohistochemię w większych oczach.

Uzyskanie wysokiej jakości kriosekcji całego oka królika

Naucz się cienkiego cięcia preparatów plastrów do immunohistochemii w małych próbkach tkanek mózgu. Ta metoda zapewnia powtarzalne wyniki i ułatwia badania w neurobiologii.

Przygotowywanie cienkich przekrojów z preparatów slice do immunohistochemii

Przeglądaj więcej filmów