Przygotowywanie cienkich przekrojów z preparatów slice do immunohistochemii
28 kwietnia 2007
Przedstawiona metoda umożliwia powtarzalne wykonywanie seryjnych cięć w kriosztacie z małych, trudnych w obsłudze fragmentów tkanek, takich jak biopsjaty i skrawki mózgu. Wykorzystujemy prosty aluminiowy blok mrożący, aby ułatwić manipulację tkanką, oraz standardowy kriosztat do rutynowego przygotowywania seryjnych przekrojów o grubości 5-10 micron z fragmentów mózgu o grubości 400 micron.
Witam, nazywam się Jun Park, jestem pracownikiem naukowym w Harvard Medical School oraz studentem medycyny w Y University College of Medicine, Severance Hospital w Korei Południowej. Są to materiały do przygotowania cienkich przekrojów preparatów slice. Przygotowuję formę z taśmy dla platformy OCT.
Wypełniam formę OCT i mrożę ją w kriostacie lub używam kruszonego suchego lodu, usuwając TAFE z obszaru wokół zamrożonej platformy OCT. Pokazuję znaki wyrównawcze na mrożonej kredzie i stole montażowym kriostatu, a następnie blokuję kredę. Wykonuję skrawanie przez platformę OCT.
Powierzchnia Ontario jest płaska. Usuwam przemyte platformę OCT i umieszczam ją na stole mrożącym kriotomu. Umieszczam tę próbkę w OCT; próbka ta była wcześniej krioskonserwowana w 30% glicerolu lub sacharozie w PBS.
Jest to etap przygotowania kolumny mrożącej z pierścieniem zewnętrznym wystającym około pięciu milimetrów ponad górną krawędź formy kolumny, tworząc zagłębienie na OCT. Ostrożnie umieszczam próbkę tkanki na środku powierzchni kolumny mrożącej i powoli dodaję OCT, aż zagłębienie zostanie wypełnione. Następnie otaczam kolumnę mrożącą kruszonym suchym lodem.
Tkanka i OCT powinny całkowicie zamarznąć w ciągu 20 do 60 sekund. W miarę jak preparat ogrzewa się, można usunąć zewnętrzny pierścień, podczas gdy próbka pozostaje zamrożona. Jest to etap przesuwania próbki z kolumny mrożącej w bok i umieszczania jej w kriostacie.
Nakładam kroplę OCT na powierzchnię platformy OCT i umieszczam próbkę, wywierając nacisk, aby próbka szybko zamarzła na platformie OCT. Jest to etap zabezpieczania próbki na stole montażowym kriostatu z wyrównaniem znaczników. Wykonuję skrawanie przez warstwę OCT nad powierzchnią tkanki próbki.
Przenoszę cienkie przekroje tkanek na szkiełka przedmiotowe i przechowuję je w zamrożeniu lub w temperaturze pokojowej; reakcje mogą być przeprowadzane dla tkanek zamocowanych na szkiełkach przedmiotowych. Odczynnik naniesiony na szkiełko można delikatnie wymieszać, a w przypadku substancji światłoczułych – przykryć. Kolejne etapy reakcji wykonuje się łatwo poprzez odwrócenie szkiełka nad pojemnikiem na odpady, opróżnienie szkiełka, a następnie naniesienie kolejnego odczynnika.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Metoda ta umożliwia powtarzalne seryjne cięcie w kriosztacie małych, trudnych próbek tkanek, w tym biopsji i skrawków mózgu. Wykorzystuje ona prosty aluminiowy blok mrożący w celu ułatwienia manipulacji tkanką oraz standardowy kriosztat do przygotowywania seryjnych skrawków o grubości 5-10 micronów z plastrów mózgu o grubości 400 micronów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Histologia
- Obróbka tkanek
Wstęp
- Kriostatowe seryjne cięcie jest niezbędne do badania małych próbek tkanek.
- Obsługa małych biopsji i skrawków mózgu może być trudna pod względem technicznym.
- Standardowe metody mogą nie zapewniać powtarzalnych wyników.
- Udoskonalone techniki mogą poprawić jakość skrawków tkanek.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody skrawania małych próbek tkanek.
- Ułatwienie manipulacji trudnymi w obróbce fragmentami tkanek.
- Uzyskanie spójnych i wysokiej jakości seryjnych skrawków.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie aluminiowego bloku mrożącego.
- Standardowy kriostat do wykonywania skrawków.
- Przygotowanie skrawków o grubości 5-10 micron.
- Przygotowanie plastrów mózgu o grubości 400 micron.
Główne wyniki
- Skuteczne skrawanie małych próbek tkanek.
- Powtarzalność grubości skrawków.
- Ulepszona obsługa trudnych typów tkanek.
- Spójne przygotowywanie serii skrawków do analizy.
Wnioski
- Metoda ta zwiększa możliwość badania niewielkich próbek tkanek.
- Stanowi ona niezawodne podejście dla badaczy w dziedzinie neuronauki.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować analizę różnych typów tkanek.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsza metoda rozwiązuje problem manipulacji małymi, delikatnymi próbkami tkanek w badaniach z zakresu neuronauki, umożliwiając powtarzalne wykonywanie cienkich przekrojów do późniejszej analizy immunohistochemicznej. Wspiera ona walidację celu i ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez zapewnienie spójnych odczytów histologicznych z obszarów mózgu scharakteryzowanych metodami elektrofizjologicznymi. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych dzięki poprawie jakości danych uzyskiwanych z ograniczonej ilości materiału tkankowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez analizę cytoarchitektoniczną zarejestrowanych obszarów mózgu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne przygotowanie tkanki do barwienia immunohistochemicznego w celu wykrycia kanałów jonowych lub receptorów.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność wyboru celu poprzez powiązanie danych z elektrofizjologii funkcjonalnej z walidacją strukturalną.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie walidowanych systemów biologicznych do przesiewowych badań przeciwciałami oraz detekcji biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie jednorodnej grubości cięć (5-10 µm) w celu uzyskania powtarzalnej intensywności barwienia i ilościowego oznaczenia.
- Wartość platformy: Umożliwienie wykonywania seryjnych cięć z archiwalnych preparatów plastrów dla wysokoprzepustowych procesów barwienia.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zachowuje istotność w kontekście choroby poprzez zabezpieczenie obszarów tkanki zdefiniowanych elektrofizjologicznie w celu korelacji histologicznej.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przejście od odkryć funkcjonalnych do walidacji strukturalnej w modelach przedklinicznych.
- Minimalizacja ryzyka: Redukuje liczbę wyników fałszywie ujemnych w badaniach angażowania celu dzięki niezawodnemu krojeniu i barwieniu.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w proces badawczy, umożliwiając potwierdzenie histologiczne po przeprowadzeniu przesiewu funkcjonalnego na preparatach skrawków mózgu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez umożliwienie walidacji strukturalnej obszarów aktywnych elektrofizjologicznie.
- Screening: Dostarcza gotowe do analizy przekroje tkankowe o stałej grubości, przeznaczone do badań immunohistochemicznych oraz hybrydyzacji in situ.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty morfologiczne, które pomagają porównywać efekty terapeutyczne w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia funkcjonalne z ciągłością przedkliniczną poprzez dopasowanie cytoarchitektoniczne rejestrowanych obszarów.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania metody przetwarzania próbek tkankowych pochodzących z badań elektrofizjologicznych w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez redukcję zmienności w przygotowaniu tkanek do analizy immunohistochemicznej.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność procesu skrawania pomiędzy różnymi użytkownikami i sesjami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), dostarczając wiarygodne dane strukturalne uzupełniające wyniki funkcjonalne.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki danym o walidacji celu o wyższym stopniu pewności.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowaniu tkanek, obsłudze kriostatu oraz w protokołach barwienia immunohistochemicznego.
- Zależne od dostępu do kriostatu, elementów modułu mrożącego oraz związku OCT do zatapiania tkanek.
- Wymaga standaryzacji procedur mrożenia i skrawania pomiędzy laboratoriami w celu uzyskania spójnych wyników.
- Wymaga rozważenia adaptacji metody dla różnych typów tkanek poza przekrojami mózgu, takich jak biopsje lub organoidy.
- Ograniczone koniecznością wcześniejszego wykorzystania przekrojów do elektrofizjologii, co może ograniczać przepustowość w niezależnych procesach histologicznych.
