Name: Ekstrakcja DNA z mikrobów jelitowych termitów (Zootermopsis angusticollis) i wizualizacja drobnoustrojów jelitowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji DNA z mikrobów jelitowych termitów Zootermopsis angusticollis i wizualizację drobnoustrojów. Technika ta umożliwia badanie różnorodności mikrobiomu jelita tylnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podsumowanie procedury ekstrakcji DNA z całego przewodu pokarmowego termitów:
<ol>
<li>Schłodzić termity na lodzie, usunąć jelita za pomocą sterylnych pęset i ustabilizować próbki jelit w buforze.</li>
<li>Zhomogenizować próbki w buforze PVPP/SDS/fenol.</li>
<li>Wyekstrahować i oczyścić DNA z surowego lizatu przy użyciu kolumienek Qiagen DNeasy.</li>
</ol>
Protokół:
<ol>
<li>W warunkach chłodzenia na lodzie, za pomocą sterylnej pęsety usunąć przewody pokarmowe z osobników kasty robotnic termitów.</li>
<li>Natychmiast przenieść przewody pokarmowe wraz z ich zawartością do sterylnej, wolnej od nukleaz probówki zawierającej 50 μL lodowatego, 1x buforu TE klasy biologii molekularnej (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0).&nbsp; Zamrozić próbki w temperaturze -20°C lub przejść bezpośrednio do homogenizacji.&nbsp; </li>
<li>Przenieść próbki przewodów pokarmowych i bufor do sterylnej, wolnej od nukleaz probówki o objętości 2 ml z nakrętką, uprzednio wypełnionej 500 mg sterylnych kulek cyrkoniowo-krzemowych (0,1 mm) oraz 700 μl 1x buforu TE zawierającego 1% w/v poliwiniylopolipirolidonu (PVPP).&nbsp; </li>
<li>Do próbek dodać 50 μl 20% dodecylosiarczanu sodu (SDS) oraz 500 μl fenolu.</li>
<li>Homogenizować (bead-beating) na najwyższym ustawieniu, stosując trzy cykle: 30 s homogenizacji i 30 s chłodzenia na lodzie.</li>
<li>Odwirować nierozpuszczalny materiał przez 1 min przy 8 000x g.</li>
<li>Oczyścić 300-μl aliquoty warstwy wodnej (górnej) za pomocą kolumn Qiagen DNeasy, stosując metodę opisaną dla oczyszczania surowego lizatu.</li>
<li>Oznaczyć ilość kwasów nukleinowych i zamrozić próbki w temperaturze -20°C do późniejszego wykorzystania.</li>
</ol>

<ol><li>Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Direct+Extraction+of+DNA+from+Soils+for+PCR+Analysis+using+Polyvinylpolypyrrolidone+Spin+Columns%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns.</a> FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).</li>
<li>Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Phylogenetic+Identification+of+the+Intestinal+Anaerobic+Microbial+Community+in+the+Hindgut+of+the+Termite%2C+Reticulitermes+Speratus%2C+without+Cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation.</a> Extremophiles. 2, 155-161 (1998).</li>
<li>Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Cell+Lysis+of+Indigenous+Microorganisms+and+Rapid+Extraction+of+Microbial+DNA+from+Sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).</li>
<li>Odelson, D. A., Breznak, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+Fatty+Acid+Production+by+the+Hindgut+Microbiota+of+Xylophagous+Termites%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).</li>
<li>Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Digital+PCR+Enables+Multigene+Analysis+of+individual+Environmental+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria.</a> Science. 314, 1464-1467 (2006).</li>
<li>Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Extraction+of+DNA+and+rRNA+from+Sediments+by+a+Novel+Hydroxyapatite+Spin-Column+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).</li>
<li>Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Genes+of+Tetrahydrofolate-Dependent+Metabolism+from+Cultivated+Spirochaetes+and+the+Gut+Community+of+the+Termite+Zootermopsis+Angusticollis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis.</a> Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).</li>
<li>Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+Diversity%2C+Abundance%2C+and+Axial+Distribution+of+Bacteria+in+the+Intestinal+Tract+of+Two+Soil-Feeding+Termites+%28Cubitermes+spp%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp).</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).</li>
<li>Tsai, Y. L., Olson, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Method+for+Separation+of+Bacterial+DNA+from+Humic+Substances+in+Sediments+for+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction.</a> Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).</li>
</ol>

W naszym doświadczeniu DNA wyizolowane z mikrobiomu gatunków termitów żywiących się drewnem, takich jak Zootermopis nevadensis, jest wystarczająco czyste, by służyć jako matryca do PCR po jednej rundzie ekstrakcji i oczyszczania. Jednakże niektóre termity, np. gatunki żywiące się ściółką lub glebą, mogą mieć w treści jelit wyższe stężenie kwasów huminowych, co może wymagać dodatkowego oczyszczania DNA mikroorganizmów jelitowych. Całkowita wydajność DNA z jelit 5 robotnic Z. nevadensis mieści się w przedziale 10-30 μg. W ...

<table><tbody><tr><td>PVPP/SDS/fenol</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td>bufor do homogenizacji</td></tr><tr><td>DNeasy Tissue Kit</td><td>Zestaw</td><td>Qiagen</td><td>77607</td><td>Stosowany zgodnie z protokołem izolacji genomicznego DNA z surowych lizatów (Dodatek H, instrukcja produktu wersja: lipiec 2003)</td></tr><tr><td>TE</td><td>Bufor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>bufor 1x (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) przygotowany z koncentratu 100x</td></tr><tr><td>kulkowe nośniki z cyrkonii/krzemionki</td><td>Materiały</td><td>Biospec Products</td><td>11079101z</td><td>0.1 mm</td></tr><tr><td>PVPP</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6755</td><td>1% w/v poliwiniylopolipirolidonu przygotowanego z odczynnika suchego jako zawiesina 1x w buforze TE</td></tr><tr><td>Zootermopsis nevadensis</td><td>Zwierzę</td><td></td><td></td><td>Termity</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td>20% roztwór dodecylosiarczanu sodu w wodzie przygotowany z odczynnika suchego</td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77607</td><td>nasycony buforem TE, ~73%</td></tr><tr><td>MiniBeadbeater-8</td><td>Narzędzie</td><td>Biospec Products</td><td>963</td><td></td></tr><tr><td>BSS</td><td>Buforowana roztwór soli, pH 7.2</td><td></td><td></td><td>Skład na litr: 2.5 g K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.0 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl oraz 10 mL roztworu 1 M NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>AxioPlan-2</td><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Wyposażony w obiektyw 40x, optivar 1.6x i soczewki okularowe 10x. Próbki oglądano przy użyciu oświetlenia w kontraście fazowym</td></tr></tbody></table>

izolacja dna z mikroorganizmów jelitowych termita (zootermopsis angusticollis) oraz wizualizacja mikroorganizmów jelitowych

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Termity należą do niewielu znanych zwierząt zdolnych do przeżycia wyłącznie dzięki konsumpcji drewna. Przewód pokarmowy termitów zawiera gęstą i bogatą gatunkowo populację drobnoustrojów, która wspomaga degradację lignocelulozy głównie do octanu, który jest kluczowym składnikiem odżywczym napędzającym metabolizm termitów (Odelson & Breznak, 1983). W obrębie tych populacji drobnoustrojów znajdują się bakterie, archeony metanogenne, a u niektórych („niższych”) termitów również eukariotyczne pierwotniaki. W związku z tym termity stanowią doskonałe obiekty badawcze do analizy oddziaływań między gatunkami drobnoustrojów oraz licznych funkcji biochemicznych, które pełnią na korzyść swojego gospodarza. Skład gatunkowy populacji mikrobów w jelitach termitów, a także kluczowe geny zaangażowane w różne procesy biochemiczne, były badane z wykorzystaniem technik molekularnych (Kudo et al., 1998; Schmit-Wagner et al., 2003; Salmassi & Leadbetter, 2003). Techniki te opierają się na ekstrakcji i oczyszczaniu wysokiej jakości kwasów nukleinowych z środowiska przewodu pokarmowego termita. Technika ekstrakcji opisana w tym filmie jest zmodyfikowanym zestawieniem protokołów opracowanych dla ekstrakcji i oczyszczania kwasów nukleinowych z próbek środowiskowych (Mor et al., 1994; Berthelet et al., 1996; Purdy et al., 1996; Salmassi & Leadbetter, 2003; Ottesen et al. 2006) i pozwala na uzyskanie DNA z materiału jelita tylnego termitów, który nadaje się do użycia jako matryca w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).

Niniejszy film przedstawia technikę izolacji DNA z gatunków mikroorganizmów zasiedlających jelito tylne termitów. Zaprezentowano również przygotowanie preparatu świeżego, który jest przydatny do wizualizacji mikrobioty jelitowej, a także przeprowadzono przegląd bogatego gatunkowo środowiska jelita.

Izolacja DNA z mikroorganizmów jelitowych termita (Zootermopsis angusticollis) oraz wizualizacja mikroorganizmów jelitowych

Termity należą do nielicznych znanych zwierząt, które posiadają zdolność przetrwania wyłącznie dzięki spożywaniu drewna. Przewód pokarmowy termitów zawiera gęstą i ...

W tym przypadku reakcja na to środowisko nie jest wyjątkowa. Większość ludzi, nawet tych niezwiązanych z nauką, jest całkowicie zdumiona. Tak, różnorodnością i złożonością.Witam, nazywam się Eric Matson i jestem pracownikiem postdoktoralnym w Departamencie Inżynierii Środowiska i Nauki tutaj, w California Institute of Technology. Moja praca pod kierunkiem profesora Jareda Ledbettera koncentruje się na interakcjach mikrobiologicznych i różnorodności gatunków zasiedlających końcowy odcinek jelita termitów. W szczególności interesują nas niektóre z zachodzących tam szlaków biochemicznych, a zwłaszcza proces acetogenezy, w którym mikroby te konsumują wodór oraz CO2 i przekształcają je w octan, będący kluczowym składnikiem metabolizmu energetycznego organizmu gospodarza, jakim jest termit.Ja oraz inni członkowie laboratorium opracowaliśmy zestawy specyficznych starterów, aby móc ocenić kluczowe enzymy w tej ścieżce. Jednak aby to osiągnąć, musimy wygenerować czyste próbki DNA całej społeczności mikroorganizmów, które posłużą jako cele w tym procesie. Dlatego dzisiaj chcę zaprezentować, w jaki sposób przeprowadzamy sekcję omawianego gatunku termitów, ekstrahujemy DNA z jelita tylnego, a następnie je oczyszczamy do późniejszego wykorzystania w badaniach.Dzisiaj skupimy się na jednym konkretnym gatunku termita, zwanym Zootermopsis nevadensis. Jest to kalifornijski termit wilgotnego drewna, zebrany lokalnie, a ze względu na dość duże rozmiary tego gatunku, sekcje i ekstrakcje są stosunkowo łatwe do przeprowadzenia. Przygotowałem już niektóre z materiałów, które będą nam potrzebne do wykonania tej procedury.Jedną z pierwszych rzeczy, których potrzebujemy, jest odpowiednia ilość lodu, aby schłodzić owady przeznaczone do sekcji. Wcześniej schłodziłem również bufor TE, który zawiera związek pomagający stabilizować DNA po jego uwolnieniu z komórek. Przygotowałem sterylne probówki wypełnione kulkami z krzemianu cyrkonu.Są to kuleczki o średnicy 0,1 milimetra, znajduje się tutaj około pół grama. Będziemy przeprowadzać mechaniczne ścinanie. Mam również kilka odczynników niezbędnych do procedury lizy i oczyszczania.Mam tutaj butelkę zawierającą 1% polyvinyl PolyOne lub PVPP w buforze TE. PVPP jest istotny do usuwania kwasów huminowych z preparatów DNA, które mogą hamować naszą analizę wyników metodą PCR. Mam również siarczan sodu, który jest surfaktantem wykorzystywanym do wspomagania ekstrakcji oraz lizy komórek.Następnie, w celu przeprowadzenia sekcji termitów, potrzebujemy jedynie sterylnej pęsety. Posiada ona dość cienkie końcówki, których będziemy używać do usuwania przewodu pokarmowego. I na koniec, aby przeprowadzić rozrywanie mechaniczne, mamy tutaj homogenizator typu bead beater, który obraca się z bardzo wysoką prędkością obrotową i wraz z kuleczkami z krzemianu cyrkonu zapewni mechaniczną dezintegrację komórek.Po zebraniu termitów w terenie przenosimy je tutaj, do laboratorium. Większość kalifornijskich termitów wilgotnodrewnych, z którymi pracujemy, jest bardzo podatna na wysychanie. Dlatego jednym z usprawnień wprowadzonych w tym laboratorium było zastosowanie komór z kontrolowaną wilgotnością, takich jak te 10-galonowe akwaria.W tym miejscu zbieramy poszczególne kolonie i przechowujemy je oddzielnie w tych pudełkach. U podstawy komory znajdują się pojemniki z różnymi roztworami soli. Ten konkretny zawiera roztwór fosforanu potasu, który utrzymuje wilgotność względną na poziomie około 95 do 96%, co jest wartością optymalną.I mimo tych warunków, udało nam się wyhodować termity w niewoli, jednak kiedy chcemy przeprowadzić właściwy eksperyment, pobieramy świeże osobniki z terenu. W tym pudełku widać fragmenty drewna, którym się żywią. Jest to sosna ponderosa lub sosna Jeffrey’a, którą zbieramy w miejscu występowania gniazda termitów.Wyróżnia się szereg różnych kast termitów, w tym osobniki rozrodcze płci męskiej i żeńskiej. Większość kolonii stanowią termity robotnice, a także pewna liczba osobników z kasty żołnierzy. Co ciekawe, żołnierze posiadają aparat gębowy z żuwaczkami przystosowanymi do obrony kolonii, a nie do spożywania drewna.W związku z tym zależą one również od termitów robotnic w kwestii odżywiania. W tym pudełku można zatem dostrzec zarówno robotnice, jak i termity żołnierze, a także młode osobniki, które niedawno wykluły się z jaj w warunkach niewoli.Wybrałem pięć termitów robotnic z grupy, którą przed chwilą Państwu pokazałem. Rozpocząłem od schłodzenia ich tutaj na lodzie. W celu przygotowania do sekcji będę używać tych pęset i pracować przy użyciu stereomikroskopu; mam nadzieję, że będą Państwo w stanie dostrzec dużą objętość jelit, którą będziemy mogli usunąć z każdego z tych osobników.Po prostu połóż termita na grzbiecie i jedną pęsetą przytrzymaj koniec z głową, a drugą wykonaj ucisk. Zrób to dokładnie na samym końcu odwłoka. Jednym pociągnięciem powinieneś zobaczyć, jak przewód pokarmowy zostaje usunięty z organizmu. Dobrze.Można zauważyć, że objętość jest duża; w rzeczywistości około 30%–40% masy owada znajduje się w tym środowisku. Widać, że jest ono podzielone na kilka sekcji. Mamy przedjelitnicę, następnie jelito środkowe oraz tę część jelita tylnego, która jest bardzo dużą komorą zawierającą większość społeczności mikrobowej odpowiedzialnej za fermentację.W tym miejscu usunąłem wnętrzności z pięciu termitów robotnic. Kolejnym krokiem jest stabilizacja kwasów nukleinowych zawartych w tej próbce w roztworze lodowatego buforu TE. Na tym etapie, w przypadku pracy w terenie, próbki można zamrozić w temperaturze -20 °C.Możemy przejść bezpośrednio do procedury ekstrakcji. Wszystkie komórki i materiał DNA znajdują się wciąż wewnątrz jelita. Przeniosę je teraz do 100 µL buforu TE.Zanim przystąpię do właściwej ekstrakcji próbek jelit, muszę przygotować bufor, który posłuży do rozbicia komórek i tkanek. Do tej probówki, w której znajduje się już około 0,5 g kulek cyrkonowych, dodam 700 µL PVPP (stężenie 1% w buforze TE) oraz 50 µL 20% roztworu SDS.Ważne jest, aby resuspender PVPP przed jego dodaniem, ponieważ jest on nierozpuszczalny w buforach wodnych. W tym momencie jesteśmy gotowi do dodania fenolu do próbki, więc użyję pipety, aby dodać około 500 µL. Dobrze. Zatem jesteśmy gotowi, aby rozpocząć ekstrakcję. Tak.Po dodaniu fenolu możemy dodać próbkę jelita wypreparowaną wcześniej z termita, co pomoże nieco zmacerować tkanki. Ułatwia to zazwyczaj proces przenoszenia. Teraz, gdy fenol został dodany, jesteśmy gotowi do rozpoczęcia mechanicznej dysrupcji za pomocą homogenizatora kuleczkowego.Zastosowana technika polega na wykonaniu trzech cykli przy pełnej prędkości przez 30 sekund, po których następuje 30 sekund chłodzenia na lodzie. Ważne jest uwzględnienie etapu chłodzenia próbki na lodzie, ponieważ ma ona tendencję do nagrzewania się w wyniku tarcia. Włożę teraz próbkę do urządzenia do homogenizacji kuleczkowej i uruchomię cykl na 30 sekund. Dobrze.Po zakończeniu procedury większość tkanki powinna zostać zhomogenizowana. Powinno pozostać bardzo mało grudek, a zawiesina prawdopodobnie będzie miała spieniony wygląd ze względu na obecność SDS. W tym momencie możemy przystąpić do wirowania, a następnie do właściwej ekstrakcji i oczyszczania DNA z tej próbki.Po mechanicznym rozbiciu komórek odwirowamy materiał nierozpuszczalny. Zrobimy to, umieszczając próbkę w wirówce i stosując siłę 8 000 ×g przez jedną minutę. Oczekujemy teraz, że większość materiału rozpuszczalnego zbierze się w pobliżu dna probówki.Interesuje nas wodna warstwa roztworu na górze. To właśnie ją dodamy do zestawu do ekstrakcji DNA KaiGen, postępując zgodnie z procedurą dla surowego lizatu. Po odwirCowaniu próbek w wirówce, pobierzemy 200 µL nadnadवर्ल्डu z każdej preparacji, a następnie wyekstrahujemy DNA za pomocą zestawu A-D-N-E-Z KaiGen, stosując protokół przeznaczony dla surowego lizatu.Mamy teraz 200 µL próbki treści jelitowej i przystąpię do pracy z zestawem Kyogen D Easy, stosując protokół wskazany dla lizatu surowego. Przy każdej ekstrakcji z jelit zawsze warto sprawdzić stan zawartości jelit. Robimy to poprzez sekcję termita, aby upewnić się, że jest ona reprezentatywna dla wyników, które obserwowaliśmy w przeszłości.Zrobimy to wizualnie, obserwując komórki w tej społeczności drobnoustrojów. Tuż na samym końcu odwłoka. Z jednego z biegunów powinni Państwo zobaczyć przewód pokarmowy.Jest to po prostu buforowy roztwór soli, którego skład bardzo ściśle odpowiada składowi rzeczywistej treści jelitowej termita. Teraz lekko to rozetrę, a następnie naniosę na szkiełko mikroskopowe i przyjrzymy się temu. Dobrze, teraz jesteśmy gotowi do obserwacji pod mikroskopem.Tak, to wygląda naprawdę dobrze. Jelito termita. Występują tu przedstawiciele wszystkich trzech uznanych domen życia.Występują pierwotniaki eukariotyczne, organizmy archeonowe, a także bakterie. Nasze laboratorium zajmuje się przede wszystkim populacją bakterii w tym środowisku. Mianowicie SPI kes w tym konkretnym typie kopców termitów należą do najbardziej dominujących bakterii w tej społeczności.Nasze obecne badania wykazują, że w rzeczywistości w dużym stopniu uczestniczą one w redukcyjnej ketogenezie CO2. Są to różne rodzaje pierwotniaków, które uważa się za uczestników przede wszystkim pierwotnego rozkładu drewna. Przypuszcza się, że zawierają one ksylanazy i celulazy, które umożliwiają ich enzymom dostęp do tych polimerów drewna.Następnie fermentują one te związki do monomerów cukrów prostych oraz polimerów, które są dalej rozkładane przez inne członki społeczności. Pierwotniaki te produkują również octan, jednak jednym z ich produktów ubocznych jest wodór i CO2, a ten wodór i CO2 są ponownie wykorzystywane lub konsumowane przez populacje acetogenów w tym środowisku. Tutaj można dostrzec rój organizmów pierwotniaków, prawdopodobnie tuż obok bardzo dużego gatunku trypanosom.Jest to jeden z największych organizmów występujących w jelicie termita. Przechodząc niżej i przyglądając się obszarom, które nie zawierają tych dużych komórek pierwotniaków, można zauważyć, że tło, czyli ten rodzaj płynu śródmiąższowego, jest również wypełnione spirochetami i innymi komórkami bakteryjnymi. Zatem złożoność nie maleje nawet w tych przestrzeniach.Należy zaznaczyć, że typowa objętość wycinka jelita tylnego, takiego jak ten, który tutaj badaliśmy, wynosi od 2 do 5 µL, w zależności od wielkości termita. Zatem przygotowany przeze mnie preparat w kropli reprezentuje co najmniej rozcieńczenie tego środowiska w stosunku 1:20. W rzeczywistości gatunki te występują w znacznie większej gęstości w nienaruszonym jelicie, niż wynika to z prezentowanego tutaj obrazu.Daje to pewne wyobrażenie o gęstości, jak i różnorodności życia w tym środowisku. Przedstawiłem zatem dzisiaj sposób izolacji DNA z jelita termitów z tych oczyszczonych próbek. Teraz będziemy mogli zastosować specyficzne, ukierunkowane zestawy starterów.A konkretnie przyjrzymy się genom dehydrogenazy aldehydowej, dehydrogenazy tlenku węgla oraz syntazy tetrahydrolatfolianu formylowego, co stanowi trzy z zestawów starterów opracowanych w naszym laboratorium. Jesteśmy zainteresowani zbadaniem różnorodności i specyficznych cech sekwencji wielu z tych różnych genów w tym środowisku. Będzie to obejmować amplifikację PCR poszczególnych genów, ich klonowanie, sekwencjonowanie oraz tworzenie inwentarzy genów.Na podstawie uzyskanych wyników możemy wyciągnąć wnioski na temat natury niektórych z tych oddziaływań, a w szczególności tego, w jaki sposób szlaki te są konstruowane w różnych mikroorganizmach w ramach tego procesu.

extracting-dna-from-gut-microbes-termite-zootermopsis-angusticollis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wyodrębnianie DNA z mikroflory jelitowej termitów (Zootermopsis Angusticollis) i wizualizowanie mikroflory jelitowej

Jared Leadbetter wyjaśnia, dlaczego społeczność mikrobowa w jelitach termitów stanowi doskonały system do badania złożonych interakcji między mikroorganizmami. Omówiono symbiotyczną relację zachodzącą między owadem-gospodarzem a degradującymi lignocelulozę mikrobami jelitowymi, a także przemysłowe zastosowania tych mikroorganizmów w rozkładzie biomasy roślinnej i produkcji biopaliw.

Badanie społeczności mikrobowej w jelicie tylnym termitów – Wywiad

Jared Leadbetter zabiera nas na spacer po naturze, ukazując różnorodność życia zamieszkującego jelito tylne termita – mikrośrodowisko zawierające 250 różnych gatunków, których nie spotkamy nigdzie indziej na Ziemi. Jared wykazuje, że symbioza występująca w tym systemie jest wielowarstwowa i obejmuje nie tylko relację między termitem a mieszkańcami jego jelit, ale także złożoną sieć zależności symbiotycznych pomiędzy samymi mikrobami jelitowymi.

Warstwy symbiozy – wizualizacja społeczności mikrobiologicznej jelita tylnego termitów

Przedstawiamy procedury wykazujące za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, że ligandy wiążą się z błoną powierzchniową pierwotniaków trawiących celulozę w jelitach tajwańskich termitów podziemnych oraz że ligandy sprzężone z peptydami litycznymi zabijają te pierwotniaki in vitro (beztlenowa hodowla pierwotniaków) i in vivo (iniekcja do jelita tylnego termita).

Badanie aktywności protozoobójczej peptydów litycznych ligandów przeciwko pierwotniakiom jelita termitów in vitro (hodowla pierwotniaków) i in vivo (mikroiniekcja do jelita tylnego termitów)

Aktywna społeczność bakteryjna związana z jelitami Spodoptera littoralis, została określona przez sondowanie stabilnymi izotopami (SIP) sprzężone z pirosekwencjonowaniem. Korzystając z tej metodologii, identyfikacja metabolicznie aktywnych gatunków bakterii w społeczności została przeprowadzona z wysoką rozdzielczością i precyzją.

Identyfikacja metabolicznie aktywnych bakterii w jelicie ogólnego Spodoptera littoralis za pomocą sondowania stabilnych izotopów DNA przy użyciu 13C-glukozy

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania danych o sekwencji amplikonów mikrobiomów gleby, ryzosfery i korzeni. Informacje te mogą być wykorzystane do zbadania składu i różnorodności zbiorowisk mikrobiologicznych związanych z roślinami i nadają się do stosowania w odniesieniu do szerokiej gamy gatunków roślin.

Badanie mikrobiomu korzeni: ekstrakcja danych o społeczności bakteryjnej z gleby, ryzosfery i endosfery korzeni

Tutaj prezentujemy protokół do przestrzennej i czasowej oceny obecności żywotnej mikroflory w jelitach kleszczy przy użyciu zmodyfikowanego podejścia do hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja mikrobioty w jelitach kleszczy poprzez hybrydyzację in situ w całości

Ten uproszczony protokół szczegółowo opisuje proces wykrywania i obrazowania bakterii w złożonych próbkach tkanek, od utrwalania tkanki po barwienie mikrobów za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja interakcji mikrobiota jelitowa z gospodarzem poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ, barwienie lektyną i obrazowanie

Dzikie nicienie Caenorhabditis są związane z wieloma drobnoustrojami, często w świetle jelit lub infekującymi jelita. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę wzbogacania niekulturowych drobnoustrojów kolonizujących jelito, wykorzystując odporność naskórka dauer.

Selektywne czyszczenie dzikich nicieni Caenorhabditis w celu wzbogacenia o bakterie mikrobiomu jelitowego

Aby uzyskać aksenicznego owada, jego powierzchnia jaja jest sterylizowana, a wykluta larwa jest następnie hodowana za pomocą aksonicznych liści. Metoda ta zapewnia skuteczny sposób przygotowania owadów aksenowych bez podawania antybiotyków lub opracowywania sztucznej diety, którą można również zastosować do innych owadów żywiących się liśćmi.

Przygotowanie i hodowla owadów aksonowych z siewkami z hodowli tkankowej do badań interakcji mikrobioty gospodarz-jelito chrząszcza liściowego

Mikrokosmosy kompostu wprowadzają do laboratorium różnorodność mikrobiologiczną występującą w naturze, aby ułatwić badania mikrobiomu u Caenorhabditis elegans. Poniżej znajdują się protokoły do przeprowadzania eksperymentów mikrokosmicznych, przy czym eksperymenty wykazują zdolność do modulowania różnorodności mikrobiologicznej środowiska w celu zbadania związków między różnorodnością mikrobiologiczną środowiska a składem mikrobiomu jelitowego robaków.

Mikrokosmosy kompostu jako zróżnicowane mikrobiologicznie, naturalne środowiska do badań nad mikrobiomem u Caenorhabditis elegans

Proponujemy zoptymalizowany protokół skaningowej mikroskopii elektronowej do wizualizacji wysoce heterogenicznych i delikatnych próbek zawierających biomasę roślinną i grzybową, wraz z mikrobiotą i biofilmem. Protokół ten pozwala na opisanie wymiarów przestrzennych organizacji mikrobioty.

Mikrobiota ogrodów mrówek attine: wizualizacja krajobrazu mikrobiologicznego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Poznaj metodę ekstrakcji DNA z mikrobów jelitowych termitów Zootermopsis angusticollis i wizualizację drobnoustrojów. Technika ta umożliwia badanie różnorodności mikrobiomu jelita tylnego.

Izolacja DNA z mikroorganizmów jelitowych termita (Zootermopsis angusticollis) oraz wizualizacja mikroorganizmów jelitowych

Przeglądaj więcej filmów