Ekstrakcja DNA z mikrobów jelitowych termitów (Zootermopsis angusticollis) i wizualizacja drobnoustrojów jelitowych

Tutaj twoja reakcja na to środowisko nie jest, nie jest wyjątkowa. Większość ludzi, nawet niebędących naukowcami, jest dość zszokowana. tak. Przez różnorodność i złożoność.

Cześć, nazywam się Eric Matson i jestem doktorantem na Wydziale Inżynierii Środowiska i Nauki w Kalifornijskim Instytucie Technologicznym. Moja praca pod kierunkiem profesora Jareda Ledbettera koncentruje się na interakcjach mikrobiologicznych i różnorodności gatunków zamieszkujących tylne jelito termitów. W szczególności interesują nas niektóre szlaki biochemiczne, a zwłaszcza proces agenezji ace, w którym te mikroorganizmy zużywają wodór i gazy CO2 i przekształcają je w octan, który jest kluczowym składnikiem odżywczym metabolizmu energetycznego gospodarza termitów.

Ja i inni w laboratorium opracowaliśmy ukierunkowane zestawy starterów, aby móc wejść i ocenić kluczowe enzymy na tym szlaku. Ale aby to zrobić, wymaga od nas wygenerowania czystych próbek DNA społeczności społecznościowej, DNA, aby użyć ich jako celów dla tego procesu. Dzisiaj chciałem pokazać, jak rozkładamy na czynniki pierwsze gatunki termitów, o których mówimy, ekstrahujemy DNA z tylnego jelita, a następnie oczyszczamy je i wykorzystujemy później do badań.

Dzisiaj skupimy się na jednym gatunku termitów, w szczególności zwanym Zo Opsis Nevadensis. Jest to kalifornijski termit z wilgotnego drewna zbierany lokalnie i jest to dość duży gatunek, co sprawia, że dość łatwo jest przeprowadzić sekcje i ekstrakcje. Okej, więc dzisiaj przygotowałam już część materiałów, które będą nam potrzebne do zabiegu.

Jedną z pierwszych rzeczy, których potrzebujemy, jest pewna ilość lodu, aby schłodzić owady, które będą poddawane sekcji. Wstępnie schłodziłem również trochę buforu TE, który zawiera związek, który pomoże ustabilizować DNA, gdy zostanie uwolnione z komórek tutaj. Mam sterylne fiolki z fabrycznie załadowanymi kulkami cyrkonowo-krzemianowymi.

Są to koraliki o średnicy 0,1 milimetra, a tutaj jest około pół grama. To jest to, co będziemy robić, mechaniczne ścinanie. A potem mam kilka odczynników biorących udział w procedurze lizy i oczyszczania.

Tutaj mam butelkę zawierającą 1% poliwinylu PolyOne lub PVPP w buforze. PVPP jest ważny dla usuwania kwasów humusowych z preparatów DNA, które mogą hamować naszą analizę wyników metodą PCR. A potem mam trochę siarczanu sodu ECCO, który jest środkiem powierzchniowo czynnym, którego użyjemy do ekstrakcji i rozerwania komórek.

A potem do przeprowadzenia sekcji termitów wszystko, czego potrzebujemy, to sterylne kleszcze. Są one dość dobrze zakończone i to właśnie tego będziemy używać do usuwania śladów jelit. I w końcu, aby wykonać mechaniczne ścinanie, mamy tutaj urządzenie do bicia pszczół, które obraca się z bardzo wysokimi obrotami i wraz z kulkami krzemianu cyrkonu spowoduje mechaniczne rozerwanie komórek.

Więc po zebraniu termitów na polu, przynosimy je z powrotem do laboratorium. Większość kalifornijskich termitów z wilgotnego drewna, z którymi pracujemy, jest bardzo podatna na wysuszenie. Jednym z postępów, które poczyniliśmy w tym laboratorium, jest zastosowanie komór o kontrolowanej wilgotności, takich jak te akwaria o pojemności 10 galonów.

Wewnątrz zbieramy poszczególne kolonie i trzymamy je oddzielnie w tych, w tych pudełkach. A u podstawy zbiornika znajdują się w zasadzie pojemniki z różnymi roztworami soli. Ten konkretny zawiera roztwór fosforanu potasu, który utrzymuje wilgotność względną na poziomie około 95 do 96%, co jest idealne.

W tych warunkach termity rozmnażały się w niewoli, ale kiedy chcieliśmy przeprowadzić eksperyment, zbieraliśmy je prosto z pola. Ale w tym pudełku możesz zobaczyć trochę drewna, którym się żywią. To jest po prostu Ponderosa lub Jeffrey Pine, które zbieramy w miejscu gniazda termitów.

Istnieje wiele różnych odlewów termitów, w tym męskich i żeńskich rozrodczych. Większość kolonii składa się z termitów robotnic, a także z liczby odlewów żołnierzy. Co ciekawe, żołnierze mają aparaty gębowe, żuchwy, które są przeznaczone do obrony kolonii, a nie do jedzenia drewna.

I tak są zależne od termitów robotnic, które również je karmią. I tak w tym pudełku można zobaczyć zarówno robotnice, jak i termity-żołnierzy, a także niektóre młode, które niedawno wykluły się z jaj. Cóż, w niewoli tutaj.

Wybrałem więc pięć termitów robotnic z grupy, którą właśnie wam pokazałem. Zacząłem od schłodzenia ich na lodzie. Aby przygotować się do sekcji, zamierzam użyć tych kleszczy i pracować z pomocą lunety sekcyjnej, i mam nadzieję, że będziecie w stanie zobaczyć dużą objętość jelita, z której będziemy w stanie usunąć od każdej z tych osób.

Po prostu przewróć termita na plecy i jednym kleszczem przytrzymujesz koniec głowy, a drugim wszystko, co robisz, to szczypanie. Tu na samym czubku brzucha. A za pomocą jednego bieguna powinieneś zobaczyć, jak przewód pokarmowy jest usuwany z organizmu. Porządku.

I możecie zobaczyć, że duża objętość, około 30%40% masy owada, jest faktycznie zawarta w tym środowisku. I widać, że jest podzielony na kilka sekcji. Mamy cztery jelita, potem i jelito środkowe, a potem ten cios w jelito tylne, który jest bardzo dużą komorą, która zawiera większość, większość społeczności mikrobiologicznej, która przeprowadza fermentację.

Usunąłem więc wnętrzności pięciu termitów robotnic. Następnym krokiem jest ustabilizowanie kwasów nukleinowych zawartych w społeczności w roztworze lodowatego buforu. W tym momencie można je zamrozić w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, jeśli pracujesz w polu.

Lub możemy kontynuować od razu procedurę ekstrakcji. Ale wszystkie komórki i materiał DNA są nadal zawarte w jelitach. A ja po prostu włożę je do 100 mikrolitrów bufora.

Okej, zanim zacznę ekstrakcję próbek jelit, muszę przygotować bufor, którego będę używał do rozbijania komórek i tkanek. Więc do tej tuby, że mam już około pół grama koralików cyrkonu, zamierzam dodać PVPP 700 mikrolitrów tego. Jest to 1% bufor i 50 mikrolitrów 20% roztworu SDS.

Ważne jest, aby ponownie zawiesić PVPP przed jego dodaniem, ponieważ jest on nierozpuszczalny w wodnych. W tym momencie jesteśmy gotowi dodać fenol do próbki, więc użyję pipety, aby dodać około 500 mikrolitrów. Porządku. I z tym jesteśmy gotowi do rozpoczęcia ekstrakcji. tak.

Po dodaniu fenolu jesteśmy gotowi dodać próbkę jelit, którą wcześniej wypreparowaliśmy z termitów, więc pomaga to trochę zmacerować tkanki. Ma to tendencję do tego, że transfer jest nieco łatwiejszy. A teraz, po dodaniu fenolu, jesteśmy gotowi do rozpoczęcia mechanicznego zakłócenia za pomocą urządzenia do perełkowania koralików.

Technika, której zamierzamy użyć, to trzy cykle z pełną prędkością, 30 sekund, a następnie 30 sekund na lodzie. Ważne jest, aby włączyć stopień na lodzie, aby schłodzić próbkę, ponieważ ma ona tendencję do nagrzewania się z powodu tarcia. Więc po prostu włożę próbkę do urządzenia do koralików tutaj, i pójdę na 30 sekund. Porządku.

Pod koniec zabiegu powinieneś zobaczyć, że większość tkanki została zhomogenizowana. Powinno zostać bardzo mało grudek, a zobaczysz, że ma to trochę mydlany wygląd, prawdopodobnie z powodu SDS tam. W tym momencie jesteśmy gotowi do odwirowania, a następnie rozpoczęcia właściwego oczyszczania ekstrakcyjnego samego DNA z tej próbki.

Teraz, gdy mechanicznie rozbiliśmy komórki, zamierzamy odwirować nierozpuszczalny materiał. Zrobimy to, wkładając wirówkę i używając 8 000 razy grawitacji przez jedną minutę. A teraz spodziewamy się zobaczyć większość rozpuszczalnego materiału zebranego w pobliżu dna probówki.

A to, co nas interesuje, to roztwór wodny na górze. I to jest to, co faktycznie dodamy do zestawu do ekstrakcji DNA KaiGen zgodnie z procedurą dla surowego lizatu. Teraz, gdy mamy już naszą wirówkę do próbek, zamierzamy pobrać 200 mikrolitrów na przygotowanie supernatantu i zamierzamy wyekstrahować DNA za pomocą zestawu A-D-N-E-Z KaiGen, używając protokołu wskazanego dla surowego lizatu.

Teraz mamy 200 mikrolitrów próbki jelit i zamierzam kontynuować korzystanie z zestawu kyogen d easy, korzystając z protokołu wskazanego dla surowego lizatu. Za każdym razem, gdy przeprowadzamy ekstrakcję jelit, zawsze dobrze jest sprawdzić stan zawartości jelita. Robimy to, przeprowadzając sekcję termita i upewniając się, że jest on reprezentatywny dla rzeczy, które widzieliśmy w przeszłości.

Zrobimy to wizualnie, przyglądając się komórkom w tej społeczności mikrobiologicznej. Tu na samym czubku brzucha. A za pomocą jednego kija powinieneś zobaczyć przewód pokarmowy.

Więc to jest po prostu buforowany roztwór soli, który bardzo ściśle pasuje do składu rzeczywistego płynu jelitowego termita. Zamierzam to trochę zmacerować, a potem dodać do szkiełka mikroskopowego i przyjrzymy się. Okej, teraz jesteśmy gotowi, aby przyjrzeć się temu pod mikroskopem.

Tak, to wygląda naprawdę dobrze. Jelito termitów. Są to przedstawiciele wszystkich trzech uznanych dziedzin życia.

Są pierwotniaki eukariotyczne, są organizmy metamfetaminy, są też bakterie. A nasze laboratorium zajmuje się głównie populacją bakterii w tym środowisku. Mianowicie, SPI kes w tym konkretnym typie iglic termitów są jednymi z najbardziej dominujących bakteryjnych członków społeczności.

A nasze obecne badania pokazują, że w rzeczywistości angażują się one w dużym stopniu w redukcję CO2 i ketogenezę. To są po prostu różne rodzaje pierwotniaków i uważa się, że biorą one udział w pierwotnym rozpadzie drewna. Uważa się więc, że zawierają one xin AE i celulazę, które umożliwiają ich enzymom dostęp do tych polimerów drewna.

A potem oni fermentują je na monomery cukru i polimery, które są dalej rozkładane przez innych członków społeczności. Te pierwotniaki również same wytwarzają octan, ale jednym z ich produktów ubocznych jest wodór i CO2, a ten wodór i CO2 są tym, co jest używane lub konsumowane przez populacje aceto w tym środowisku. A tutaj można po prostu zobaczyć rój, pierwotniaków prawdopodobnie tuż obok bardzo dużego gatunku, trick i infa tam.

Jest to jeden z największych organizmów w jelitach termitów. Kiedy zejdziesz w dół i spojrzysz na obszary, które nie zawierają tych dużych komórek pierwotniaków, zobaczysz, że tłem jest ten rodzaj płynu śródmiąższowego, który jest również obciążony spi, keets i innymi komórkami bakteryjnymi. A więc, wiecie, złożoność nie staje się ani trochę mniejsza w tych przestrzeniach.

Jedną z rzeczy, na które powinienem zwrócić uwagę, jest to, że typowa objętość ciosu w tylne jelito, takiego jak ten, któremu się tutaj przyjrzeliśmy, wynosi od dwóch do pięciu mikrolitrów, w zależności od wielkości termitu. Tak więc przygotowanie do montażu na mokro, które tutaj zrobiłem, naprawdę reprezentuje co najmniej 1 do 20 rozcieńczeń tego środowiska. I tak to jest w rzeczywistości, że te gatunki są o wiele, wiele gęściej upakowane w nienaruszonym jelicie niż to, co jest tutaj przedstawione.

To daje wam pewne wyobrażenie o gęstości i różnorodności życia w tym, w tym środowisku. Dzisiaj pokazałem wam, jak izolujemy DNA z jelit termitów za pomocą tych oczyszczonych próbek. Teraz będziemy mogli zastosować konkretne, ukierunkowane zestawy podkładów.

Mianowicie, będziemy przyglądać się genom tworzącym dehydrogenazę, dehydrogenazę tlenku węgla i formalną syntezę tetrahydrofolianów, które są trzema zestawami starterów opracowanymi przez nasze laboratorium. Jesteśmy zainteresowani badaniem różnorodności i specyficznych cech sekwencji wielu z tych różnych genów dla tego środowiska. Będzie to wymagało PCR amplifikacji różnych genów, klonowania ich, sekwencjonowania i budowania inwentarza genów.

Opierając się na wynikach, możemy dowiedzieć się czegoś o naturze niektórych z tych interakcji, a w szczególności, w jaki sposób te szlaki są konstruowane w tych różnych mikroorganizmach w tym procesie.