Name: Ekstrakcja DNA z mikrobów jelitowych termitów (Zootermopsis angusticollis) i wizualizacja drobnoustrojów jelitowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji DNA z mikrobów jelitowych termitów Zootermopsis angusticollis i wizualizację drobnoustrojów. Technika ta umożliwia badanie różnorodności mikrobiomu jelita tylnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Podsumowanie procedury ekstrakcji DNA z całego przewodu pokarmowego termitów:
<ol>
<li>Schłodzić termity na lodzie, usunąć jelita za pomocą sterylnych pęset i ustabilizować próbki jelit w buforze.</li>
<li>Zhomogenizować próbki w buforze PVPP/SDS/fenol.</li>
<li>Wyekstrahować i oczyścić DNA z surowego lizatu przy użyciu kolumienek Qiagen DNeasy.</li>
</ol>
Protokół:
<ol>
<li>W warunkach chłodzenia na lodzie, za pomocą sterylnej pęsety usunąć przewody pokarmowe z osobników kasty robotnic termitów.</li>
<li>Natychmiast przenieść przewody pokarmowe wraz z ich zawartością do sterylnej, wolnej od nukleaz probówki zawierającej 50 μL lodowatego, 1x buforu TE klasy biologii molekularnej (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0).&nbsp; Zamrozić próbki w temperaturze -20°C lub przejść bezpośrednio do homogenizacji.&nbsp; </li>
<li>Przenieść próbki przewodów pokarmowych i bufor do sterylnej, wolnej od nukleaz probówki o objętości 2 ml z nakrętką, uprzednio wypełnionej 500 mg sterylnych kulek cyrkoniowo-krzemowych (0,1 mm) oraz 700 μl 1x buforu TE zawierającego 1% w/v poliwiniylopolipirolidonu (PVPP).&nbsp; </li>
<li>Do próbek dodać 50 μl 20% dodecylosiarczanu sodu (SDS) oraz 500 μl fenolu.</li>
<li>Homogenizować (bead-beating) na najwyższym ustawieniu, stosując trzy cykle: 30 s homogenizacji i 30 s chłodzenia na lodzie.</li>
<li>Odwirować nierozpuszczalny materiał przez 1 min przy 8 000x g.</li>
<li>Oczyścić 300-μl aliquoty warstwy wodnej (górnej) za pomocą kolumn Qiagen DNeasy, stosując metodę opisaną dla oczyszczania surowego lizatu.</li>
<li>Oznaczyć ilość kwasów nukleinowych i zamrozić próbki w temperaturze -20°C do późniejszego wykorzystania.</li>
</ol>

<ol><li>Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Direct+Extraction+of+DNA+from+Soils+for+PCR+Analysis+using+Polyvinylpolypyrrolidone+Spin+Columns%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns.</a> FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).</li>
<li>Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Phylogenetic+Identification+of+the+Intestinal+Anaerobic+Microbial+Community+in+the+Hindgut+of+the+Termite%2C+Reticulitermes+Speratus%2C+without+Cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation.</a> Extremophiles. 2, 155-161 (1998).</li>
<li>Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Cell+Lysis+of+Indigenous+Microorganisms+and+Rapid+Extraction+of+Microbial+DNA+from+Sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).</li>
<li>Odelson, D. A., Breznak, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+Fatty+Acid+Production+by+the+Hindgut+Microbiota+of+Xylophagous+Termites%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).</li>
<li>Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Digital+PCR+Enables+Multigene+Analysis+of+individual+Environmental+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria.</a> Science. 314, 1464-1467 (2006).</li>
<li>Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Extraction+of+DNA+and+rRNA+from+Sediments+by+a+Novel+Hydroxyapatite+Spin-Column+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).</li>
<li>Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Genes+of+Tetrahydrofolate-Dependent+Metabolism+from+Cultivated+Spirochaetes+and+the+Gut+Community+of+the+Termite+Zootermopsis+Angusticollis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis.</a> Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).</li>
<li>Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+Diversity%2C+Abundance%2C+and+Axial+Distribution+of+Bacteria+in+the+Intestinal+Tract+of+Two+Soil-Feeding+Termites+%28Cubitermes+spp%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp).</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).</li>
<li>Tsai, Y. L., Olson, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Method+for+Separation+of+Bacterial+DNA+from+Humic+Substances+in+Sediments+for+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction.</a> Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).</li>
</ol>

W naszym doświadczeniu DNA wyizolowane z mikrobiomu gatunków termitów żywiących się drewnem, takich jak Zootermopis nevadensis, jest wystarczająco czyste, by służyć jako matryca do PCR po jednej rundzie ekstrakcji i oczyszczania. Jednakże niektóre termity, np. gatunki żywiące się ściółką lub glebą, mogą mieć w treści jelit wyższe stężenie kwasów huminowych, co może wymagać dodatkowego oczyszczania DNA mikroorganizmów jelitowych. Całkowita wydajność DNA z jelit 5 robotnic Z. nevadensis mieści się w przedziale 10-30 μg. W ...

<table><tbody><tr><td>PVPP/SDS/fenol</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td>bufor do homogenizacji</td></tr><tr><td>DNeasy Tissue Kit</td><td>Zestaw</td><td>Qiagen</td><td>77607</td><td>Stosowany zgodnie z protokołem izolacji genomicznego DNA z surowych lizatów (Dodatek H, instrukcja produktu wersja: lipiec 2003)</td></tr><tr><td>TE</td><td>Bufor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>bufor 1x (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) przygotowany z koncentratu 100x</td></tr><tr><td>kulkowe nośniki z cyrkonii/krzemionki</td><td>Materiały</td><td>Biospec Products</td><td>11079101z</td><td>0.1 mm</td></tr><tr><td>PVPP</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6755</td><td>1% w/v poliwiniylopolipirolidonu przygotowanego z odczynnika suchego jako zawiesina 1x w buforze TE</td></tr><tr><td>Zootermopsis nevadensis</td><td>Zwierzę</td><td></td><td></td><td>Termity</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td>20% roztwór dodecylosiarczanu sodu w wodzie przygotowany z odczynnika suchego</td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77607</td><td>nasycony buforem TE, ~73%</td></tr><tr><td>MiniBeadbeater-8</td><td>Narzędzie</td><td>Biospec Products</td><td>963</td><td></td></tr><tr><td>BSS</td><td>Buforowana roztwór soli, pH 7.2</td><td></td><td></td><td>Skład na litr: 2.5 g K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.0 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl oraz 10 mL roztworu 1 M NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>AxioPlan-2</td><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Wyposażony w obiektyw 40x, optivar 1.6x i soczewki okularowe 10x. Próbki oglądano przy użyciu oświetlenia w kontraście fazowym</td></tr></tbody></table>

izolacja dna z mikroorganizmów jelitowych termita (zootermopsis angusticollis) oraz wizualizacja mikroorganizmów jelitowych

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Termity należą do niewielu znanych zwierząt zdolnych do przeżycia wyłącznie dzięki konsumpcji drewna. Przewód pokarmowy termitów zawiera gęstą i bogatą gatunkowo populację drobnoustrojów, która wspomaga degradację lignocelulozy głównie do octanu, który jest kluczowym składnikiem odżywczym napędzającym metabolizm termitów (Odelson & Breznak, 1983). W obrębie tych populacji drobnoustrojów znajdują się bakterie, archeony metanogenne, a u niektórych („niższych”) termitów również eukariotyczne pierwotniaki. W związku z tym termity stanowią doskonałe obiekty badawcze do analizy oddziaływań między gatunkami drobnoustrojów oraz licznych funkcji biochemicznych, które pełnią na korzyść swojego gospodarza. Skład gatunkowy populacji mikrobów w jelitach termitów, a także kluczowe geny zaangażowane w różne procesy biochemiczne, były badane z wykorzystaniem technik molekularnych (Kudo et al., 1998; Schmit-Wagner et al., 2003; Salmassi & Leadbetter, 2003). Techniki te opierają się na ekstrakcji i oczyszczaniu wysokiej jakości kwasów nukleinowych z środowiska przewodu pokarmowego termita. Technika ekstrakcji opisana w tym filmie jest zmodyfikowanym zestawieniem protokołów opracowanych dla ekstrakcji i oczyszczania kwasów nukleinowych z próbek środowiskowych (Mor et al., 1994; Berthelet et al., 1996; Purdy et al., 1996; Salmassi & Leadbetter, 2003; Ottesen et al. 2006) i pozwala na uzyskanie DNA z materiału jelita tylnego termitów, który nadaje się do użycia jako matryca w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).

Niniejszy film przedstawia technikę izolacji DNA z gatunków mikroorganizmów zasiedlających jelito tylne termitów. Zaprezentowano również przygotowanie preparatu świeżego, który jest przydatny do wizualizacji mikrobioty jelitowej, a także przeprowadzono przegląd bogatego gatunkowo środowiska jelita.

Izolacja DNA z mikroorganizmów jelitowych termita (Zootermopsis angusticollis) oraz wizualizacja mikroorganizmów jelitowych

Termity należą do nielicznych znanych zwierząt, które posiadają zdolność przetrwania wyłącznie dzięki spożywaniu drewna. Przewód pokarmowy termitów zawiera gęstą i ...

W tym przypadku reakcja na to środowisko nie jest wyjątkowa. Większość ludzi, nawet tych niezwiązanych z nauką, jest całkowicie zdumiona. Tak, różnorodnością i złożonością.Witam, nazywam się Eric Matson i jestem pracownikiem postdoktoralnym w Departamencie Inżynierii Środowiska i Nauki tutaj, w California Institute of Technology. Moja praca pod kierunkiem profesora Jareda Ledbettera koncentruje się na interakcjach mikrobiologicznych i różnorodności gatunków zasiedlających końcowy odcinek jelita termitów. W szczególności interesują nas niektóre z zachodzących tam szlaków biochemicznych, a zwłaszcza proces acetogenezy, w którym mikroby te konsumują wodór oraz CO2 i przekształcają je w octan, będący kluczowym składnikiem metabolizmu energetycznego organizmu gospodarza, jakim jest termit.Ja oraz inni członkowie laboratorium opracowaliśmy zestawy specyficznych starterów, aby móc ocenić kluczowe enzymy w tej ścieżce. Jednak aby to osiągnąć, musimy wygenerować czyste próbki DNA całej społeczności mikroorganizmów, które posłużą jako cele w tym procesie. Dlatego dzisiaj chcę zaprezentować, w jaki sposób przeprowadzamy sekcję omawianego gatunku termitów, ekstrahujemy DNA z jelita tylnego, a

extracting-dna-from-gut-microbes-termite-zootermopsis-angusticollis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wyodrębnianie DNA z mikroflory jelitowej termitów (Zootermopsis Angusticollis) i wizualizowanie mikroflory jelitowej

Jared Leadbetter wyjaśnia, dlaczego społeczność mikrobowa w jelitach termitów stanowi doskonały system do badania złożonych interakcji między mikroorganizmami. Omówiono symbiotyczną relację zachodzącą między owadem-gospodarzem a degradującymi lignocelulozę mikrobami jelitowymi, a także przemysłowe zastosowania tych mikroorganizmów w rozkładzie biomasy roślinnej i produkcji biopaliw.

Badanie społeczności mikrobowej w jelicie tylnym termitów – Wywiad

Jared Leadbetter zabiera nas na spacer po naturze, ukazując różnorodność życia zamieszkującego jelito tylne termita – mikrośrodowisko zawierające 250 różnych gatunków, których nie spotkamy nigdzie indziej na Ziemi. Jared wykazuje, że symbioza występująca w tym systemie jest wielowarstwowa i obejmuje nie tylko relację między termitem a mieszkańcami jego jelit, ale także złożoną sieć zależności symbiotycznych pomiędzy samymi mikrobami jelitowymi.

Warstwy symbiozy – wizualizacja społeczności mikrobiologicznej jelita tylnego termitów

Przedstawiamy procedury wykazujące za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, że ligandy wiążą się z błoną powierzchniową pierwotniaków trawiących celulozę w jelitach tajwańskich termitów podziemnych oraz że ligandy sprzężone z peptydami litycznymi zabijają te pierwotniaki in vitro (beztlenowa hodowla pierwotniaków) i in vivo (iniekcja do jelita tylnego termita).

Badanie aktywności protozoobójczej peptydów litycznych ligandów przeciwko pierwotniakiom jelita termitów in vitro (hodowla pierwotniaków) i in vivo (mikroiniekcja do jelita tylnego termitów)

Aktywna społeczność bakteryjna związana z jelitami Spodoptera littoralis, została określona przez sondowanie stabilnymi izotopami (SIP) sprzężone z pirosekwencjonowaniem. Korzystając z tej metodologii, identyfikacja metabolicznie aktywnych gatunków bakterii w społeczności została przeprowadzona z wysoką rozdzielczością i precyzją.

Identyfikacja metabolicznie aktywnych bakterii w jelicie ogólnego Spodoptera littoralis za pomocą sondowania stabilnych izotopów DNA przy użyciu 13C-glukozy

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania danych o sekwencji amplikonów mikrobiomów gleby, ryzosfery i korzeni. Informacje te mogą być wykorzystane do zbadania składu i różnorodności zbiorowisk mikrobiologicznych związanych z roślinami i nadają się do stosowania w odniesieniu do szerokiej gamy gatunków roślin.

Badanie mikrobiomu korzeni: ekstrakcja danych o społeczności bakteryjnej z gleby, ryzosfery i endosfery korzeni

Tutaj prezentujemy protokół do przestrzennej i czasowej oceny obecności żywotnej mikroflory w jelitach kleszczy przy użyciu zmodyfikowanego podejścia do hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja mikrobioty w jelitach kleszczy poprzez hybrydyzację in situ w całości

Ten uproszczony protokół szczegółowo opisuje proces wykrywania i obrazowania bakterii w złożonych próbkach tkanek, od utrwalania tkanki po barwienie mikrobów za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja interakcji mikrobiota jelitowa z gospodarzem poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ, barwienie lektyną i obrazowanie

Dzikie nicienie Caenorhabditis są związane z wieloma drobnoustrojami, często w świetle jelit lub infekującymi jelita. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę wzbogacania niekulturowych drobnoustrojów kolonizujących jelito, wykorzystując odporność naskórka dauer.

Selektywne czyszczenie dzikich nicieni Caenorhabditis w celu wzbogacenia o bakterie mikrobiomu jelitowego

Aby uzyskać aksenicznego owada, jego powierzchnia jaja jest sterylizowana, a wykluta larwa jest następnie hodowana za pomocą aksonicznych liści. Metoda ta zapewnia skuteczny sposób przygotowania owadów aksenowych bez podawania antybiotyków lub opracowywania sztucznej diety, którą można również zastosować do innych owadów żywiących się liśćmi.

Przygotowanie i hodowla owadów aksonowych z siewkami z hodowli tkankowej do badań interakcji mikrobioty gospodarz-jelito chrząszcza liściowego

Mikrokosmosy kompostu wprowadzają do laboratorium różnorodność mikrobiologiczną występującą w naturze, aby ułatwić badania mikrobiomu u Caenorhabditis elegans. Poniżej znajdują się protokoły do przeprowadzania eksperymentów mikrokosmicznych, przy czym eksperymenty wykazują zdolność do modulowania różnorodności mikrobiologicznej środowiska w celu zbadania związków między różnorodnością mikrobiologiczną środowiska a składem mikrobiomu jelitowego robaków.

Mikrokosmosy kompostu jako zróżnicowane mikrobiologicznie, naturalne środowiska do badań nad mikrobiomem u Caenorhabditis elegans

Proponujemy zoptymalizowany protokół skaningowej mikroskopii elektronowej do wizualizacji wysoce heterogenicznych i delikatnych próbek zawierających biomasę roślinną i grzybową, wraz z mikrobiotą i biofilmem. Protokół ten pozwala na opisanie wymiarów przestrzennych organizacji mikrobioty.

Mikrobiota ogrodów mrówek attine: wizualizacja krajobrazu mikrobiologicznego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Poznaj metodę ekstrakcji DNA z mikrobów jelitowych termitów Zootermopsis angusticollis i wizualizację drobnoustrojów. Technika ta umożliwia badanie różnorodności mikrobiomu jelita tylnego.

Izolacja DNA z mikroorganizmów jelitowych termita (Zootermopsis angusticollis) oraz wizualizacja mikroorganizmów jelitowych

Przeglądaj więcej filmów