Badanie społeczności mikrobowej w jelicie tylnym termitów – Wywiad

Termity i mikroby w ich przewodzie pokarmowym stanowią przykład niezwykle fascynującej i złożonej symbiozy mutualistycznej. Interesuję się badaniem termitów oraz tych mikrobów, aby lepiej zrozumieć wszystkie różnorodne role, jakie odgrywają poszczególne komponenty podczas rozkładu bardzo złożonego źródła pokarmu, jakim jest lignoceluloza, na produkty, które mogą być wykorzystane zarówno przez owada, jak i mikroby. Jestem Jared Ledbetter.

Jestem profesorem pomocniczym mikrobiologii środowiskowej w Kalifornijskim Instytucie Technologicznym i uczestniczę w programie nauk o środowisku i inżynierii środowiskowej. Pracuję w Caltech od sześciu i pół roku, jednak od ostatnich 17 lat moje główne zainteresowania badawcze koncentrują się na badaniu społeczności drobnoustrojów zamieszkujących jelita tylne różnych gatunków termitów. Od czasu pierwszego zetknięcia się z mikrobiologią jelit termitów podczas letniego kursu różnorodności mikrobiologicznej w Woods Hole w Massachusetts, bardzo interesuje mnie tożsamość i funkcja poszczególnych gatunków mikroorganizmów żyjących w jelitach tylnych termitów.

Społeczności drobnoustrojów w jelicie tylnym termitów składają się z około 250 unikalnych gatunków mikroorganizmów, reprezentujących wszystkie trzy domeny życia. Można w nich zidentyfikować metagenomiczne Archaea, beztlenowe pierwotniaki rozkładające celulozę, czyli eukarioty jednokomórkowe, oraz szeroką różnorodność bakterii, w tym bardzo wiele nowych gatunków z grupy bakterii zwanych spirochetami. Choć w termitach żyje około 250 różnych gatunków, których nie spotyka się nigdzie indziej w naturze, to nawet po około stu latach badań nasza wiedza na temat funkcji wszystkich tych różnych mikrobów w tej fascynującej symbiozie mutualistycznej między owadem-gospodarzem a społecznością drobnoustrojów jest wciąż bardzo ograniczona. Wspólnie rozkładają one celulozę do produktów, które w zasadzie napędzają metabolizm zarówno owada-gospodarza, jak i tych różnych mikroorganizmów.

W ciągu ostatnich 16-17 lat bardzo interesowało mnie ustalenie, jakie to gatunki i czym się zajmują. W jaki sposób gatunki te oddziałują na siebie w jelicie tylnym i jakie korzyści przynoszą gospodarzowi? Termity oraz mikroby w ich przewodzie pokarmowym stanowią przykład niezwykle fascynującej i złożonej symbiozy mutualistycznej.

Interesuję się badaniem termitów oraz ich mikrobów, aby lepiej zrozumieć wszystkie zróżnicowane role, jakie pełnią poszczególne komponenty podczas rozkładu bardzo złożonego źródła pożywienia, jakim jest lignoceluloza, na produkty, które mogą być wykorzystane zarówno przez owada, jak i mikroby. Innym powodem badania termitów i mikrobów w ich przewodzie pokarmowym jest fakt, że termity stanowią w skali globalnej bardzo ważną grupę zwierząt, które odgrywają krytyczne i istotne role w globalnych cyklach węgla i azotu; w tropikach i subtropikach termity są niezwykle zróżnicowane. Oznacza to, że istnieje wiele różnych gatunków termitów i są one bardzo liczne.

Przykładem tego, jak skuteczne są te owady, jest fakt, że stanowią one niewielkie, lecz znaczące źródła globalnej emisji CO2 oraz metanu. Dzięki ilości drewna, którą przekształcają w te produkty, termity odpowiadają za około 2% globalnej emisji CO2 i około 4% globalnej emisji metanu, co jest w rzeczywistości bardzo istotne jak na jedną grupę zwierząt. Zatem badając mikroby oraz ich aktywność w tych owadach, lepiej rozumiemy te organizmy oraz podstawy ich globalnego sukcesu.

Badanie termitów oraz mikrobów w ich jelitach jest również interesujące z punktu widzenia skali i powtarzalności. Na pewnym poziomie badam termity i ich mikrobiotę jelitową, ponieważ jest to niezwykle fascynujące i złożone środowisko. Jednak środowisko jelita tylnego, ten ekosystem jelita tylnego, znacząco różni się od wielu innych środowisk.

Jestrznica termitów jest bardzo mała, ma objętość około jednej mikrolitr i jest bardzo dobrze ograniczona w tym sensie, że wyścielona jest nabłonkiem jelitowym lub samym owadem. Możemy jednak bardzo konkretnie zdefiniować granice tego środowiska. Środowisko to jest bardzo niewielkie i możemy zebrać pudełko termitów, mając ich 200, dzięki czemu średnio otrzymujemy to samo środowisko powielone wielokrotnie.

Jeśli porównamy środowisko jelita termitów na przykład do Morza Sargassowego, to Morze Sargassowe jest ogromne i potężne. Ma ono tysiąc mil szerokości. Jego granice są określone, lecz prawdopodobnie jedynie operacyjnie.

Granica Morza Sargassowego nie jest wyraźnie wyznaczona, a obszar ten jest jedyny w swoim rodzaju. Dzięki badaniom Morza Sargassowego możemy dowiedzieć się wielu rzeczy na temat nauk morskich, dlatego jego analiza jest bardzo ważna. Istnieją jednak pewne komplikacje, ponieważ aby tam dotrzeć, trzeba wynająć łódź i udać się w rejs.

Jeśli odkryją Państwo coś na temat niektórych tamtejszych mikroorganizmów, mogą Państwo nie wiedzieć, gdzie one znajdują się w danym momencie; mogą być one oddalone od siebie o wiele mil, a oczywiście występuje tylko jedna populacja. Trudno jest zatem badać Morze Sargassów, wprowadzać tam pewne zaburzenia i posiadać kontrolne Morze Sargassów do porównania. Dlatego, badając mikroorganizmy w ich przewodzie pokarmowym, otrzymujemy w rzeczywistości przykład środowiska, które nadaje się do zastosowania technik laboratoryjnych.

Możemy odtworzyć to środowisko, wprowadzać do niego zaburzenia i porównywać je z grupami kontrolnymi. Zawsze wiemy z dokładnością do około jednego milimetra, gdzie oddziałują wszystkie te różne grupy i gatunki drobnoustrojów; oddziałują one w tym konkretnym mikrolitrowym środowisku jelitowym. Dlatego w moim laboratorium staramy się badać tę społeczność drobnoustrojów, wykorzystując niemal każdą dostępną technikę, która mogłaby pomóc nam odkryć tajemnice tej społeczności.

Zapewne jednym z aspektów tego podejścia było dążenie do hodowli gatunków występujących w tej społeczności drobnoustrojów. W warunkach in vitro w laboratorium obecność 250 gatunków jest bardzo złożona, a interpretacja wyników badań zyskuje niezrównaną przejrzystość, jeśli można badać czystą kulturę bakterii. Część naszych wysiłków skupiła się na analizie tej społeczności jelitowej i próbach hodowli pojedynczych gatunków z niej wyizolowanych, a następnie szczegółowym badaniu fizjologii, genetyki i genomiki tych gatunków, aby w konsekwencji spróbować odtworzyć, co – naszym zdaniem – oznacza to dla funkcji danego gatunku w tej społeczności.

Przykładem tego jest nasze badanie jelit termitów. Spirochety to organizmy o kształcie spiralnym, które występują obficie u niemal wszystkich termitów. U termitów występują spirochety, które są w rzeczywistości dość blisko spokrewnione z czynnikiem wywołującym syfilis, ale u wszystkich zdrowych termitów można zaobserwować te spirochety.

Przez wiele, wiele lat wiedzieliśmy, że te spirochety prawdopodobnie żyją w symbiozie i wywierają pozytywny wpływ na gospodarza, ale nie wiedzieliśmy, na czym ten wpływ polega. Około 10 lat temu udało mi się wyhodować niektóre z tych spirochet in vitro, dzięki czemu możemy je teraz badać. Dowiedzieliśmy się wiele o ich fizjologii i o tym, jaką rolę te spirochety prawdopodobnie pełnią w środowisku. Przed tym okresem nie mieliśmy pojęcia o tym, co te spirochety robią w swoim środowisku.

Dzięki badaniu tych kultur czystych dokonaliśmy wielu odkryć opartych na wykorzystaniu kultur czystych. Stosujemy również metody genowe do badania tej społeczności mikrobiologicznej. Może istnieć konkretny typ genu reprezentujący określoną fizjologię, a my możemy przeanalizować tę społeczność i zacząć badać, ile wariantów tego genu występuje i jakie organizmy kodują te kluczowe geny?

W ten sposób możemy rozpocząć funkcjonalną analizę procesów zachodzących w tylnej części jelita, badając różnorodność genów zaangażowanych w metabolizm azotu oraz kluczowe aspekty metabolizmu węgla. Możemy również wykorzystać mechanizmy lub podejścia oparte na genach, aby ocenić różnorodność organizmów u termitów. Jako geny markerowe lub kody kreskowe możemy wykorzystać geny rybosomalnego RNA, aby rzetelnie ocenić, ile gatunków występuje w tej społeczności, prawdopodobnie w jakiej liczebności oraz w jakim stopniu nasze czyste kultury odzwierciedlają tę różnorodność. W związku z tym w moim laboratorium stosujemy szereg technik opartych na genach.

Zajmowaliśmy się również metagenomiką, w ramach której interesuje nas badanie zawartości całego genomu tego ekosystemu mikrobiologicznego, aby spróbować określić, jakie różne procesy metaboliczne zachodzą w tej społeczności. W moim laboratorium badamy kultury czyste. Stosujemy techniki oparte na genach z wykorzystaniem PCR, korzystamy z metagenomiki oraz analizujemy aktywności, a konkretnie aktywności enzymatyczne występujące w tym jelicie.

Wykorzystujemy również mikroskopię, aby spróbować dowiedzieć się, gdzie organizmy znajdują się w jelitach oraz z jakimi innymi komórkami oddziałują. W sumie chcemy zrozumieć, ile gatunków występuje w jelicie tylnym, czym się zajmują i w jaki sposób ze sobą oddziałują. Badanie społeczności mikrobiologicznych wiąże się z szeregiem wyzwań, które odróżniają je od innych społeczności występujących w naturze.

Wiadomo, że stosunkowo proste jest udanie się na spacer do lasu lub na sawannę i obserwowanie różnych gatunków roślin i zwierząt, jakie napotykamy podczas wędrówki. Oczywiście w ekologii zbiorowisk w ciągu ostatnich stu lat opracowano wiele metod i podejść, aby zacząć stawiać pytania o to, ile gatunków roślin i zwierząt występuje w danej społeczności oraz z jaką częstotliwością można je w niej spotkać. Następnie polega to na faktycznej obserwacji niektórych z tych organizmów w ich środowisku na przestrzeni czasu, aby sprawdzić, jakie wykształciły one adaptacje do dynamiki środowiskowej oraz do niekorzystnych czynników zewnętrznych, z którymi muszą się mierzyć.

Wiecie, można obserwować słonia lub lwa na sawannie i przyglądać się niektórym z ich zachowań w ramach adaptacji, temu jak pozyskują energię i pożywienie oraz jak wchodzą w interakcje ze sobą. Wszystko to jest dość proste do zaobserwowania, gdy bada się mikroby, czyli organizmy widoczne gołym okiem. Równie proste jest rozróżnienie, czy mamy do czynienia z rośliną, czy ze zwierzęciem.

Nie mam na myśli gatunków, lecz to, jaką pełnią funkcję. Patrząc na dany organizm, można z niemal całkowitą pewnością stwierdzić, że jest to fototrof, czyli organizm absorbujący promieniowanie słoneczne i przekształcający tę energię w coś użytecznego. Albo patrząc na zwierzę pośrednie, można uznać, że zwierzę to wykorzystuje białko jako główne źródło energii.

Istnieje szereg obserwacji, jakie można poczynić, spacerując przez społeczność Hawany lub społeczność leśną. Znacznie trudniej jest jednak sformułować takie obserwacje i wnioski podczas badania społeczności mikrobiologicznych. Organizmy te są małe i nawet przy użyciu bardzo dobrego mikroskopu nie zawsze jest oczywiste, w jaki sposób poszczególne organizmy różnią się od siebie.

Oznacza to, że analizując samą społeczność drobnoustrojów, może być bardzo trudno określić, ile jest w niej gatunków i jakie jest ich rozmieszczenie względne. Może być również bardzo trudno, badając taką społeczność drobnoustrojów pod mikroskopem, odpowiedzieć na pytanie, jaką funkcję pełnią te organizmy. Zatem głównym wyzwaniem w badaniach nad społecznościami drobnoustrojów jest ustalenie, kto w ich skład wchodzi i jaką aktywność wykazuje.

W związku z tym w badaniach nad społecznościami drobnoustrojów musimy stosować różne techniki, aby uzyskać informacje o składzie danej społeczności, o tym, kto jest aktywny, czym zajmują się te organizmy, w jaki sposób reagują oraz jakie wykształciły adaptacje do zmian w swoim środowisku. Od czasu, gdy 17 lat temu, około 1990 roku, po raz pierwszy zainteresowałem się badaniem społeczności drobnoustrojów w jelitach termitów, w mojej dziedzinie nastąpił szereg postępów technologicznych, które umożliwiły mi i innym dowiedzieć się znacznie więcej o społecznościach mikrobiologicznych, a w moim przypadku w szczególności o społecznościach w jelitach termitów. W dużej mierze są to techniki oparte na analizie genów.

Kiedy zaczynałem badać termity, można było korzystać z mikroskopii, aby przyjrzeć się społeczności mikrobiologicznej, takiej jak ta występująca u termitów, i ocenić obecność różnych kształtów w tej społeczności, co pozwalało na przybliżone określenie liczby gatunków w niej występujących. Jednak w ciągu ostatnich 15–17 lat dostępnych stało się tak wiele technik opartych na genach i genomice, że nasza zdolność do wyodrębniania informacji ze społeczności mikrobiologicznych, takich jak jelito tylne termitów, zmieniła się bardzo szybko. Obecnie możemy wykorzystywać geny niemal jako markery kodów kreskowych do identyfikacji różnych organizmów i środowisk.

Możemy przeanalizować społeczność drobnoustrojów, taką jak jelito tylne termita, i ustalić, ile różnych gatunków w niej występuje, wykorzystując określone geny jako wskaźniki tej różnorodności. Gen ten możemy potraktować jako kod kreskowy, aby sprawdzić, czy dane organizmy znajdują się w hodowli, lub wykorzystać ten kod do śledzenia wahań liczebności poszczególnych gatunków w tej społeczności. Stosując inne techniki oparte na analizie genów, możemy postawić pytanie, czy w tej społeczności obecne są geny kodujące enzymy dla konkretnej reakcji.

A ile jest wariantów, czyli ile gatunków organizmów katalizuje ten proces i czy dysponujemy tymi organizmami w hodowli? Pojawiło się szereg podejść opartych na analizie genów oraz PCR (reakcji łańcuchowej polimerazy) do badania społeczności mikrobiologicznych, które radykalnie zmieniły nasze rozumienie tych zbiorowisk. Wszystkie te zmiany dokonały się w ciągu ostatnich 20 lat.

Badanie termitów i ich mikroorganizmów jelitowych jest interesujące zarówno na poziomie badań podstawowych i akademickich, jak i na poziomie biotechnologicznym i badawczym zastosowań praktycznych. Termity zjadają i rozkładają drewno. Dla mnie bardzo ważne jest zrozumienie mechanizmów, dzięki którym termity i ich mikroby jelitowe atakują drewno, które w rzeczywistości jest pierwszym naturalnym materiałem kompozytowym.

Jest to kompozyt trójwarstwowy i jest to materiał bardzo wytrzymały. To, w jaki sposób ten owad oraz mikroby w jego przewodzie pokarmowym odaminują ten kompozyt, a następnie degradują wszystkie jego składniki do produktów, które mogą służyć jako paliwo zarówno dla owada, jak i dla tych mikroorganizmów, jest dla mnie niezwykle fascynujące, ale ma to również fundamentalne znaczenie dla biotechnologii i przemysłu.

Jako społeczeństwo tak naprawdę nie rozumiemy tego w pełni. W rzeczywistości nie mamy zbyt dużej wiedzy na temat tego, w jaki sposób drewno ulega rozkładowi. Obecnie istnieje ogromne zainteresowanie lepszym zrozumieniem procesów degradacji lignocelulozy roślinnej, takiej jak łuski ryżowe, kolby kukurydzy czy pozostałości trzciny cukrowej po odciśnięciu z niej cukru.

Istnieje duże zainteresowanie zrozumieniem, w jaki sposób możemy przekształcić niskowartościowe surowce lignocelulozowe w produkty o wyższej wartości, takie jak etanol, wodór, metan czy jakiekolwiek inne produkty. Kluczowe jest zauważenie, że termity nieustannie degradują drewno lignocelulozowe, przekształcając je we własne biopaliwo. W ujęciu przemysłowym istnieje ogromne zainteresowanie zrozumieniem, jakie enzymy są zaangażowane w ten początkowy etap rozkładu drewna.

Wówczas być może można by wykorzystać te enzymy i połączyć je z innymi procesami następczymi, aby opracować nową metodę, która różniłaby się od obecnie stosowanych rozwiązań przemysłowych oraz naturalnych, lecz w rzeczywistości czerpałaby z najlepszych dostępnych rozwiązań, by stworzyć coś nowego w celu przekształcenia drewna w interesujący produkt. Może to być etanol, wodór, metan lub jakikolwiek inny produkt; w moim laboratorium interesujemy się przede wszystkim osiągnięciem fundamentalnego zrozumienia tej społeczności mikrobiologicznej, jej interakcji z gospodarzem oraz roli, jaką gospodarz i społeczność mikrobiologiczna odgrywają w degradacji lignocelulozy.

Istnieje jednak znaczne zainteresowanie próbami wykorzystania części tych informacji w opracowywaniu nowych procesów przemysłowych. Sądzę, że w ciągu ostatnich dwóch lat toczyło się wiele dyskusji na temat biopaliw, co zwróciło uwagę na potrzebę, a nawet obiecujące perspektywy badań nad biopaliwami. Muszę jednak szczerze przyznać, że poziom finansowania inicjatyw nie jest, moim zdaniem, adekwatny do zainteresowania, jakim zostały one objęte.

Nie istnieje odpowiednik projektu Manhattan dla biopaliw. Nie dokonano żadnych gwałtownych, wielkoskalowych inwestycji w badania podstawowe, które odnosiłyby się do badań nad biopaliwami. A ponieważ nasze fundamentalne zrozumienie degradacji celulozy lignocelulozowej jest obecnie tak dalece niewystarczające, uważam, że jeśli mielibyśmy stworzyć inicjatywę dotyczącą biopaliw, musi ona obejmować ukierunkowane inwestycje na wszystkich poziomach – od fundamentalnych, podstawowych badań akademickich aż po przemysł, aby uczynić to możliwym.

A jeśli chcemy, aby stało się to za dwa, pięć lub 10 lat, będziemy musieli również zainwestować środki, aby ludzie mogli poświęcić swój czas i wysiłek na realizację tego celu. W ciągu ostatnich 20 lat nasze możliwości wykorzystania technik opartych na genach do badania społeczności mikrobiologicznych rozwinęły się bardzo szybko. Myślę, że wszyscy możemy nieco pomarzyć o tym, co może się wydarzyć w ciągu najbliższych pięciu do 10 lat, i uważam, że istnieje bardzo duża szansa, iż za 10 lat będziemy mieli możliwość poznania, zsekwencjonowania i przeanalizowania całego genomu każdego gatunku.

W jelicie tylnym termitów znajduje się co najmniej 250 gatunków i sądzę, że pojawi się możliwość stworzenia swoistej „szafy z dokumentami” z informacjami, w której będziemy znać zawartość genomu każdego z tych gatunków. Będzie to niezwykle przełomowe odkrycie, ponieważ zaledwie 10 lat temu po raz pierwszy sekcjonowaliśmy genomy bardzo dobrze poznanych mikroorganizmów. Myślę, że za kolejne 10 lat będziemy w stanie badać złożone społeczności mikrobiologiczne, uzyskać dostęp do informacji genomowych organizmów, których nigdy wcześniej nie badaliśmy w żadnych szczegółach i wykorzystać to do przeprowadzenia pierwszych w historii badań nad tymi organizmami.