Name: Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych w prekursory oligodendrocytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Poznaj protokół różnicowania mysich komórek macierzystych ES w prekursory oligodendrocytów z wykorzystaniem małych cząsteczek. Metoda osiąga 80% wydajności w ciągu 30 dni i umożliwia generowanie komórek OPC zdolnych do generowania potencjałów czynnościowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca była częściowo finansowana z grantów przyznanych W.D. przez National Institutes of Health (RO1 NS059043 oraz RO1 ES015988), National Multiple Sclerosis Society, Roche Foundation for Anemia Research, Feldstein Medical Foundation oraz Shriners Hospitals for Children.
Dziękujemy dr. Davidowi Pleasure'owi oraz Jennifer Plane za sugestie. Oświadczamy, że nie istnieją żadne konflikty interesów związane z niniejszym artykułem.

Szczegółowe procedury generowania komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) z embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC) GFP-Olig2:
<ol>
 <li>Linia komórek macierzystych zarodkowych myszy GFP-Olig2 (G-Olig2) zostaje zakupiona z American Type Culture Collection (ATCC). mESC są rutynowo pasażowane co 3 dni na warstwę pożywkową z napromieniowanych embrionalnych fibroblastów mysich (MEF). Komórki MEF wysiewa się na sześciodołkową płytkę do hodowli tkankowej powleczoną 0,1% żelatyną co najmniej jeden dzień przed pasażowaniem ESC. Pożywka do hodowli mESC to pożywka Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (GIBCO) uzupełniona o 20% płodowej surowicy bydlęcej (GIBCO), 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 0,1 mM β-merkaptoetanolu/, 1% nieessentialnych aminokwasów (NEAA) oraz 1 000 U/ml czynnika hamującego białaczkę (leukemia inhibitory factor).</li>
 <li>Kolonie mES poddaje się trypsynizacji (TrypLE, 5 min, 37°C) do pojedynczych komórek i zawiesza w pożywce z zamiennikiem surowicy knockout (KSR), a następnie komórki przenosi się na sześciodołkową płytkę Costar o ultra-niskiej adhezji (Corning) przy gęstości 50 000 komórek/cm2. W tych warunkach mESC tworzą ciała zarodkowe (EBs). Pożywka KSR składa się z minimal essential medium (-MEM) uzupełnionego o 20% KSR, 1 mM pirogronianu sodu, 1% NEAA i 0,1 mM β-merkaptoetanolu/.</li>
 <li>Od 4. do 7. dnia do pożywki KSR lub N2 dodaje się kwas retinowy (RA, 0,2 M) i purmorfaminę (Pur, 1 M), zgodnie z rysunkiem 1A. Pożywka N2 to -MEM zawierająca suplement N2 1X, 1 mM pirogronianu sodu, 1% NEAA i 0,1 mM β-merkaptoetanolu/. Pożywkę wymienia się codziennie.</li>
 <li>W 8. dniu ciała zarodkowe (EBs) są rozbijane przy użyciu TrypLE (5 min, 37°C) i wysiewane na naczynia powleczone 0,01% poliornityną w pożywce OPC, która składa się z pożywki N2 i czynnika wzrostu fibroblastów-2 (FGF-2, 20 ng/ml). Pożywkę wymienia się co dwa dni.</li>
 <li>Komórki są trypsynizowane (TrypLE, 3 min, 37°C) i przesiewane mniej więcej co tydzień, gdy osiągną pełną konfluencję. W 30. dniu ponad 80% komórek wykazuje ekspresję GFP/Olig2 i jest pozytywnych pod kątem NG2, co jest charakterystyczne dla OPC.</li>
 <li>W celu generowania OPC wykazujących aktywność elektryczną (spiking OPCs), używa się zestawu BacMam do kanałów Na+, aby wprowadzić podjednostkę Nav1.2 do tych pochodzących z mESC komórek OPC. Odczynnik BacMam (1 ml, komponent A) miesza się z PBS do końcowej objętości 5 ml. Następnie zmieszany odczynnik BacMam dodaje się do hodowli mESC-derived OPC w 60 mm naczyniu hodowlanym (przy 50-70% konfluencji) przed płukaniem PBS. Po 2-godzinnej inkubacji zmieszany odczynnik BacMam jest usuwany i zastępowany pożywką OPC uzupełnioną o enhancer 1X. Enhancer to komponent B zrekonstytuowany w DMSO (komponent C). Następnie, po dodatkowej 2-godzinnej inkubacji, pożywkę z enhancerem usuwa się i zastępuje pełną pożywką OPC. Analizę komórek przeprowadza się 24 godziny później.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki:
Zgodnie z protokołem różnicowania przedstawionym na Ryc. 1A, mESC G-Olig2 zawieszono początkowo w medium KSR na 4 dni w celu utworzenia ciałt embrionalnych (EB) (Ryc. 1B). Następnie EB poddano sekwencyjnej obróbce za pomocą RA i Pur. W 4. dniu EB nie wykazywały fluorescencji GFP, natomiast w 8. dniu (D8) zaobserwowano silną fluorescencję GFP (Ryc. 1B). W tym punkcie czasowym EB poddano trypsynizacji i wysiano w medium N2 uzupełnionym o czynniki wzrostu FGF-2. Po dalszej hodowli przez 22 dni (D30), odsetek komórek GFP+ wyniósł 80,3 ± 0,6% zgodnie z wynikami cytometrii przepływowej. Jak pokazano na Ryc. 1C, komórki GFP+ spójnie nakładały się na barwienie NG2 (96,4 ± 1,3% komórek GFP-dodatnich było NG2-dodatnich, a 94,8 ± 1,5% komórek NG2-dodatnich było GFP-dodatnich). Zatem komórki te wykazują ekspresję GFP/Olig2 oraz NG2, co pozwala zdefiniować je jako OPC.
OPC pochodzące z mESC (76 komórek) nie generowały potencjałów czynnościowych po depolaryzacji (Rys. 2A). Po transdukcji bakulowirusem niosącym podjednostkę Nav1.2, te OPC pochodzące z mESC (94,1%, 16 z 17 komórek) mogły zostać zaklasyfikowane jako komórki generujące impulsy (Rys. 2B).
<img alt="Harmonogram różnicowania; hodowla komórek prekursorowych neuronów; analiza in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej." src="/files/ftp_upload/1960/1960fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Różnicowanie GOlig-mESC w OPC. (A) Schemat przedstawiający protokół różnicowania oparty na ciałach zarodkowych (EB) i napędzany małymi cząsteczkami. W dniu D8 ciała EB zostały rozaggregowane i wysiane. Komórki pasażowano raz w tygodniu po osiągnięciu konfluencji. (B) Ciała EB w dniu D8, ale nie w dniu D4, wykazały ekspresję GFP. (C) Immunobarwienie NG2 (czerwony) było zgodne z ekspresją GFP (zielony) w dniu D30. DAPI (niebieski) wykorzystano do identyfikacji jąder komórkowych. Pasek skali: 20 mm.
<img alt="Dane z zacisku napięciowego, aktywność kanałów jonowych; wykres przedstawiający zmiany potencjału błonowego przy -60 mV." src="/files/ftp_upload/1960/1960fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Generowanie wykazujących aktywność impulsacyjną OPC z nieimpulsacyjnych OPC pochodzących z mESC poprzez wirusową ekspresję kanałów Nav. (A) Potencjał błonowy utrzymywano na poziomie -60 mV; OPC pochodzące z mESC nie generowały potencjałów czynnościowych, nawet po depolaryzacji komórki do 0 mV. (B) Przykład generowania potencjału czynnościowego (zaznaczonego na czerwono) przez OPC pochodzące z mESC po transdukcji wirusowej.

<ol><li>Xian, H., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dividing+Olig2-expressing+progenitor+cells+derived+from+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Dividing Olig2-expressing progenitor cells derived from ES cells.</a> Glia. 47 (1), 88-101 (2004).</li>
<li>Clair, A., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+ES-cell-derived+neural+cells+marked+by+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A subset of ES-cell-derived neural cells marked by gene targeting.</a> Stem Cells. 21 (1), 41-49 (2003).</li>
<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Shin, S., Xue, H., Mattson, M. P., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-dependent+Olig2+expression+in+motor+neurons+and+oligodendrocytes+differentiated+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Stage-dependent Olig2 expression in motor neurons and oligodendrocytes differentiated from embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 16, 131-141 (2007).</li>
<li>Billon, N., Jolicoeur, C., Ying, Q. L., Smith, A., Raff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+timing+of+oligodendrocyte+development+from+genetically+engineered%2C+lineage-selectable+mouse+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Normal timing of oligodendrocyte development from genetically engineered, lineage-selectable mouse ES cells.</a> J Cell Sci. 115, 3657-3665 (2002).</li>
<li>Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-localization+of+NG2+proteoglycan+and+PDGF+alpha-receptor+on+O2A+progenitor+cells+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Co-localization of NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells in the developing rat brain.</a> J Neurosci Res. 43, 299-314 (1996).</li>
<li>Ligon, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+NG2+neural+progenitor+cells+requires+Olig+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Development of NG2 neural progenitor cells requires Olig gene function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 7853-7858 (2006).</li>
<li>Dawson, M. R., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-expressing+glial+progenitor+cells%3A+an+abundant+and+widespread+population+of+cycling+cells+in+the+adult+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS.</a> Mol Cell Neurosci. 24, 476-488 (2003).</li>
<li>Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-positive+cells+in+the+mouse+white+and+grey+matter+display+distinct+physiological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties.</a> J Physiol. 561, 109-122 (2004).</li>
<li>Karadottir, R., Hamilton, N. B., Bakiri, Y., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiking+and+nonspiking+classes+of+oligodendrocyte+precursor+glia+in+CNS+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spiking and nonspiking classes of oligodendrocyte precursor glia in CNS white matter.</a> Nat Neurosci. 11, 450-456 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

embrionalne komórki macierzyste (ESCs), wyizolowane z blastocysty, mogą różnicować się we wszystkie linie komórkowe organizmu 3, 4, stanowiąc model in vitro do badania wczesnego rozwoju ssaków, w tym specyfikacji oligodendrocytów. Wykazano, że mESCs różnicują się w komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPCs) pod wpływem działania białka sonic hedgehog (Shh) 5. Co więcej, indukowane przez Shh różnicowanie OPC z mESCs zachowuje prawidłową chronologię obserwowaną w rozwoju embrionalnym 6. Zatem charakter różnicowania OPC z mESCs in vitro uznaje się za spójny z wiedzą zdobytą na podstawie rozwoju in vivo. W niniejszej pracy, wykorzystując małe cząsteczki RA oraz agonistę Shh, Pur, z sukcesem i wysoką wydajnością zróżnicowano mESCs G-Olig2 w komórki GFP+Olig2+NG2+ OPCs. OPC, charakteryzujące się ekspresją proteoglikanu NG2 7 oraz czynnika transkrypcyjnego z motywem helix-loop-helix Olig2 8, generują oligodendrocyty w rozwijającym się i dojrzałym OUN, gdzie stanowią znaczący odsetek (~ 5%) wszystkich komórek i są głównym proliferującym typem komórek 9. Przez niemal dwie dekady badacze wykazywali, że kanały NaV są ekspresjonowane w subpopulacji OPC i mogą być aktywowane podczas depolaryzacji 10, 11. Co więcej, niedawna uderzająca obserwacja9 wykazała, że w białej materii OUN szczura in situ, OPC (~ 50%) generowały potencjały czynnościowe podczas depolaryzacji w zależności od ekspresji napięciowo zależnych kanałów sodowych (NaV), a zatem można je podzielić na subpopulacje generujące i niegenerujące impulsów (spiking i nonspiking). Funkcje tych właściwości generowania impulsów pozostają jednak w dużej mierze nieznane. Stwierdziliśmy, że pod względem elektrofizjologicznym OPC pochodzące z mESC, zróżnicowane zgodnie z protokołem zależnym od Shh, nie były identyczne z OPC mózgu in situ. Po wprowadzeniu podjednostki NaV1.2 te nieaktywne OPC pochodzące z mESC zyskały zdolność do generowania impulsów. Zatem opisane tutaj OPC pochodzące z mESC, wykazujące lub niewykazujące aktywności impulsowej, oraz protokół różnicowania mogą ułatwić (1) badanie różnic funkcjonalnych między impulsowymi a nieimpulsowymi OPC, (2) przesiewanie nowych czynników, które mogłyby promować ekspresję kanałów sodowych w OPC pochodzących z mESC, (3) opracowanie i optymalizację protokołu różnicowania OPC z ludzkich ESC lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs).

<table><tbody><tr><td>MEF</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6001G</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R-2625</td><td></td></tr><tr><td>Purmorfamina</td><td>Cayman Chemical</td><td>10009634</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>EMD Millipore</td><td>GF003</td><td></td></tr><tr><td>BacMam Na&lt;sub&gt;V&lt;/sub&gt; 1.2</td><td>Invitrogen</td><td>B10341</td><td></td></tr></tbody></table>

różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych w prekursory oligodendrocytów

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocyty są komórkami mielinizującymi ośrodkowego układu nerwowego. W kontekście regeneracyjnej terapii komórkowej w chorobach demielinizacyjnych istnieje duże zainteresowanie uzyskiwaniem czystej populacji zdeterminowanych progenitorów oligodendrocytów (OPC) do transplantacji. OPC charakteryzują się aktywnością czynnika transkrypcyjnego Olig2 oraz ekspresją powierzchniową proteoglikanu NG2. Wykorzystując linię reporterową embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC) GFP-Olig2 (G-Olig2), zoptymalizowaliśmy warunki różnicowania mESC w komórki GFP+Olig2+NG2+ OPC. W naszym protokole opisujemy najpierw generowanie ciał embrionalnych (EB) z mESC. Następnie opisujemy traktowanie pochodnych od mESC ciał EB małymi cząsteczkami: (1) kwasem retinowym (RA) oraz (2) agonistą białka sonic hedgehog (Shh), purmorfaminą (Pur), w określonych warunkach hodowli w celu ukierunkowania różnicowania EB w kierunku linii oligodendroglialnej. Dzięki temu podejściu OPC można uzyskać z wysoką wydajnością (&gt;80%) w czasie 30 dni. Komórki pochodne mESC uzyskane w tym protokole są fenotypowo podobne do OPC pochodzących z pierwotnych kultur tkankowych. OPC pochodne mESC nie wykazują właściwości generowania potencjałów kolczastych (spiking), które opisano dla subpopulacji OPC mózgu in situ. Aby zbadać tę właściwość elektrofizjologiczną, opisujemy generowanie wykazujących spiking OPC pochodnych mESC poprzez ektopową ekspresję NaVpodjednostka 1.2. Komórki generujące i niegenerujące impulsów uzyskane dzięki temu protokołowi pomogą w rozwoju badań funkcjonalnych nad dwiema subpopulacjami OPC.

Opisujemy protokół oparty na małych cząsteczkach służący do różnicowania mysich embrionalnych komórek macierzystych w komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPC). Protokół ten pozwala na wysokowydajne generowanie komórek OPC Olig2+NG2+ w ciągu 30 dni różnicowania. Opisujemy również metodę generowania „spiking” OPC, które są zdolne do generowania potencjałów czynnościowych.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych w prekursory oligodendrocytów

Oligodendrocyty są komórkami mielinizującymi ośrodkowego układu nerwowego. W kontekście regeneracyjnej terapii komórkowej w chorobach demielinizacyjnych istnieje znaczne...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie prekursorów oligodendrocytów z embrionalnych komórek macierzystych poprzez serię etapów hodowli trwających 30 dni. Osiąga się to najpierw poprzez wytworzenie ciał embrionalnych z mysich komórek ES w celu zainicjowania różnicowania komórek. W drugim kroku ciała embrionalne są traktowane małymi cząsteczkami – kwasem retinowym i czystą morfiną – które indukują ukierunkowane różnicowanie komórek w ligand.Prekursory cyte. W trzecim kroku, po dodatkowych 22 dniach, ciała zarodkowe są dysaggregowane do pojedynczych komórek. W hodowli około 80% komórek to OPC.Następnie OPC pochodzące z MESC są transdukowane wirusami bao niosącymi podjednostkę NAV 1.2 w celu wygenerowania OPC zdolnych do generowania potencjałów czynnościowych; uzyskane wyniki, oparte na mikroskopii immunofluorescencyjnej i rejestracjach elektrofizjologicznych, wykazują ekspresję markera OPC oraz właściwości generowania potencjałów czynnościowych przez te OPC pochodzące z MESC. Cześć, jestem Pong Chiang z laboratorium dr. Ing w Katedrze Biologii Komórki i Anatomii Człowieka na University of California Davis. Jesteśmy również powiązani ze Shriners Hospital for Children of Northern California.Cześć, jestem vial Raj, również z laboratorium Deng. Dzisiaj przedstawimy procedurę różnicowania mysich embrionalnych komórek macierzystych w prekursory oligodendrocytów. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby badać właściwości prekursorów oligodendrocytów pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych w celu generowania komórek o lepszym potencjale terapeutycznym.Zacznijmy. Dzisiaj z linii komórek macierzystych zarodkowych myszy OG2-GFP zostaną wygenerowane prekursorowe komórki oligodendrocytów, czyli OPC. Te embrionalne komórki macierzyste muszą być pasażowane co trzy dni, aby zachować ich żywotność przy optymalnej gęstości oraz zapobiec spontanicznej różnicowaniu. Pasażowanie.Komórki ESS, gdy osiągną 70% konfluencji, w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Usunąć medium z hodowli. Przepłukać PBS i potraktować trypsyną za pomocą 2 mL podgrzanego roztworu.Inkubować przez pięć minut w temperaturze 37 °C. Zatrzymać reakcję i resuspenderować komórki w czterech mililitrach pożywki MES. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 1000 rpm przez pięć minut.Ponownie zawiesić w płytce z medium MESL, przenosząc 1/10 komórek na konfluentną warstwę napromieniowanych komórek karmicielek meth w medium komórkowym MES. Po trzech dniach komórki ES osiągają około 70% konfluencji i są gotowe do pasażowania lub zawieszenia w celu utworzenia ciał embrionalnych w celu indukcji ciał embrionalnych i rozpoczęcia różnicowania. Potraktować kolonie mysich komórek ES trypsyną jak poprzednio, a następnie ponownie zawiesić komórki w medium z zamiennikiem surowicy knockout lub medium KSR. Policzyć komórki w komorze Hemocytometru, a następnie rozcieńczyć zawiesinę w KSR.Poziom medium dostosowany do stężenia 15 000 komórek na mililitr należy nanieść w ilości 3 ml do każdego dołka sześciodołkowej płytki hodowlanej o ultraniskiej adhezji. Komórki w zawiesinie należy inkubować w temperaturze 37 °C przez cztery dni. Co dwa dni należy całkowicie wymienić medium.Zaczynając od czwartego dnia, należy codziennie wymieniać pożywkę. W czwartym dniu należy uzupełnić KSR o 0,2 µM kwasu retinowego, a w piątym dniu uzupełnić go zarówno kwasem retinowym, jak i 1 µM primor famine. W szóstym i siódmym dniu należy hodować ciała embrionalne w dwóch pożywkach uzupełnionych o 0,2 µM kwasu retinowego i 1 µM primor famine. Po ośmiu dniach hodowania większość ciał embrionalnych wykazuje ekspresję GFP i jest gotowa do dysagregacji przy użyciu trypsyny; następnie należy policzyć komórki w sposób opisany wcześniej.Następnie resuspenduj je do stężenia 3,5 × 10⁵ komórek na ml. W medium OPC rozcieńcz trzy mililitry zawiesiny w medium OPC. Przy użyciu 60-milimetrowych naczyń pokrytych poliornityną, mniej więcej co tydzień komórki osiągną pełną konfluencję i będą wyglądać w ten sposób; przeprowadź pasaż komórek jak poprzednio, stosując trzy minutową trypsynizację.30 dni po pierwotnej zawiesinie reanimacyjnej. W pożywce KSR komórki wykazują cechy prekursorowych komórek oligodendrocytów, aby generować OPCs zdolne do generowania potencjałów czynnościowych. Należy użyć OPCs pochodzących z mysich ESL, które osiągnęły od 50 do 70% konfluencji.Wymień pożywkę na XPBS w celu wypłukania komórek. Aby wprowadzić podjednostkę alfa kanału sodowego sterowanego napięciem 1.2.Używamy zestawu do kanałów sodowych back MAM. Mieszamy 1 mL składnika A back MAM z 4 mL 1x PBS. Usuwamy płuczkę PBS i dodajemy rozcieńczony składnik.Inkubować w temperaturze 37°C przez dwie godziny. Zastąpić czynnik pamięci powrotnej medium OPC wzbogaconym o komponenty B i C, zgodnie z opisem w zestawie. Inkubować przez kolejne dwie godziny w temperaturze 37°C.Po inkubacji należy zastąpić medium wzbogacone świeżym medium OPC. Po kolejnych 24 godzinach hodowli można przeprowadzić analizę kolców (spiking) w odniesieniu do pochodnych z ESL komórek OPC. EBS nie wykazują fluorescencji GFP.Embryonalne ciała albuminowe (EBS) wykazują silną ekspresję GFP i są gotowe do hodowli po dysagregacji przez około 30 dni po pierwotnej resuspensji. W pożywce KSR większość komórek jest immunopozytywna w barwieniu na NG2, co jest zgodne z ekspresją GFP. Jednak w przeciwieństwie do OPC pochodzących z mózgu, te OPC pochodzące z komórek MES nie generują potencjałów czynnościowych, nawet gdy komórki zostaną zdepolaryzowane do 0 mV.Po wprowadzeniu podjednostki NAV 1.2 za pomocą transdukcji wirusowej, te pochodzące z komórek MES OPC ulegają pobudzeniu i generują potencjały czynnościowe. Przedstawiliśmy właśnie sposób różnicowania embrionalnych komórek macierzystych myszy w OPC oraz generowania wykazujących aktywność elektryczną (spiking) OPC poprzez transdukcję wirusową. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o właściwym przechowywaniu kwasu retinowego, morfiny i FGF two oraz zawsze używać świeżych alikwotów; wszelkie pozostałości kwasu retinowego po użyciu należy zutylizować.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

differentiation-embryonic-stem-cells-into-oligodendrocyte

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Różnicowanie komórek macierzystych zarodkowych w prekursory oligodendrocytów

Ten artykuł opisuje metody uzyskiwania wzbogaconych populacji mysich komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) w hodowli podstawowej, które różnicują się w celu wytworzenia dojrzałych oligodendrocytów (OL). Ponadto w raporcie opisano techniki wytwarzania mysich kokultur mielinizacyjnych poprzez wysiewanie mysich OPC na łożu neurytowym neuronów zwojowych korzenia grzbietowego myszy (DRGN).

Wyprowadzanie wzbogaconych kultur oligodendrocytów i kokultur mielinizujących oligodendrocyty/neurony z postporodowych tkanek myszy

Niniejszy protokół opisuje metodę otrzymywania prekursorów ograniczeń glejowych (Glial Restricted Precursors) z płodowych rdzeni kręgowych oraz ich utrzymywanie in vitro w celu transplantacji lub badania linii oligodendrocytów.

Wyizolowanie prekursorów ograniczonych do linii glejowej (GRP) od myszy w 13. dniu embrionalnym (E13)

Pierwotne, wielopotencjalne komórki progenitorowe pochodzące z ludzkiego płodowego mózgu proliferują in vitro, zachowując zdolność do różnicowania się w neurony i astrocyty. Niniejsza praca wykazuje, że progenitorom neuralnym można indukować różnicowanie poprzez kolejne stadia linii oligodendrocytarnej za pomocą kondycjonowania wybranymi czynnikami wzrostu.

System hodowli oligodendrocytów pochodnych z komórek progenitorowych ludzkiego płodu

Ten film demonstruje szczegółowy protokół izolowania ścian bocznych komór od mózgu dorosłej myszy i przeprowadzania enzymatycznej dysocjacji tkanek w celu uzyskania pojedynczych komórek. Komórki te są następnie poddawane specyficznym warunkom hodowli, które selektywnie zwiększają proliferację nerwowych komórek macierzystych i promują ich różnicowanie w kokultury oligodendrocytów i astrocytów.

Uzyskiwanie mieszanej kultury oligodendrocytów i astrocytów z dorosłych komórek macierzystych nerwowych myszy

Ten film pokazuje proces generowania komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, a następnie dojrzewania OPC do oligodendrocytów. Ten proces generowania oligodendrocytów otwiera wiele możliwości poprawy badań i leczenia chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera.

Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w oligodendrocyty

Ten film demonstruje ustanowienie kokultury ludzkich neuronów indukowanych (iN) i indukowanych komórek prekursorowych oligodendrocytów (iOPC). iN są mieszane z iOPC w kokulturze, a następnie inkubowane, aby wspierać dojrzewanie zarówno iN do neuronów, jak i iOPC do oligodendrocytów. Neurony tworzą połączenia synaptyczne z innymi neuronami i oligodendrocytami, podczas gdy oligodendrocyty rozwijają osłonki mielinowe wokół aksonów neuronów.

Metoda wspólnej hodowli do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty

Oligodendrocyty to komórki mielinizujące ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje metodę izolacji i hodowli ich prekursorów, komórek progenitorowych oligodendrocytów, z kory szczura, a także szybką i wiarygodną metodę ilościową oceny oligodendrogenezy in vitro w odpowiedzi na czynniki eksperymentalne.

Przygotowanie hodowli progenitorowych oligodendrocytów szczurów i kwantyfikacja oligodendrogenezy za pomocą skanowania fluorescencyjnego w podwójnej podczerwieni

Ten protokół opisuje metodę generowania prekursorów interneuronów korowych i prekursorów interneuronów postmitotycznych z embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu zmodyfikowanej metody embrionalnej ciała do monowarstwy. Te progenitory/prekursory mogą być używane in vitro lub sortowane fluorescencyjnie i przeszczepiane do kory nowej noworodka w celu badania determinacji losu lub wykorzystywane w zastosowaniach terapeutycznych.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w prekursory interneuronów korowych

Opisujemy immunomagnetyczną izolację pierwotnych oligodendrocytów myszy, która pozwala na szybką i specyficzną izolację komórek do hodowli in vitro.

Szybka i swoista izolacja immunomagnetyczna pierwotnych oligodendrocytów myszy

Interakcje neuron-glej w neurodegeneracji nie są dobrze poznane z powodu nieodpowiednich narzędzi i metod. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowane protokoły uzyskiwania indukowanych neuronów, komórek prekursorowych oligodendrocytów i oligodendrocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz podajemy przykłady wartości tych metod w zrozumieniu wkładu specyficznego typu komórki w chorobie Alzheimera.

Generowanie ludzkich neuronów i oligodendrocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty

Opisujemy produkcję mieszanych kultur astrocytów i komórek prekursorowych oligodendrocytów pochodzących z płodowych lub dorosłych nerwowych komórek macierzystych różnicujących się w dojrzałe oligodendrocyty, oraz modelowanie in vitro szkodliwych bodźców. Połączenie z techniką badań przesiewowych o wysokiej zawartości komórek tworzy niezawodny i solidny system badań przesiewowych leków.

Analiza przesiewowa, różnicowanie i dojrzewanie płodowych i dorosłych komórek macierzystych pochodzących z płodowych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego

Poznaj protokół różnicowania mysich komórek macierzystych ES w prekursory oligodendrocytów z wykorzystaniem małych cząsteczek. Metoda osiąga 80% wydajności w ciągu 30 dni i umożliwia generowanie komórek OPC zdolnych do generowania potencjałów czynnościowych.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych w prekursory oligodendrocytów

Przeglądaj więcej filmów