Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych w prekursory oligodendrocytów

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wytworzenie prekursorów oligodendrocytów z embrionalnych komórek macierzystych poprzez serię etapów hodowli przez 30 dni. Osiąga się to poprzez najpierw wygenerowanie ciał zarodkowych z mysich komórek ES w celu zainicjowania różnicowania komórek. W drugim etapie ciała zarodków są traktowane małymi cząsteczkami, kwasem retinowym i czystą morfiną, które indukują ukierunkowane różnicowanie komórek w liga den.

Prekursory cytów. W trzecim etapie ciała zarodków są rozkładane na pojedyncze komórki po dodatkowych 22 dniach. W hodowli około 80% komórek to OPC.

Następnie OPC pochodzące z MESC są transdukowane wirusami bao przenoszącymi podjednostkę NAV 1.2 w celu wygenerowania impulsowych OPC, uzyskuje się wyniki, które pokazują ekspresję markera OPC i właściwości impulsowe tych OBC pochodzących z MESC w oparciu o mikroskopię immunofluorescencyjną i zapisy elektrofizjologiczne. Cześć, nazywam się Pong Chiang i pracuję w laboratorium doktora inż. Inż. na Wydziale Biologii Komórki i Anatomii Człowieka na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis. Jesteśmy również powiązani ze Szpitalem Dziecięcym Shriners w Północnej Kalifornii.

Cześć, jestem Raj w fiolce, również z laboratorium Deng. Dzisiaj pokażemy Wam procedurę różnicowania mysich komórek macierzystych emrona w komórki prekursorowe ludobójstwa. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania właściwości embrionalnych prekursorów komórek macierzystych derd oligodendrocytów w celu wytworzenia komórek o lepszym potencjale terapeutycznym.

Więc zacznijmy. Obecnie komórki prekursorowe oligodendrocytów lub OPC będą generowane z linii embrionalnych komórek macierzystych myszy OG two GFP. Te embrionalne komórki macierzyste muszą być pasażowane co trzy dni, aby utrzymać je w zdrowiu w optymalnej gęstości i zapobiec spontanicznemu różnicowaniu. Przejście.

Komórki ESS, gdy znajdują się w 70% zbiegu pod okapem z przepływem laminarnym. Usuń pożywkę z kultury. Przemyj oczy PBS i trypsyną dwoma mililitrami podgrzanego.

Jeden x przejazd LE express przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zatrzymaj reakcję i ponownie zawieś komórki w czterech mililitrach pożywki MES Cell Medium. Przenieś komórki do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i granuluj je w temperaturze 1000 RP przez pięć minut.

Zawiesić ponownie na płytce pożywki MESL jedną dziesiątą komórek nad zlewającą się warstwą napromieniowanych podajników metamfetaminy w pożywce MES. Po trzech dniach komórki ES są w około 70% zlewające się i są gotowe do pasażu lub zawieszenia w celu utworzenia ciał zarodków w celu indukcji ciał zarodków i rozpoczęcia różnicowania kolonii komórek ES myszy trypsyny, jak wcześniej, a następnie ponownie zawiesić komórki w wymianie surowicy nokautującej lub pożywce KSR. Policz komórki na hemo TER, rozcieńczyć zawiesinę w KSR.

Pożywka do 15 000 komórek na mililitr płytki trzy mililitry do każdej studzienki ultranisko nasadki sześciodołkowej hodowli płytkowej. Zawieszone komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery dni. Całkowicie zmieniaj podłoże co dwa dni.

Począwszy od czwartego dnia, zastępuj pożywkę codziennie czwartego dnia Uzupełnij KSR 0,2 mikromolowym kwasem retinowym w piątym dniu suplement zarówno kwasem retinowym, jak i jednym mikromolowym pierwotnym głodem w szóstym i siódmym dniu. Nakarm ciała zarodków w dwóch pożywkach, uzupełnionych 0,2 mikromolowym kwasem retinowym i jednym mikromolowym pierwotnym głodem. Po ośmiu dniach w hodowli większość ciał zarodków wykazuje ekspresję GFP i jest gotowa do dezagregacji oczu trypsyny i liczenia komórek jak poprzednio.

Następnie zawiesić je na poziomie 3,5 razy 10 do piątych komórek na mililitr. W medium OPC odlać trzy mililitry zawiesiny w medium OPC. Używając 60-milimetrowych szalek pokrytych poliornityną mniej więcej co tydzień, komórki staną się zlewające się i będą wyglądać jak to przejście do komórek, jak poprzednio, z trzyminutową trypsynizacją.

30 dni po pierwotnym zawieszeniu resus. W pożywce KSR komórki wykazują cechy komórek prekursorowych oligodendrocytów w celu generowania impulsowych OPC. Użyj mysich OPC pochodzących z ESL, które są w zakresie od 50 do 70% zlewnych.

Wymień pożywkę na jeden XPBS, aby przepłukać ogniwa. Aby wprowadzić sód bramkowany napięciem. Kanał 1.2 podjednostka alfa.

Używamy tylnego zestawu kanału sodowego MAM. Wymieszaj jeden mililitr tylnego składnika A MAM z czterema mililitrami jednego XPBS. Usunąć płukanie PBS i dodać rozcieńczony składnik.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Zastąp agenta pamięci tylnej nośnikiem OPC wzbogaconym o komponenty B i C, zgodnie z opisem w zestawie. Instrukcje inkubować przez dodatkowe dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po inkubacji zastąp wzmocnioną pożywkę świeżą pożywką OPC. Po kolejnych 24 godzinach hodowli, OPC pochodzące z ESL mogą zostać oznaczone pod kątem skoków w tym punkcie czasowym. EBS nie wykazują fluorescencji GFP.

EBS wykazują silną ekspresję GFP i są gotowe do hodowli dezagregacyjnej przez około 30 dni po pierwotnym zawieszeniu rezu. W pożywce KSR większość komórek jest immunododatnia pod kątem barwienia NG 2, co jest zgodne z ekspresją GFP. Jednak w przeciwieństwie do OPC mózgu, te OPC pochodzące z komórek MES nie wystrzeliwują potencjałów czynnościowych nawet wtedy, gdy komórki zostały zdepolaryzowane do zera miliwoltów.

Po wprowadzeniu podjednostki NAV 1.2 przez transdukcję wirusa, te OPC pochodzące z komórek MES uzyskują wzbudzenie i potencjały działania ognia. Właśnie pokazaliśmy, jak różnicować embrionalne komórki macierzyste myszy w OPC i generować impulsowe OPC poprzez transdukcję wirusa. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać o prawidłowym przechowywaniu kwasu retinoidowego na morfinę i FGF dwa i zawsze używać świeżych porcji, po użyciu wyrzucić nadmiar kwasu retinoidowego.

Więc to wszystko. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.