Ładowanie ładunku na molekularne wahadła napędzane kinezyną

Ogólnym celem tej procedury jest osadzenie nanokulek na mikrotubulach, które przesuwają się po powierzchni pokrytej kinazą w motorach. Jest to osiągane poprzez uprzednie pokrycie powierzchni szklanej komory przepływowej roztworem kazeiny. Drugim krokiem procedury jest adsorpcja białek motorowych kinezyny na powierzchni komory przepływowej.

Trzecim krokiem procedury jest dodanie mikrotubul. Ostatnim etapem procedury jest dodanie cząsteczek streptawidyny, które zwiążą się z mikrotubulami, a następnie dodanie nanosfer. Nanosfery wiążą się z powierzchnią komory przepływowej, gdzie mogą zostać pochwycone przez mikrotubule.

Ostatecznie, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej można zaobserwować, w jaki sposób nanosfery są wychwytywane przez mikrotubule i transportowane po powierzchni. Cześć, nazywam się Elaine Jen Smith, pochodzę z laboratorium dr. Henry’ego Hessa oraz z Katedry Inżynierii Materiałowej na Uniwersytecie Florydy. Dzisiaj przedstawimy Państwu procedurę odwróconego testu motyliczności.

Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania ładowania ładunku na mikrotubule oraz ruchu czółenek molekularnych. Zatem zacznijmy. Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować świeże roztwory zapasowe zgodnie z opisem w części pisemnej tego filmu.

Po przygotowaniu roztworów zapasowych należy rozpocząć przygotowanie mikroprobek, pipetując 25 µL roztworu wzrostowego do probówki mikrocentryfużowej o pojemności 0,65 ml. Następnie dodać 6,25 µL roztworu wzrostowego do 20 µg liofilizowanej tubuliny biotynylowanej. Roztwór należy wymieszać w wirówce typu vortex i umieścić w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu polimeryzacji. Po inkubacji roztwór należy rozcieńczyć 100-krotnie w buforze Taxol i delikatnie wymieszać w wirówce typu vortex.

Roztwór ten służy do stabilizacji mikrotubul. Oznacz roztwór jako MT 100 i przechowuj go w temperaturze pokojowej. Następnie wykonaj dziesięciokrotne rozcieńczenie MT 100 w buforze antyblakowym (anti fade buffer) i oznacz ten roztwór jako MT 1000.

Następnie przygotuj motory kinezyny, rozcieńczając 20-krotnie roztwór kinezyny w buforze TP. Oznacz roztwór jako kinezyna 20 i przechowuj go w lodzie. Na koniec przygotuj roztwory streptawidyny i nanokulek.

W pierwszej kolejności należy dodać znakowaną Alexa Fluor 568 streptawidynę do stężenia 100 nM w buforze Antifa. Roztwór należy oznaczyć jako STV 100, a następnie rozcieńczyć nanosphere 5000-krotnie w buforze Antifa i oznaczyć tę mieszaninę jako NS 5 000. Oba roztwory należy przechowywać w lodzie.

Po przygotowaniu roztworów do testu ładowania ładunku (cargo loading assay), należy skonstruować komorę przepływową, używając szkiełka przedmiotowego oraz szkiełka nakrywki, rozdzielonych taśmą dwustronną. Najpierw naklej dwa paski taśmy dwustronnej na krawędziach szkiełka przedmiotowego, pozostawiając przerwę o szerokości około jednego centymetra między paskami. Następnie połóż szkiełko nakrywkę na taśmie.

Naciskając płaską krawędzią pęsety, dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby stworzyć szczelne zamknięcie. Skonstruowana komora przepływowa ma około dwóch centymetrów długości, jednego centymetra szerokości i 100 mikronów wysokości, a jej objętość wynosi około 20 microliters. Aby rozpocząć montaż odwróconego układu do analizy.

Umieść końcówkę pipety pomiędzy szkiełkiem nakrywkowym a przedmiotem. Następnie wstrzyknij do komory przepływowej 0,5 mg/ml roztworu kazeiny. Powłoka ta na ściankach komory przepływowej pozwoli kinezynie zachować funkcjonalność po adsorpcji.

Odczekać pięć minut, aż roztwór kazeiny pokryje powierzchnię. Następnie zaabsorbować Kinezynę do komory przepływowej, wprowadzając kinazę w 20 roztworach; roztwory wprowadza się do komór przepływowych, umieszczając końcówkę pipety pomiędzy szkiełkiem przykrywkowym a podstawką. Następnie roztwór jest wstrzykiwany do komory przepływowej z jednej strony, podczas gdy jednocześnie jest on odsysany z drugiej strony.

Za pomocą papieru filtracyjnego odczekać pięć minut, aby kinazy wniknęły w podłoże. Następnie wprowadzić mikrotubule do komory przepływowej, pipetując do niej roztwór MT 1000. Odczekać pięć minut, aby mikrotubule osiadły i przyłączyły się do motorów kinazy po związaniu mikrotubul z motorami kinazy.

Pokryj mikrotubule fluorescencyjnym strep TTR, wprowadzając roztwór STV 100 do komory przepływowej. Odczekaj pięć minut, aby cząsteczki strep TTR związały się z mikrotubulami. Wypłucz nadmiar strep TTR, wprowadzając do komory przepływowej trzy porcje roztworu Antifa po 30 µL każda.

Na koniec wprowadź biotynilowane polistyrenowe nanokulki fluoresceinowe, pipetując roztwór NS 5, 000 do komory przepływowej. Powierzchnia absorbuje je stacjonarnie. Nanokulki będą zderzać się z poruszającymi się mikrotubulami i osadzać się na nich.

W tym eksperymencie wykorzystano mikroskop fluorescencyjny eclipse TE 2000 U wyposażony w obiektyw imersyjny 100x, system X site, lampę one 20 oraz kamerę exon E-M-C-C-D. Najpierw nanieś jedną kroplę olejku imersyjnego na obiektyw. Następnie zamocuj celę przepływową na stoliku mikroskopu, korzystając z kostki filtracyjnej trixy.

Ustaw ostrość na mikrotubule, a następnie przełącz się na kostkę filtrów fitzy, aby zobrazować nanosfery. Następnie otwórz program and or I exon i ustaw tryb akwizycji na kinetyczny. Użyj czasu ekspozycji 0,5 seconds, długości serii kinetycznej 20 oraz czasu cyklu kinetycznego sześć seconds.

Przełącz mikroskop z okularów na kamerę i rozpocznij akwizycję obrazów. W przypadku pierwszych czterech obrazów użyj kostki trixi do obrazowania mikrotubul. W przypadku kolejnych 12 obrazów przełącz na kostkę filtra Fitz, aby uzyskać obrazy nanosfer.

Następnie powróć do kostki filtru trixi. W przypadku ostatnich czterech obrazów obrazujących mikrotubule, obserwuje się je przy użyciu kostki filtru Trissy, a następnie kostkę filtru przełącza się na fite. Aby zwizualizować tutaj nanosfery, nanosphere transportowane przez mikrotubule zostały oznaczone strzałkami. Nie wszystkie nanosfery zostały przechwycone przez mikrotubule.

Następnie pokazano położenie nanosfer po 36 sekundach, co ujawniło, że nanosfery uległy przesunięciu. Po ponownym obrazowaniu mikrotubul stało się jasne, że mikrotubule również przemieściły się w polu widzenia. Obrazy te dowodzą, że nanosfery zostały przemieszczone w wyniku transportu mikrotubularnego.

Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić test ruchliwości w układzie odwróconym. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zmianie kostek filtracyjnych podczas akwizycji obrazów, tak aby widoczne były zarówno mikrotubule, jak i nanosfery. To wszystko.

Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.