Name: Załadunek ładunku na wahadłowce molekularne zasilane kinezyną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Poznaj metodę ładowania nanosfer na mikrotubule napędzane kinezyną w celu transportu nanoskalowego. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów molekularnych w biologii komórkowej i nanotechnologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy ogromnie wdzięczni Jonathonowi Howardowi, którego zespół opracował podstawowy protokół analizy motyli ślizgowych, który został następnie przez nas zaadaptowany. Wyrażamy wdzięczność za wsparcie finansowe z grantu NSF DMR0645023.

1.) Bufory i odczynniki
Roztwory te należy przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w alikwotach o dogodnej objętości. Alikwot powinien zawierać ilość roztworu wystarczającą do przeprowadzenia typowego eksperymentu, a do każdego testu motywności należy użyć świeżej porcji. Warunki przechowywania oraz typowe objętości alikwotów zostały również opisane w poniższych protokołach.
1. Bufor BRB80 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA w dejonizowanej wodzie destylowanej (dd), pH skorygowane do 6,9 za pomocą KOH)
<ul>
	<li>Przygotować 100 mL roztworu zapasu 0,5 M EGTA w wodzie destylowanej (dd water). Dostosować pH do 7,0 przy użyciu 2 M roztworu NaOH.</li>
	<li>Przygotować 100 mL roztworu zapasu 1 M MgCl2 w wodzie destylowanej (dd water). Roztwór poddać autoklawowaniu.</li>
	<li>Dodać 24,2 g PIPES i 3,1 g granulek KOH do około 800 mL wody destylowanej (dd water) i mieszać do rozpuszczenia. Dostosować pH do 6,9 przy użyciu 1 M roztworu KOH. Dodać 2 mL roztworu zapasu 0,5 M EGTA oraz 1 mL roztworu zapasu 1 M MgCl2. Dopełnić objętość do 1000 mL wodą destylowaną (dd water).</li>
	<li>Rozdzielić do probówek typu Falcon o pojemności 50 mL i zamrozić w temperaturze -20°C do późniejszego użycia. Probówka z BRB80 aktualnie używana może być przechowywana w temperaturze 4°C lub w temperaturze pokojowej.</li>
</ul>
2. Chlorek magnezu, MgCl2 (100 mM w wodzie dd)
<ul>
	<li>Rozcieńczyć w wodzie dd do uzyskania stężenia końcowego 100 mM.</li>
	<li>Rozdzielić na alikwoty (objętość 10 μL) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.</li>
</ul>
3. Guanozyno-5'-trifosforan, sól sodowa, GTP (25 mM w wodzie dd, pH skorygowane do 7 za pomocą NaOH)
<ul>
	<li>Odważyć i rozpuścić w wodzie dd, a następnie dostosować pH do 7 za pomocą 2 M roztworu NaOH.</li>
	<li>Zweryfikować stężenie, mierząc absorbancję UV przy 260 nm. (Należy przyjąć współczynnik ekstynkcji 11.7 x 103 M−1cm−1).</li>
	<li>Rozdzielić na alikwoty (objętość 10 μL) do probówek do mikrowirówki o pojemności 0.5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.</li>
</ul>
4. Dimetylosulfoksyd, DMSO
<ul>
	<li>Rozdzielić na alikwoty (objętość 10 μL) do probówek do mikrowirówki o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.</li>
</ul>
5. Taxol (1 mM w DMSO)
<ul>
	<li>Odważyć i rozpuścić w DMSO pod wyciągiem, aby uzyskać stężenie końcowe 1 mM.</li>
	<li>Rozdzielić na alikwoty (objętość 20 μL) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.</li>
</ul>
6. D-(+)-glukoza (2 M w wodzie dd)
<ul>
	<li>Odważyć i rozpuścić w wodzie dd, aby uzyskać stężenie końcowe 2 M.</li>
	<li>Rozdzielić na alikwoty (objętość 20 μL) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.</li>
</ul>
7. Oksydaza glukozowa, (2 mg/mL w BRB80)
<ul>
	<li>Rozpuścić w BRB80, aby uzyskać stężenie końcowe 2 mg/mL.</li>
	<li>Rozdzielić na alykwoy (objętość 20 μL) do probówek do mikrowirówki o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.</li>
</ul>
8. Ditiotreitol, DTT (1 M w wodzie dd)
<ul>
	<li>Rozpuścić w wodzie dd pod dygestorium, aby uzyskać stężenie końcowe 1 M.</li>
	<li>Rozdzielić na alikwoty (objętość 20 μL) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.</li>
</ul>
9. Katalaza, (0.8 mg/mL w BRB80)
<ul>
	<li>Rozpuścić w buforze BRB80 w co najmniej dwóch etapach, aby uzyskać stężenie końcowe 0.8 mg/mL. Określić stężenie na każdym etapie, mierząc absorbancję UV przy 276 nm i 406 nm (należy zastosować współczynnik ekstynkcji 3.1 x 105 M-1 cm-1 przy 276 nm oraz 2.2 x 105 M-1 cm-1 przy 406 nm oraz równanie A=cL).</li> 
<li>Rozdzielić na aliquoty (objętość 20 μL) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0.5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.</li>
</ul>
10. Adenozynotrifosforan, ATP (100 mM w 100mM MgCl2)
<ul>
<li>Przygotować roztwór zapasowy 100 mM MgCl2 w wodzie dd. Odważyć suchy proszek i rozpuścić go w tym roztworze zapasowym, aby uzyskać stężenie końcowe 100mM.</li>
<li>Zweryfikować stężenie, mierząc absorbancję UV przy 260 nm. (Przyjąć współczynnik ekstynkcji 15.4 x 103 M−1cm−1).</li>
<li>Rozdzielić na aliquoty (objętość 20 μL) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20°C do późniejszego użycia.</li>
</ul>
11. Roztwór kazeiny (20 mg/mL kazeiny w BRB80)
<ul>
<li>Do probówki typu Falcon o pojemności 50 mL dodać około 3 g kazeiny do 30 mL wody dd. Mieszać w vortexie przez około 1 godzinę, aż roztwór uzyska gęstą konsystencję.</li>
<li>Wirować przy około 15000 g przez 30 minut. Odfiltrować nadsącz przez filtry strzykawkowe 0,5 μm i 0,2 μm.</li>
<li>Wyznaczyć stężenie nadsączu, mierząc absorbancję UV przy 280 nm (przyjąć współczynnik ekstynkcji 0,67 mL mg-1 cm-1). Rozcieńczyć roztwór do stężenia 20 mg/mL w buforze BRB80.</li>
<li>Rozdzielić na alykwoaty (objętość 20 μL) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.</li>
</ul>
2.) Roztwory wzorcowe
Należy je przygotować w dniu przeprowadzenia eksperymentu i zutylizować po jego zakończeniu. Przygotować po 1 mL każdego z nich.
1. BRB80CS0.5
<ul>
	<li>Rozcieńczyć roztwór kazeiny w buforze BRB80 do stężenia końcowego 0,5 mg/mL i przechowywać w lodzie. Roztwór ten wprowadza się do komory przepływowej przed kinezyną, co pomaga zachować aktywność kinezyny po adsorpcji na powierzchni.</li>
</ul>
2. BRB80CA
<ul>
	<li>Przygotować kazeinę w stężeniu 0,2 mg/mL oraz ATP w stężeniu 1 mM w buforze BRB80 i przechowywać na lodzie. Kinezynę należy dodatkowo rozcieńczyć w tym roztworze przed wprowadzeniem do celi przepływowej.</li>
</ul>
3. BRB80T
<ul>
	<li>Rozcieńczyć roztwór taxolu w buforze BRB80 do stężenia końcowego 10 μM i przechowywać w temperaturze pokojowej. Roztwór ten służy do stabilizacji mikrotubul.</li>
</ul>
4. BRB80CT
<ul>
	<li>Przygotować 10 μM taxolu i 0,2 mg/mL kazeiny w buforze BRB80 i przechowywać w temperaturze pokojowej. Roztwory te służą do dalszego przygotowania roztworów antifade oraz mikrotubul.</li>
</ul>
5. BRB80AF
<ul>
	<li>Przygotować 20 mM D-glukozy, 20 μg/mL oksydazy glukozowej, 8 μg/mL katalazy, 10 mM DTT oraz 20 μM ATP w buforze BRB80CT i przechowywać w temperaturze pokojowej. Roztwór ten służy do rozcieńczania streptawidyny i nanokulek oraz do „wypłukania” nadmiaru streptawidyny z komory przepływowej. Prędkość kinezyny można kontrolować poprzez regulację stężenia ATP w tym roztworze.</li>
</ul>
3.) Przygotowanie kinezyny
<ul>
	<li>Wyrazić konstrukt kinezyny składający się z pełnowymiarowej kinezyny typu dzikiego Drosophila melanogaster (łańcuch ciężki) oraz His-tagu na końcu C w Escherichia coli, a następnie oczyścić go przy użyciu kolumny Ni-NTA zgodnie z opisem w 6.</li>> 
<li>Przygotować alikwoty (po 10 μL każda) w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL i przechowywać w temperaturze -80°C do późniejszego użycia. Stężenie aktywnej kinezyny w tych alikwotach wynosi około 200 nM.7</li>
	<li>W typowym eksperymencie rozcieńczyć roztwór kinezyny 20-krotnie w buforze BRB80CA. Oznaczyć roztwór jako KIN20 i przechowywać w lodzie.</li>
</ul>
4.) Przygotowanie mikrotubul
<ul>
	<li>W probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL przygotować 25 μL roztworu wzrostowego: 4 mM MgCl2, 1 mM GTP i 5% DMSO (v/v) w buforze BRB80.</li>
	<li>Dodać 6,25 μL tego roztworu do 20 μg liofilizowanej tubuliny biotynilowanej.</li>
	<li>Wymieszać w wortexie, a następnie inkubować w kąpieli wodnej w temperaturze 37°C przez 30 minut w celu polimeryzacji. Rozcieńczyć 100-krotnie w BRB80T i delikatnie wymieszać w wortexie. Oznaczyć roztwór jako MT100 i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 10-krotne rozcieńczenie MT100 w BRB80AF. Oznaczyć roztwór jako MT1000.</li>
</ul>
5.) Roztwór streptawidyny i nanokulek
Przygotować streptawidynę znakowaną AlexaFluor568 w stężeniu 100 nM w buforze BRB80AF. Oznaczyć ją jako STV100 i przechowywać w lodzie. W podobny sposób rozcieńczyć nanokulki 5000-krotnie w roztworze BRB80AF. Oznaczyć je jako NS5000 i przechowywać w lodzie.
6.) Konstrukcja komory przepływowej
Zbuduj komorę przepływową, używając dwóch szkiełek podstawkowych oddzielonych taśmą dwustronną. Komora ta ma około 2 cm długości, 1 cm szerokości i 100 μm wysokości, a jej objętość wynosi około 20 μL. Roztwory wprowadza się do komory przepływowej z jednej strony za pomocą pipety i odprowadza z drugiej strony przy użyciu papieru filtracyjnego.
7.) Montaż odwróconego układu testowego
Powierzchnię szklaną pokrywa się najpierw kazeiną, co pozwala kinezynie zachować funkcjonalność po adsorpcji. Po adsorpcji kinezyny wprowadza się mikrotubule, które są wiązane przez kinezynę. Następnie mikrotubule pokrywa się fluorescencyjną streptawidyną. Po wypłukaniu nadmiaru streptawidyny wprowadza się biotinylowane polistyrenowe nanokule fluoresceiny (średnica 40 nm). Zaadsorbowane na powierzchni stacjonarne nanokule zderzają się z poruszającymi się mikrotubulami i zostają na nich osadzone (Rycina 1).
Kolejność przepływu roztworów oraz czas oczekiwania przed wprowadzeniem następnego roztworu są wymienione poniżej.
<ul>
	<li>BRB80CS0.5, 5 minut</li>
	<li>KIN20, 5 minut</li>
	<li>MT1000, 5 minut</li>
	<li>STV100, 5 minut</li>
	<li>BRB80AF, 3x</li>
	<li>NS5000</li>
</ul>
8.) Mikroskopia
Kalcę przepływową zamocuj na stoliku mikroskopu natychmiast po wprowadzeniu nanokulek. W tym eksperymencie wykorzystano mikroskop fluorescencyjny Eclipse TE2000-U (Nikon, Melville, NY) wyposażony w obiektyw olejowy 100X (N.A. 1.45), lampę X-cite 120 (EXFO, Ontario, Canada) oraz kamerę iXon EMCCD (ANDOR, South Windsor, CT). Do obrazowania nanokulek i mikrotubul na dolnej powierzchni cel przepływowych odpowiednio użyto kostki filtrów FITC (#48001) i kostki filtrów TRITC (#48002, Chroma Technologies, Rockingham, VT). Czas ekspozycji wynosił 0.2s, natomiast czas między ekspozycjami wynosił 2 s.
<img src="/files/ftp_upload/2006/2006fig1.jpg" alt="Schemat wiązania nanokulek biotyna-streptawidyna na mikrotubuli w transporcie napędzanym przez kinezynę." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Schematyczny rysunek czółenek molekularnych.

<ol><li>Agarwal, A., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+motors+at+the+intersection+of+nanotechnology+and+polymer+science%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science.</a> Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).</li>
<li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).</li>
<li>Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond+curing+time+of+a+molecular+adhesive+causes+velocity-dependent+cargo-loading+of+molecular+shuttles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles.</a> Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).</li>
<li>Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+and+Transporting+DNA+Molecules+Using+Motor+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins.</a> Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).</li>
<li>Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+transport+of+nanocrystal+CdSe+quantum+dot+nanocomposites+using+microtubules+and+kinesin+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins.</a> Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).</li>
<li>Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+takes+one+8-nm+step+for+each+ATP+that+it+hydrolyzes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes.</a> J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).</li>
<li>Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+performance+of+protein-resisting+surfaces+at+ultra-low+protein+coverages+using+kinesin+motor+proteins+as+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes.</a> Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).</li>
<li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).</li>
<li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji protokół ten był z sukcesem stosowany przez różne grupy badawcze do przygotowywania testów motylości opartych na układzie kinezyna-mikrotubule. 10 mM DTT w końcowym roztworze do testu motylości można zastąpić 0,5% β-merkaptoetanolem. Nie należy używać standardowych roztworów (BRB80AF, KIN20 i MT1000), które zostały przygotowane ponad 2 godziny wcześniej. Jakichkolwiek roztworów zawierających taksol, a zwłaszcza mikrotubule, nie wolno umieszczać na lodzie. Nadmierna ekspozycja komor...

<table><tbody><tr><td>Adenozyno-5&amp;rsquo;-trifosforan (ATP)</td><td>Invitrogen</td><td>A1049</td><td></td></tr><tr><td>Biotynilowana tubulina</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>T333</td><td></td></tr><tr><td>Kazeina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0376</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-9322</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7528</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8779</td><td></td></tr><tr><td>Ditiontreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0610</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy-bis(2-amino&amp;#8211;etyloeter)-&lt;em&gt;N,N,N&amp;#8242;,N&amp;#8242;&lt;/em&gt;-kwas tetraoctowy (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>Biotynilowane mikrosfery FluoSpheres, 40 nm, fluorescencja żółto-zielona (505/515)</td><td>Invitrogen</td><td>F-8766</td><td></td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7016</td><td></td></tr><tr><td>Guanozyno-5&amp;rsquo;-trifosforan (GTP)</td><td>Roche Group</td><td>106399</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069</td><td></td></tr><tr><td>Paklitaksel (Taxol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1912</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 1,4-piperazynodietanosulfonowy, kwas piperazyno-1,4-bis(2-etanosulfonowy), kwas piperazyno-N,N&amp;#8242;-bis(2-etanosulfonowy) (PIPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6757</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>480878</td><td></td></tr><tr><td>Koniugat streptawidyny z Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>S11226</td><td></td></tr></tbody></table>

Ładowanie ładunku na molekularne wahadła napędzane kinezyną

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Komórki wykształciły zaawansowany aparat molekularny, taki jak białka motorowe kinezyny i filamenty mikrotubul, aby wspierać aktywny wewnątrzkomórkowy transport ładunku. Podczas gdy domena ogona kinezyn wiąże się z różnymi ładunkami, domeny głowy kinezyn wykorzystują energię chemiczną zmagazynowaną w cząsteczkach ATP do przemieszczania się wzdłuż sieci mikrotubul. Długie, sztywne mikrotubule służą jako szlaki dla transportu wewnątrzkomórkowego na duże odległości.
Silniki i filamenty te mogą być również wykorzystywane w mikrofabrykowanych środowiskach syntetycznych jako komponenty wahadłowych transporterów molekularnych 1. W często stosowanym projekcie silniki kinezynowe są zakotwiczone do powierzchni toru za pomocą swoich ogonów, a funkcjonalizowane mikrotubule służą jako elementy przenoszące ładunek, które są napędzane przez te silniki. Transportery te mogą być ładowane ładunkiem poprzez wykorzystanie silnego i selektywnego wiązania między biotyną a streptawidyną. Kluczowe komponenty (biotynilowana tubulina, streptawidyna i biotynilowany ładunek) są dostępne w sprzedaży.
Opierając się na klasycznym teście ruchliwości w układzie odwróconym 2, w niniejszym opracowaniu szczegółowo opisano konstrukcję wahadeł molekularnych. Białka motorowe kinezyny są adsorbowane na powierzchni uprzednio pokrytej kazeiną; mikrotubule są polimeryzowane z tubuliny biotynilowanej, przytwierdzane do kinezyny, a następnie pokrywane streptawidyną znakowaną rodaminą. Stężenie ATP utrzymuje się na poziomie poniżej nasycenia, aby uzyskać prędkość ślizgania mikrotubul optymalną dla ładowania ładunku 3. Na koniec, jako ładunek, dodaje się biotynilowane nanosfery znakowane fluoresceiną. Nanosfery przyłączają się do mikrotubul w wyniku kolizji między ślizgającymi się mikrotubulami a nanosferami przylegającymi do powierzchni.
Protokół ten można łatwo zmodyfikować, aby załadować różne ładunki, takie jak biotynilowane DNA4, kropki kwantowe 5 lub szeroką gamę antygenów za pomocą biotynilowanych przeciwciał 4-6.

Molekularne wahadła składające się z funkcjonalizowanych mikrotubul przesuwających się po przytwierdzonych do powierzchni białkach motorycznych kinezynach mogą służyć jako nanoskala system transportowy. W niniejszej pracy opisano montaż typowego systemu wahadłowego.

Komórki wykształciły zaawansowany aparat molekularny, taki jak białka motoryczne kinezyny i filamenty mikrotubularne, aby wspierać aktywny transport wewnątrzkomórkowy ...

Ogólnym celem tej procedury jest załadowanie nanokulek na mikrotubule, które przesuwają się po powierzchni pokrytej motorymi kinazy. Osiąga się to najpierw poprzez pokrycie powierzchni szklanej komory przepływowej roztworem kazeiny. Drugim krokiem procedury jest adsorpcja białek motorycznych kinezyny na powierzchni komory przepływowej.Trzecim krokiem procedury jest dodanie mikrotubul. Ostatnim etapem procedury jest dodanie cząsteczek streptawidyny, które zwiążą się z mikrotubulami, a następnie dodanie nanosfer. Nanosfery wiążą się z powierzchnią celi przepływowej, gdzie mogą zostać przechwycone przez mikrotubule.Ostatecznie, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej można zaobserwować, jak nanosfery są wychwytywane przez mikrotubule i transportowane po powierzchni. Cześć, nazywam się Elaine Jen Smith i reprezentuję laboratorium dr. Henry'ego Hessa oraz Katedrę Inżynierii Materiałowej na Uniwersytecie Florydy. Dzisiaj przedstawimy procedurę odwróconego testu motywności.W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania załadunku ładunku na mikrotubule oraz ruchu czółenek molekularnych. Przejdźmy zatem do pracy. Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować świeże roztwory zapasowe zgodnie z opisem zawartym w części pisemnej tego filmu.Po przygotowaniu roztworów zapasowych należy rozpocząć przygotowanie mikrotubul, pipetując 25 µL roztworu wzrostowego do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0,65 ml. Następnie dodać 6,25 µL roztworu wzrostowego do 20 µg liofilizowanej tubuliny biotynylowanej. Roztwór wymieszać w wirówce typu vortex i umieścić w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C na 30 minut w celu polimeryzacji; po inkubacji rozcieńczyć roztwór 100-krotnie w buforze Taxol i delikatnie wymieszać w wirówce typu vortex.Roztwór ten służy do stabilizacji mikrotubul. Oznacz roztwór jako MT 100 i przechowuj go w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj dziesięciokrotne rozcieńczenie MT 100 w buforze antyblaknącym i oznacz ten roztwór jako MT 1000.Następnie przygotować motory kinezyny, rozcieńczając 20-krotnie roztwór kinezyny w buforze TP. Roztwór oznakować jako kinezyna 20 i przechowywać w lodzie. Na koniec przygotować roztwory streptawidyny oraz nanosfer.Najpierw należy dodać streptawidynę znakowaną Alexa Fluor 5 6 8 do buforu Antifa, aby uzyskać stężenie 100 nano molars. Roztwór należy oznaczyć jako STV 100, a następnie nanosfery rozcieńczyć 5 000 krotnie w buforze Antifa i oznaczyć tę mieszaninę jako NS 5 000. Oba roztwory należy przechowywać w lodzie.Po przygotowaniu roztworów do testu ładowania ładunku, należy zbudować komorę przepływową, używając szkiełka podstawowego i szkiełka nakrywki oddzielonych taśmą dwustronną. Najpierw przyklej dwa paski taśmy dwustronnej na krawędziach szkiełka podstawowego, pozostawiając przerwę o szerokości około jednego centymetra między paskami. Następnie połóż szkiełko nakrywkę na taśmie.Naciśnij szkiełko nakrywkowe płaską krawędzią pęsety, aby stworzyć szczelne połączenie. Zbudowana komora przepływowa ma około dwóch centymetrów długości, jednego centymetra szerokości i 100 mikronów wysokości, a jej objętość wynosi około 20 µL. Aby rozpocząć montaż odwróconego układu analitycznego.Umieść końcówkę pipety pomiędzy szkiełkiem nakrywnym a podstawką. Następnie wstrzyknij do komory przepływowej roztwór kazeiny o stężeniu 0,5 mg/mL. Powłoka ta na ściankach komory przepływowej pozwoli kinesynie zachować funkcjonalność po absorpcji.Odczekaj pięć minut, aż roztwór kazeiny pokryje powierzchnię. Następnie zaabsorbuj kinezynę w komorze przepływowej, wprowadzając roztwór kinazy; roztwory wprowadza się do komór przepływowych, umieszczając końcówkę pipety pomiędzy szkiełkiem podstawowym a nakrywek. Następnie roztwór jest wstrzykiwany do komory przepływowej z jednej strony, podczas gdy jednocześnie jest on odciągany z drugiej strony.Za pomocą papieru filtracyjnego odczekaj pięć minut, aż kinazyna zostanie wchłonięta. Następnie wprowadź mikrotubule do komory przepływowej, pipetując do niej roztwór MT 1000. Odczekaj pięć minut, aby mikrotubule osiadły i przyczepiły się do motorów kinazyny po ich związaniu z motorami kinazyny.Pokryj mikrotubule fluorescencyjnym strep TTR, wprowadzając roztwór STV 100 do komory przepływowej. Odczekaj pięć minut, aby cząsteczki strep TTR związały się z mikrotubulami. Wypłucz nadmiar strep TTR, wprowadzając do komory przepływowej trzy porcje roztworu Antifa po 30 µL każda.Na koniec wprowadź biotynilowane nanokulki polistyrenowe z fluoresceiną, pipetując roztwór NS 5 000 do celi przepływowej. Powierzchnia absorbuje je stacjonarnie. Nanokulki będą zderzać się z poruszającymi się mikrotubulami i osadzać się na nich.W niniejszym doświadczeniu wykorzystano mikroskop fluorescencyjny eclipse TE 2000 U wyposażony w obiektyw imersyjny 100 x, system pozycjonowania X site, lampę one 20 oraz kamerę exon E-M-C-C-D. Najpierw nanieś jedną kroplę oleju imersyjnego na obiektyw. Następnie zamocuj celę przepływową na stoliku mikroskopu, korzystając z kostki filtrów trixy.Ustaw ostrość na mikrotubule, a następnie przełącz na kostkę filtra fitzy, aby zobrazować nanosfery. Następnie otwórz program and or I exon i ustaw tryb akwizycji na kinetyczny. Użyj czasu ekspozycji 0,5 seconds, długości serii kinetycznej 20 oraz czasu cyklu kinetycznego six seconds.Przełącz mikroskop z trybu obserwacji przez okular na tryb kamery i rozpocznij akwizycję obrazów. W przypadku pierwszych czterech obrazów użyj kostki trixi, aby zobrazować mikrotubule. W przypadku kolejnych 12 obrazów przełącz na kostkę filtra Fitz, aby uzyskać obrazy nanosfer.Następnie należy powrócić do kostki filtrów trixi. W przypadku ostatnich czterech obrazów służących do obrazowania mikrotubul, są one obserwowane przy użyciu kostki filtrów Trissy, a następnie kostka filtrów zostaje przełączona na fite. Aby zwizualizować tutaj nanosfery, nanosfery transportowane przez mikrotubule zostały oznaczone strzałkami. Nie wszystkie nanosfery zostały wychwycone przez mikrotubule.Następnie pokazano położenie nanosfer po 36 sekundach, co ujawnia, że uległy one przesunięciu. Po ponownym zobrazowaniu mikrotubul staje się jasne, że one również przemieściły się w polu widzenia. Obrazy te demonstrują, że nanosfery zostały przesunięte w wyniku transportu mikrotubularnego.Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić odwrócony test motyliczności. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zmianie kostek filtrów podczas pozyskiwania obrazów, tak aby widoczne były zarówno mikrotubule, jak i nanosfery. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

cargo-loading-onto-kinesin-powered-molecular-shuttles

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ładowanie ładunku na molekularne wahadłowce napędzane kinazyną

Podejście oparte na mikroskopii pojedynczych cząsteczek dostarczyło nowych informacji na temat transportu jądrowego.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w transporcie jądrowym

Wewnątrzkomórkowy transport ładunków, takich jak pęcherzyki czy organelle, odbywa się za pomocą molekularnych białek motorycznych, które śledzą na spolaryzowanych mikrotubulach. Protokół ten opisuje korelację kierunkowości transportu pojedynczych cząstek ładunku poruszających się wewnątrz neuronów, do względnej ilości i rodzaju związanych z nimi białek motorycznych.

Charakterystyka składu silników molekularnych na ruchomym ładunku aksonalnym za pomocą analizy "mapowania ładunku"

Tutaj prezentowany jest protokół identyfikacji ładunków Kinesin-1. Bezsilnikowy mutant ciężkiego łańcucha Kinesin-1 (KIF5B) agreguje się w cytoplazmie i indukuje agregację jej ładunków. Oba agregaty są wykrywane pod mikroskopią fluorescencyjną. Podobną strategię można zastosować do identyfikacji ładunków innych białek motorycznych.

Identyfikacja ładunków kinezyny-1 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Prezentujemy protokół budowy molekularnych wahadłowców, gdzie przylegające do powierzchni białka motoryczne kinezyny napędzają mikrotubule znakowane barwnikiem. Słabe oddziaływania kinezyn z powierzchnią umożliwiają ich odwracalne przywiązanie do niej. W ten sposób powstaje system w nanoskali, który wykazuje dynamiczny montaż i demontaż swoich elementów przy zachowaniu swojej funkcjonalności.

Montaż molekularnych wahadłowców zasilanych przez odwracalnie przyłączone kinezyny

Celem tego protokołu jest tworzenie zespołów silników molekularnych na nanostrukturach origami DNA i obserwowanie ruchliwości zespołu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem.

Produkcja zespołów motorycznych dyneiny i kinezyny na nanostrukturach DNA origami do obserwacji pojedynczych cząsteczek

Dwukierunkowa mitoza kinezyna-5 Cin8 gromadzi się w klastrach, które rozdzielają się i łączą podczas swojej ruchliwości. Akumulacja w gromadach zmienia również prędkość i kierunkowość Cin8. W tym miejscu opisano protokół oznaczania ruchliwości z oczyszczonym Cin8-GFP oraz analizy właściwości ruchliwych pojedynczych cząsteczek i klastrów Cin8.

Ruchliwość pojedynczych cząsteczek i klastrów dwukierunkowej kinezyny-5 Cin8 oczyszczonej z komórek S. cerevisiae

To badanie szczegółowo opisuje oczyszczanie KIF1A(1-393LZ), członka rodziny kinezyny-3, przy użyciu systemu ekspresji Sf9-bakulowirusa. Analiza in vitro pojedynczych cząsteczek i wielu silników ślizgowych tych oczyszczonych silników wykazała silne właściwości ruchliwości porównywalne z silnikami z lizatu komórkowego ssaków. W ten sposób system Sf9-bakulowirusa jest podatny na ekspresję i oczyszczanie białka motorycznego będącego przedmiotem zainteresowania.

Analiza pojedynczych cząsteczek oczyszczonych superprocesyjnych silników z rodziny Kinesin-3 Sf9

Opisano nowy system in vitro do jednoczesnego obciążania czterech ścięgien w hodowli.

Mechaniczne obciążanie ścięgna ex vivo

Wapń jest powszechnie występującym przekaźnikiem w układzie nerwowym, niezbędnym do wyzwalania uwalniania neuroprzekaźników oraz zmian w sile synaptycznej. W niniejszym materiale prezentujemy technikę wprowadzania wskaźników Ca2+ do zakończeń nerwowych Drosophila. Przedstawiamy również sposób wykonania niezbędnej aparatury i podkreślamy kwestie kluczowe dla sukcesu tej techniki.

Obciążanie zakończeń nerwowych Drosophila wskaźnikami wapnia

W niniejszej pracy raportujemy wytworzenie rekombinazy Tre za pomocą ukierunkowanej ewolucji molekularnej. Rekombinaza Tre rozpoznaje zdefiniowaną sekwencję docelową w obrębie sekwencji LTR prowirusa HIV-1, co prowadzi do wycięcia i całkowitego usunięcia prowirusa z zainfekowanych ludzkich komórek. Choć ukierunkowana ewolucja molekularna znajduje się wciąż w początkowej fazie rozwoju, pozwoli ona na tworzenie niestandardowych enzymów, które posłużą jako narzędzia chirurgii molekularnej i...

Ewolucja molekularna rekombinazy Tre

Poznaj metodę ładowania nanosfer na mikrotubule napędzane kinezyną w celu transportu nanoskalowego. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów molekularnych w biologii komórkowej i nanotechnologii.

Ładowanie ładunku na molekularne wahadła napędzane kinezyną

Przeglądaj więcej filmów