Name: Analiza całego genomu poziomów aminoacylacji (ładowania) tRNA przy użyciu mikromacierzy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj metodę analizy poziomów aminoacylacji tRNA w całym genomie Saccharomyces cerevisiae przy użyciu technologii mikromacierzy. Ta technika pozwala badać zmiany ładowania tRNA w odpowiedzi na stres komórkowy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Prace nad drożdżami w laboratorium Pana były finansowane z grantu przyznanego przez Ajinomoto, Inc. Japonia oraz z grantu szkoleniowego National Institutes of Health T32GM007183-33. Dziękujemy dr. Ronaldowi Wekowi ze School of Medicine Uniwersytetu w Indianie za długoletnią współpracę przy projektach dotyczących drożdży. Dziękujemy również dr Kimberly Dittmar za opracowanie metody mikroarray do badania ładowania tRNA.

Część 1: Izolacja całkowitego naładowanego tRNA
<ol>
<li>Odwirować komórki w wirówce laboratoryjnej przy 2000 RFC przez 5 minut. Odpowiednik 1 OD600 komórek powinien zapewnić co najmniej 1μg całkowitego RNA, a do przeprowadzenia procedury zaleca się minimum 30 μg.</li>
<li>Resuspender komórki w roztworze buforu do lizy składającego się z 0,3 M buforowanego octanu Na+ (pH 4,5) i 10 mM EDTA. Trzykrotnie mieszać na wortexie z równą objętością fenolu/chloroformu nasyconego octanem Na+ (pH 4,5), za każdym razem przez 30 s. Należy pamiętać, aby próbki zawsze przechowywać na lodzie pomiędzy etapami mieszania na wortexie. Buforowany octan można przygotować z NaOAC i HOAc, natomiast fenol/chloroform nasycony octanem można przygotować, mieszając 1 część 5 M buforowanego octanu (pH 4,5) z 9 częściami fenolu/chloroformu. 
 Uwaga: izolację całkowitego RNA przeprowadza się w łagodnych warunkach kwasowych i na lodzie, aby uniknąć deacylacji naładowanego tRNA.</li>
<li>Wirować przy 18 600 RFC przez 15 minut w temperaturze 4°C. Zebrać warstwę wodną i przeprowadzić kolejną ekstrakcję fenolem/chloroformem nasyconym octanem.</li>
<li>Po drugiej ekstrakcji wytrącić RNA, dodając 2,7x objętości etanolu i wirując przy 18 600 RFC przez 30 minut w temperaturze 4°C.</li>
<li>Resuspender osad RNA w roztworze buforu do lizy, a następnie ponownie wytrącić etanolem.</li>
<li>Na koniec resuspender RNA w roztworze zawierającym 10 mM buforowanego octanu (pH 4,5) i 1 mM EDTA w celu dalszej obróbki. Próbkę można stabilnie przechowywać w temperaturze -80°C przez około dwa tygodnie. Dłuższe przechowywanie nie jest zalecane, ponieważ część naładowanego tRNA zacznie ulegać deacylacji.</li>
</ol>
Część 2: Przygotowanie standardów tRNA
<ol>
 <li>Podgrzać standardy tRNA E. coli o stężeniu 10,5 μM do 85°C w 45 mM Tris-Cl pH 7,5 przez 2 minuty. Wyjąć probówkę i pozostawić w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.</li>
 <li>Dodać MgCl2 do stężenia końcowego 20 mM i inkubować w 37°C przez 5 minut.</li>
 <li>Dodać mieszaninę reakcyjną syntetazy tak, aby końcowa reakcja zawierała 5 μM tRNA, 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 12,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 3 mM ditiotreitol, 1,5 mM ATP, 1 mM sperminy, 1 mM odpowiedniego aminokwasu oraz 4,2 jednostki/μl mieszaniny aminoacylo-tRNA syntetazy E. coli. Inkubować w 37°C przez 15 minut.</li>
 <li>Dodać taką samą objętość 0,5 M buforu octanowego (pH 4,5) i przeprowadzić ekstrakcję fenolem/CHCl3 nasyconym octanem przy pH 4,5.</li>
 <li>Wytrącić standardy tRNA, dodając 2,7-krotność objętości etanolu, a następnie wirować przy 18 600 RFC przez 30 minut w 4°C.</li>
 <li>Resuspender standardy w 50 mM buforze octanowym (pH 4,5) z 1 mM EDTA i przechowywać w −80°C do jednego miesiąca.</li>
</ol>
Część 3: Znakowanie tRNA za pomocą Cy3/Cy5
<ol>
 <li>W przypadku próbki naładowanego tRNA inkubuj całkowite RNA o stężeniu 0,1 μg/μl z wzorcami tRNA z E. coli w stężeniu 0,066 μM każdego z nich (tj. 0,67 pmole każdego wzorca na μg całkowitego RNA) oraz w 100 mM buforze octanowym (pH 4,5) w obecności 50 mM NaIO4 przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Dla kontrolnej próbki całkowitego tRNA zamiast NaIO4 użyj 50 mM NaCl. Pamiętaj, aby RNA rozcieńczać wyłącznie roztworami buforowymi, aby zachować stopień naładowania.</li>
 <li>Aby zatrzymać reakcję, dodaj glukozę do stężenia 100 mM i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
 <li>W celu usunięcia pozostałego w próbce NaIO4 przeprowadź wymianę buforu za pomocą kolumny wirówkowej G25. Dla uzyskania najlepszych wyników najpierw zrównoważ kolumnę, przepuszczając przez nią 200 mM bufor octanowy (pH 4,5) przed nałożeniem próbki.</li>
 <li>Wytrąć próbkę, dodając bufor octanowy (pH 4,5) do końcowego stężenia 133 mM, NaCl do końcowego stężenia 66 mM oraz 2,7-krotność objętości etanolu. Czasami w przypadku próbek utlenionych może być koniejne drugie wytrącanie. Jest to niezbędne tylko wtedy, gdy osad wygląda znacząco inaczej niż osad kontrolny z tej samej próbki, na przykład jest znacznie większy lub bardziej rozproszony. Jeśli wymagane jest ponowne wytrącanie etanolem, przed dodaniem etanolu resuspenduj osad w 50 mM buforze octanowym pH 4,5 i 200 mM NaCl.</li>
 <li>W celu deacylacji próbki tRNA resuspenduj w 50 mM Tris-HCl (pH 9) i inkubuj w 37 °C przez 30 min. Reakcję neutralizuje się poprzez dodanie równiej objętości 50 mM buforu octanowego (pH 4,5) i 100 mM NaCl. Wytrąć za pomocą 2,7-krotności objętości etanolu. Po wytrąceniu RNA resuspenduj w wodzie do stężenia ~1 μg/μl. Zarówno próbki kontrolne, jak i utlenione, należy poddać elektroforezie na żelach agarozy w celu sprawdzenia jakości RNA.</li>
 <li>Aby przyłączyć fluorescencyjne tagi oligonukleotydowe do tRNA, 0,1 μg/μl deacylowanego RNA inkubuj w 1x buforze ligazy, 15% DMSO, 4 μM oligonukleotydach zawierających Cy3 lub Cy5, 0,5 jednostek/μl ligazy T4 DNA oraz egzofosfatazie drożdżowej (5 000 jednostek/μl) w 16°C przez noc (powyżej 16 h). Egzofosfataza jest niezbędna tylko dla próbek pochodzących z drożdży i może zostać pominięta, jeśli protokół jest stosowany dla próbek z E. coli lub próbek ludzkich.</li>
 <li>Po ligacji próbki mieszają się z 4 objętościami 50 mM KOAc (pH 7), 200 mM KCl, a następnie ekstrahuje się je równą objętością fenolu/chloroformu. Po oddzieleniu fazy wodnej preparaty RNA wytrąca się etanolem i resuspenduje w wodzie do stężenia około 0,1 μg/μl.</li>
 <li>Wydajność ligacji można ocenić, nakładając 5-10% próbek na 12% żele poliakrylamidowe zawierające 7M mocznika i wizualizując je za pomocą fluorescencyjnego skanera żeli. Analiza PAGE jest również przydatna do określenia ilości próbek utlenionych i kontrolnych niezbędnych do hybrydyzacji na mikroarrays. Dobry wynik ligacji powinien wykazywać, że ~10% lub więcej oligonukleotydów zawierających Cy3/Cy5 zostało przyłączonych do tRNA. Dla próbek o dobrej wydajności znakowania do hybrydyzacji na matrycy używa się 0,1-0,5 μg całkowitego RNA na próbkę.</li>
</ol>
Część 4: Hybrydyzacja i analiza mikromacierzy
<ol>
 <li>Przed hybrydyzacją preparaty mikroarray gotuje się w wodzie destylowanej przez 1-2 minuty, aby usunąć nieprzypisane oligonukleotydy.</li>
 <li>Próbki znakowane Cy3/Cy5 łączy się z 140 μl buforu do hybrydyzacji, DNA z plemni łososia do stężenia końcowego 140 μg/ml oraz poly(A) do stężenia końcowego 70 μg/ml.</li>
 <li>Program hybrydyzacji (tabela 1) przeprowadza się w automatycznym hybrydyzorze do macierzy. W przypadku pracy z tRNA zdecydowanie zaleca się stosowanie automatycznego urządzenia do hybrydyzacji, ponieważ hybrydyzacja ręczna powoduje wysoki poziom tła.</li>
 <li>Po zakończeniu programu preparaty należy ręcznie przemyć roztworem Wash 3 co najmniej dwukrotnie, delikatnie wstrząsając je w stożkowej probówce o pojemności 50 ml przez 3-5 minut.</li>
 <li>Preparaty można wysuszyć poprzez wirowanie z niską prędkością, poniżej 200 RFC, przez 5-10 minut. Ważne jest, aby przechowywać preparaty w ciemności, ponieważ ekspozycja na światło spowoduje blaknięcie fluoroforów.</li>
 <li>Po wysuszeniu preparaty należy niezwłocznie zeskanować, aby uzyskać optymalne wyniki; w razie potrzeby można je przechowywać przez kilka dni w suchym, ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej. Preparaty można skanować 2-3 razy bez zauważalnej degradacji jakości obrazu.</li>
</ol>
Część 5: Reprezentatywne wyniki
W przypadku prawidłowej izolacji próbka całkowitego RNA powinna wykazywać bardzo czyste widmo z ratio OD260:OD280 bliskim 2. Nie powinno być wykrywalnych zanieczyszczeń białkami ani fenolem. Podczas elektroforezy na 1% żelach agarozowych powinien być widoczny wyraźny prążek tRNA, a inne możliwe prążki kwasów nukleinowych mogą się różnić w zależności od organizmu. Po utlenianiu powinien być widoczny czysty prążek tRNA. Jeśli próbka jest wyraźnie słabsza od pozostałych lub obserwuje się rozmazanie (smearing), próbki nie należy wykorzystywać do mikromacierzy. Mikromacierze powinny charakteryzować się bardzo niskim tłem, o rząd wielkości niższym niż w przypadku najsłabszej sondy tRNA. Wysokie tło wynika zazwyczaj z problemów podczas etapów płukania. Można to zazwyczaj naprawić poprzez przygotowanie świeżych roztworów do płukania oraz dokładne umycie całego sprzętu i przewodów w celu usunięcia pozostałości i osadów SDS.
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Krok</td>
 <td>Szczegóły</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kondycjonowanie o-ringu</td>
 <td>75°C, 2 min</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wprowadzenie próbki</td>
 <td>60°C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Denaturacja próbki</td>
 <td>90°C, 5 min</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hybrydyzacja</td>
 <td>60°C, 16h</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Przemywanie 1</td>
 <td>50°C, przepływ 10s, utrzymanie 20s</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Przemywanie 2</td>
 <td>42°C, przepływ 10s, utrzymanie 20s</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Przemywanie 3</td>
 <td>42°C, przepływ 10s, utrzymanie 20s</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
Tabela 1: Protokół hybrydyzacji

<ol><li>Zaborske, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+tRNA+charging+and+activation+of+the+eIF2+kinase+Gcn2p%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p.</a> J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).</li>
<li>Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histidyl-tRNA+synthetase-related+sequence+in+the+eIF-2+alpha+protein+kinase+GCN2+interacts+with+tRNA+and+is+required+for+activation+in+response+to+starvation+for+different+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids.</a> Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).</li>
<li>Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+Regulation+of+GCN4+and+the+General+Amino+Acid+Control+of+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Translational Regulation of GCN4 and the General Amino Acid Control of Yeast.</a> Annual Review of Microbiology. 59 (1), 407-450 (2005).</li>
<li>Braeken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+horizons+for+%28p%29ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li>
<li>Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncharged+tRNA+Activates+GCN2+by+Displacing+the+Protein+Kinase+Moiety+from+a+Bipartite+tRNA-Binding+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Uncharged tRNA Activates GCN2 by Displacing the Protein Kinase Moiety from a Bipartite tRNA-Binding Domain.</a> Molecular Cell. 6 (2), 269-279 (2000).</li>
<li>Cashel, M. The Stringent Response. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCashel%2C+M+%22Escherichia+coli+and+Salmonella%3A+cellular+and+molecular+biology%22">Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology</a>. Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington DC. 1458-1496 (1996).</li>
<li>Dittmar, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li>
<li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+tRNA+abundance+and+alteration+of+tRNA+charging+by+bortezomib+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bortezomib in multiple myeloma.</a> Biochem Biophys Res Commun. 385 (2), 160-164 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiamy metodę jednoczesnego oznaczania względnych poziomów naładowania wszystkich tRNA w skali genomowej. Opisany tutaj protokół został zoptymalizowany dla S. cerevisiae i z sukcesem zastosowano go również do pomiaru profili naładowania tRNA w E. coli oraz w ludzkich kulturach komórkowych. Może on zostać zmodyfikowany w celu dostosowania do dowolnego organizmu o znanych sekwencjach genomu (umożliwiających adnotację wszystkich genów tRNA), pod warunkiem, że możliwe jest uzyskanie całkowitej frakcji naładowanego tRNA.

<table><tbody><tr><td>Kolumny Microspin G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>25-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Phe&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3143</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Tyr&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0258</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Lys&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6018</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; syntetazy aminoacylo-tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3646</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>70042X</td><td></td></tr><tr><td>PerfectHyb Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-7033</td><td></td></tr><tr><td>Stacja Hyb4</td><td>Digilab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skaner GenePix 4000B</td><td>Axon instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenePix 6.0</td><td>Axon instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza poziomu aminacylacji (ładowania) trna w skali całego genomu z wykorzystaniem mikromacierzy

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Poziomy aminoacylacji tRNA, czyli ich ładowania, mogą gwałtownie zmieniać się wewnątrz komórki w odpowiedzi na środowisko[1]. Zmiany w poziomach ładowania tRNA w komórkach prokariontowych i eukariontowych prowadzą do regulacji translacji, która jest głównym komórkowym mechanizmem odpowiedzi na stres. Znane przykłady to odpowiedź rygorystyczna (stringent response) wE. colior szlak odpowiedzi stresowej Gcn2 u drożdży ([2-6]). Niedawne prace wE. coliiS. cerevisiaewykazali, że wzorce ładowania tRNA są wysoce dynamiczne i zależą od rodzaju stresu, jakiego poddane są komórki [1, 6, 7]. Wysoce dynamiczny i zmienny charakter ładowania tRNA sprawia, że kluczowe jest określenie zmian w poziomach ładowania tRNA w skali genomowej, aby w pełni wyjaśnić odpowiedź komórkową na zmienność środowiskową. W niniejszym przeglądzie przedstawiamy metodę jednoczesnego pomiaru względnych poziomów ładowania wszystkich tRNA wS. cerevisiae Chociaż przedstawiony tutaj protokół dotyczy drożdży, został on z sukcesem zastosowany do wyznaczania względnych poziomów ładowania w szerokim zakresie organizmów, w tymE. colioraz hodowle ludzkich komórek[7, 8].

Opisujemy metodę analizy mikromacierzy służącą do określenia względnych poziomów aminoacylacji wszystkich tRNA z S. cerivisiae.

Analiza poziomu aminacylacji (ładowania) tRNA w skali całego genomu z wykorzystaniem mikromacierzy

Poziomy aminoacylacji tRNA, czyli ich ładowania, mogą gwałtownie zmieniać się w komórce w odpowiedzi na środowisko[1]. Zmiany poziomu ładowania tRNA w obu...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest określenie względnych zmian w poziomach ładowania tRNA. Osiąga się to poprzez izolację RNA przy niskim pH przed i po traktowaniu, aby wyizolować tRNA z zachowanymi poziomami ładowania. W drugim kroku RNA poddaje się utlenianiu nadjodynianem, co pozwala na oznaczenie względnych poziomów ładowania.Następnie próbki liguje się z fluorescencyjnym oligonukleotydem i hybrydyzuje na mikromacierzy, aby zmierzyć zmiany w poziomach ligacji wynikające z ładowania tRNA. Uzyskane wyniki przedstawiają zmiany genomowe w poziomie ładowania tRNA w komórkach CHO w oparciu o technologię mikromacierzy tRNA. Witam, jestem John Zai z laboratorium dr Pana w departamencie biochemii i biologii molekularnej na Uniwersytecie w Chicago.Dzisiaj zaprezentuję procedurę izolacji i pomiaru naładowania tRNA na poziomie genomicznym. Wykorzystujemy tę metodę w naszym laboratorium do pomiaru zmian w naładowaniu tRNA podczas ekspozycji na stresory. Zacznijmy zatem.Aby wyizolować całkowity ładunek tRNA, należy rozpocząć od wyhodowania równowartości minimum 30 OD 600 komórek drożdży, co powinno pozwolić na uzyskanie 30 µg całkowitego RNA; komórki należy zpelletować w wirówce stołowej. Następnie komórki resuspendować w buforze lizującym. Dodać równą objętość octanu sodu oraz nasyconego fenolo-chloroformu i mieszać w wstrząsarku wortex przez 30 sekund, a następnie inkubować w lodzie przez co najmniej 30 sekund.Powtórz mieszanie w wiru i rozdrabnianie jeszcze dwa razy. Odwiruj próbkę przy 18 600 RFC przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie usuń warstwę wodną i przeprowadź kolejną ekstrakcję fenylchloroformem nasyconym octanem po drugiej ekstrakcji.Wytrącić RNA poprzez dodanie 2,7 objętości etanolu i wirowanie przy 18 600 RFC przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Osady RNA ponownie zawiesić w roztworze buforu do lizy, a następnie po raz drugi wytrącić za pomocą etanolu. Na koniec RNA ponownie zawiesić w roztworze zawierającym 10 millimolar buforowanego octanu i jeden millimolar EDTA w celu dalszej obróbki.Próbkę można stabilnie przechowywać w temperaturze -80 °C przez około dwa tygodnie dłużej. Przechowywanie nie jest zalecane, ponieważ część naładowanego tRNA może zacząć ulegać deacylacji przed znakowaniem fluorescencyjnymi tagami oligonukleotydowymi S3 lub SCI five. Całkowity tRNA poddaje się utlenianiu periodynowemu, co umożliwia oznaczenie względnych poziomów naładowania; zmieszano całkowity RNA z 0,066 µM każdego standardu tRNA oraz 100 mM buforem octanowym w obecności 50 mM periodanianu sodu. Dla kontrolnej próbki tRNA, która nie będzie utleniana, należy użyć 50 mM chlorku sodu zamiast periodanianu sodu.Inkubować reakcje przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie zatrzymać reakcję poprzez dodanie glukozy do stężenia 100 millimolar i inkubację w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po zatrzymaniu reakcji przeprowadzić wymianę buforu przy użyciu kolumny wirówkowej G 25, aby usunąć z próbek pozostały pirofosforan sodu. Wytrącić próbki, dodając bufor octanowy do stężenia końcowego 133 millimolar, chlorek sodu do stężenia końcowego 66 millimolar oraz 2.7 x objętości etanolu.Następnie wyizoluj próbki tRNA metodą Resus, zawieszając je w 50 mM tris HCL i inkubując w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po 30 minutach zneutralizuj reakcję, dodając równą objętość 50 mM buforu octanowego i 100 mM chlorku sodu, a następnie wytrąć osad, dodając 2,7 objętości etanolu. Ponownie zawieś pellet RNA w wodzie w stężeniu około 1 µg/µL.Po sprawdzeniu jakości RNA w próbkach kontrolnych i utlenionych poprzez elektroforezę w żelach agarozowych, można przystąpić do znakowania fluorescencyjnego w celu przyłączenia fluorescencyjnych znaczników oligonukleotydowych do tRNA. Połączyć 0,1 µg/µL RNA z 4 µM SI3 lub SI5 zawierającym oligonukleotydy, buforem do ligazy, 15% DMSO, 0,5 U/µL ligazy DNA T4 oraz fosfatazą egz nukleazową z drożdży; inkubować w temperaturze 16 °C przez ponad 16 godzin. Po ligacji zmieszać próbki z czterokrotnością objętości octanu potasu i chlorku potasu, a następnie przeprowadzić ekstrakcję równą objętością fenolowo-chloroformową. Po wydzieleniu fazy wodnej wytrącić preparaty RNA za pomocą etanolu. Na koniec zawiesić osady RNA w wodzie do stężenia około 0,1 µg/µL przed hybrydyzacją; wypłukać szkiełka do mikromacierzy wodą destylowaną przez jedną do dwóch minut, aby usunąć niezwiązane oligonukleotydy.Następnie połączyć pięć oznakowanych próbek S3 lub SCI ze 140 microliters buforu do hybrydyzacji zawierającego DNA sperm salmon sperm do stężenia końcowego 140 micrograms per milliliter oraz poly A do stężenia końcowego seven D micrograms per milliliter, a następnie przeprowadzić program hybrydyzacji w automatycznym hybrydyzerze do macierzy. Do prac z TRNA zdecydowanie zalecamy stosowanie automatycznej maszyny do hybrydyzacji, ponieważ hybrydyzacja manualna generuje wysokie tło. Po zakończeniu programu hybrydyzacji ręcznie przemyć szkiełka roztworem wash three, delikatnie wstrząsając nimi w 50 milliliter probówce stożkowej przez trzy do pięciu minut.Przemyj preparaty co najmniej dwukrotnie w probówkach owiniętych folią aluminiową. Aby uzyskać optymalne wyniki, wysusz preparaty poprzez wirowanie z niską prędkością przez 5 do 10 minut. Preparaty należy zeskanować niezwłocznie po wysuszeniu.Preparaty mogą być skanowane od dwóch do trzech razy bez zauważalnego pogorszenia jakości obrazu; tutaj przedstawiono reprezentatywne wyniki prawidłowo wyizolowanej próbki całkowitego RNA oraz jej analizy. Próbka ta wykazuje bardzo czyste widmo z stosunkiem OD 260 do OD 280 bliskim 2, bez wykrywalnego zanieczyszczenia białkami lub fenolem podczas elektroforezy na 1% żelach agarozowych. Zarówno próbki utlenione, jak i kontrolne powinny wykazywać silny prążek RNA, przy czym inne możliwe prążki kwasów nukleinowych mogą różnić się w zależności od organizmu.Jeśli próbka jest wyraźnie słabsza od pozostałych lub zaobserwowano rozmazanie, próbki nie należy wykorzystywać do analiz mikroarray. Mikroarray powinny charakteryzować się bardzo niskim tłem, które jest o rząd wielkości niższe niż w przypadku najsłabszej sondy TRNA. Przed chwilą zaprezentowałem sposób izolacji i wyznaczania względnych poziomów naładowania TRNA podczas wykonywania tej procedury.Należy pamiętać o tym, aby odczynniki były wolne od nukleaz, szczególnie podczas etapów utleniania i rozcieńczania. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

genome-wide-analysis-aminoacylation-charging-levels-trna-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza na poziomie genomu poziomu acylacji aminokwasowej (ładowania) tRNA za pomocą mikrokaset

Analiza ekspresji genów bakteryjnych z wykorzystaniem mikromacierzy

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Źródło: Stenum, T. S. i in. Ilościowa ilościowa i ładująca poziomy transferowych RNA w Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2017)Ten film demonstruje zastosowanie elektroforezy żelowej i północnego blottingu do wykrywania i porównywania poziomów ładunku RNA transferowych w E. coli poprzez rozdzielenie form aminoacylowanych i deacylatowanych.

Elektroforeza żelowa i północne blotezowanie w celu wykrywania poziomów ładowania tRNA w E. coli

Rybosomy odgrywają kluczową rolę w syntezie białek. Frakcjonowanie polirybosomów (polisomów) za pomocą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy umożliwia bezpośrednie określenie wydajności translacji poszczególnych mRNA w skali całego genomu. Ponadto metoda ta może być stosowana do analizy biochemicznej czynników związanych z rybosomami i polisomami, takich jak białka opiekuńcze i cząsteczki sygnałowe.

Frakcjonowanie polisomów i analiza translatomiów ssaków w skali całego genomu

A przedstawiono protokół produkcji tRNA(UUU) i analizy tRNA(UUU) w kompleksie z enzymem TcdA za pomocą testów opóźniających działanie żelu agarozowego.

Testy opóźnienia w żelu agarozowym białko-tRNA do analizy funkcji TcdA N 6-treonylokarbamoiloloadenozyny

Tutaj prezentujemy metodę bezpośredniego pomiaru poziomów ładowania transferowego RNA z oczyszczonego RNA Escherichia coli, a także sposób porównywania względnych poziomów transferowego RNA, lub dowolnego innego krótkiego RNA, w różnych próbkach na podstawie dodania komórek impulsowych wyrażających gen odniesienia.

Kwantyfikacja liczebności i poziomów naładowania transferowych RNA w Escherichia coli

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Opisujemy oryginalną platformę do analizy transferowego RNA o nazwie SPOt (Streamlined Platform for Observing tRNA). SPOt jednocześnie mierzy poziomy komórkowe wszystkich tRNA w próbkach biologicznych, w zaledwie trzech krokach i w czasie krótszym niż 24 godziny.

Znakowanie metaboliczne i profilowanie transferowych RNA za pomocą płaszczek Macroarray

Tutaj opisujemy protokół charakterystyki biochemicznej enzymu modyfikującego RNA drożdży, Mod5, i omawiamy, jak ten protokół mógłby być zastosowany do innych enzymów modyfikujących RNA.

Test in vitro w celu wykrycia aktywności transferazy tRNA-izopentenylowej

Bezwzględna kwantyfikacja Sekwencjonowanie RNA (AQRNA-seq) to technologia opracowana do ilościowego określania krajobrazu wszystkich małych RNA w mieszaninach biologicznych. W tym miejscu zademonstrowano zarówno etapy przygotowania biblioteki, jak i przetwarzania danych AQRNA-seq, określając ilościowo zmiany w puli transferu RNA (tRNA) w Mycobacterium bovis BCG podczas spoczynku wywołanego głodem.

AQRNA-seq do ilościowego oznaczania małych RNA

Poznaj metodę analizy poziomów aminoacylacji tRNA w całym genomie Saccharomyces cerevisiae przy użyciu technologii mikromacierzy. Ta technika pozwala badać zmiany ładowania tRNA w odpowiedzi na stres komórkowy.

Analiza poziomu aminacylacji (ładowania) tRNA w skali całego genomu z wykorzystaniem mikromacierzy

Przeglądaj więcej filmów