Analiza poziomu aminacylacji (ładowania) tRNA w skali całego genomu z wykorzystaniem mikromacierzy

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest określenie względnych zmian w poziomach ładowania tRNA. Osiąga się to poprzez izolację RNA przy niskim pH przed i po traktowaniu, aby wyizolować tRNA z zachowanymi poziomami ładowania. W drugim kroku RNA poddaje się utlenianiu nadjodynianem, co pozwala na oznaczenie względnych poziomów ładowania.

Następnie próbki liguje się z fluorescencyjnym oligonukleotydem i hybrydyzuje na mikromacierzy, aby zmierzyć zmiany w poziomach ligacji wynikające z ładowania tRNA. Uzyskane wyniki przedstawiają zmiany genomowe w poziomie ładowania tRNA w komórkach CHO w oparciu o technologię mikromacierzy tRNA. Witam, jestem John Zai z laboratorium dr Pana w departamencie biochemii i biologii molekularnej na Uniwersytecie w Chicago.

Dzisiaj zaprezentuję procedurę izolacji i pomiaru naładowania tRNA na poziomie genomicznym. Wykorzystujemy tę metodę w naszym laboratorium do pomiaru zmian w naładowaniu tRNA podczas ekspozycji na stresory. Zacznijmy zatem.

Aby wyizolować całkowity ładunek tRNA, należy rozpocząć od wyhodowania równowartości minimum 30 OD 600 komórek drożdży, co powinno pozwolić na uzyskanie 30 µg całkowitego RNA; komórki należy zpelletować w wirówce stołowej. Następnie komórki resuspendować w buforze lizującym. Dodać równą objętość octanu sodu oraz nasyconego fenolo-chloroformu i mieszać w wstrząsarku wortex przez 30 sekund, a następnie inkubować w lodzie przez co najmniej 30 sekund.

Powtórz mieszanie w wiru i rozdrabnianie jeszcze dwa razy. Odwiruj próbkę przy 18 600 RFC przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie usuń warstwę wodną i przeprowadź kolejną ekstrakcję fenylchloroformem nasyconym octanem po drugiej ekstrakcji.

Wytrącić RNA poprzez dodanie 2,7 objętości etanolu i wirowanie przy 18 600 RFC przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Osady RNA ponownie zawiesić w roztworze buforu do lizy, a następnie po raz drugi wytrącić za pomocą etanolu. Na koniec RNA ponownie zawiesić w roztworze zawierającym 10 millimolar buforowanego octanu i jeden millimolar EDTA w celu dalszej obróbki.

Próbkę można stabilnie przechowywać w temperaturze -80 °C przez około dwa tygodnie dłużej. Przechowywanie nie jest zalecane, ponieważ część naładowanego tRNA może zacząć ulegać deacylacji przed znakowaniem fluorescencyjnymi tagami oligonukleotydowymi S3 lub SCI five. Całkowity tRNA poddaje się utlenianiu periodynowemu, co umożliwia oznaczenie względnych poziomów naładowania; zmieszano całkowity RNA z 0,066 µM każdego standardu tRNA oraz 100 mM buforem octanowym w obecności 50 mM periodanianu sodu. Dla kontrolnej próbki tRNA, która nie będzie utleniana, należy użyć 50 mM chlorku sodu zamiast periodanianu sodu.

Inkubować reakcje przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie zatrzymać reakcję poprzez dodanie glukozy do stężenia 100 millimolar i inkubację w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po zatrzymaniu reakcji przeprowadzić wymianę buforu przy użyciu kolumny wirówkowej G 25, aby usunąć z próbek pozostały pirofosforan sodu. Wytrącić próbki, dodając bufor octanowy do stężenia końcowego 133 millimolar, chlorek sodu do stężenia końcowego 66 millimolar oraz 2.7 x objętości etanolu.

Następnie wyizoluj próbki tRNA metodą Resus, zawieszając je w 50 mM tris HCL i inkubując w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po 30 minutach zneutralizuj reakcję, dodając równą objętość 50 mM buforu octanowego i 100 mM chlorku sodu, a następnie wytrąć osad, dodając 2,7 objętości etanolu. Ponownie zawieś pellet RNA w wodzie w stężeniu około 1 µg/µL.

Po sprawdzeniu jakości RNA w próbkach kontrolnych i utlenionych poprzez elektroforezę w żelach agarozowych, można przystąpić do znakowania fluorescencyjnego w celu przyłączenia fluorescencyjnych znaczników oligonukleotydowych do tRNA. Połączyć 0,1 µg/µL RNA z 4 µM SI3 lub SI5 zawierającym oligonukleotydy, buforem do ligazy, 15% DMSO, 0,5 U/µL ligazy DNA T4 oraz fosfatazą egz nukleazową z drożdży; inkubować w temperaturze 16 °C przez ponad 16 godzin. Po ligacji zmieszać próbki z czterokrotnością objętości octanu potasu i chlorku potasu, a następnie przeprowadzić ekstrakcję równą objętością fenolowo-chloroformową. Po wydzieleniu fazy wodnej wytrącić preparaty RNA za pomocą etanolu. Na koniec zawiesić osady RNA w wodzie do stężenia około 0,1 µg/µL przed hybrydyzacją; wypłukać szkiełka do mikromacierzy wodą destylowaną przez jedną do dwóch minut, aby usunąć niezwiązane oligonukleotydy.

Następnie połączyć pięć oznakowanych próbek S3 lub SCI ze 140 microliters buforu do hybrydyzacji zawierającego DNA sperm salmon sperm do stężenia końcowego 140 micrograms per milliliter oraz poly A do stężenia końcowego seven D micrograms per milliliter, a następnie przeprowadzić program hybrydyzacji w automatycznym hybrydyzerze do macierzy. Do prac z TRNA zdecydowanie zalecamy stosowanie automatycznej maszyny do hybrydyzacji, ponieważ hybrydyzacja manualna generuje wysokie tło. Po zakończeniu programu hybrydyzacji ręcznie przemyć szkiełka roztworem wash three, delikatnie wstrząsając nimi w 50 milliliter probówce stożkowej przez trzy do pięciu minut.

Przemyj preparaty co najmniej dwukrotnie w probówkach owiniętych folią aluminiową. Aby uzyskać optymalne wyniki, wysusz preparaty poprzez wirowanie z niską prędkością przez 5 do 10 minut. Preparaty należy zeskanować niezwłocznie po wysuszeniu.

Preparaty mogą być skanowane od dwóch do trzech razy bez zauważalnego pogorszenia jakości obrazu; tutaj przedstawiono reprezentatywne wyniki prawidłowo wyizolowanej próbki całkowitego RNA oraz jej analizy. Próbka ta wykazuje bardzo czyste widmo z stosunkiem OD 260 do OD 280 bliskim 2, bez wykrywalnego zanieczyszczenia białkami lub fenolem podczas elektroforezy na 1% żelach agarozowych. Zarówno próbki utlenione, jak i kontrolne powinny wykazywać silny prążek RNA, przy czym inne możliwe prążki kwasów nukleinowych mogą różnić się w zależności od organizmu.

Jeśli próbka jest wyraźnie słabsza od pozostałych lub zaobserwowano rozmazanie, próbki nie należy wykorzystywać do analiz mikroarray. Mikroarray powinny charakteryzować się bardzo niskim tłem, które jest o rząd wielkości niższe niż w przypadku najsłabszej sondy TRNA. Przed chwilą zaprezentowałem sposób izolacji i wyznaczania względnych poziomów naładowania TRNA podczas wykonywania tej procedury.

Należy pamiętać o tym, aby odczynniki były wolne od nukleaz, szczególnie podczas etapów utleniania i rozcieńczania. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.