Mikrodysekcja laserowa neuronów obwodowych Drosophila

Mikrosekcja laserowa (laser capture MICRODISSECTION, LCM) stała się niezwykle potężnym narzędziem, które umożliwia izolowanie specyficznych typów komórek z przekrojów tkankowych z wysoką rozdzielczością przestrzenną i dokładnością. W niniejszej procedurze LCM jest wykorzystywane do wysekcjonowania neuronów obwodowych z larw oph w trzecim stadium rozwojowym. Larwy w trzecim stadium rozwojowym są osadzane w formie do krioembeddingu i mrożone, a następnie przy użyciu kriotomu wykonuje się seryjne przekroje tkankowe, które nanosi się na szkiełka przedmiotowe, rozmraża i utrwala w 70% ethanol.

Następnie preparaty na szkiełkach inkubuje się z trypsyną w celu usunięcia pozostałości kutykuli larwalnej, a następnie poddaje odwodnieniu przy użyciu gradientu etanolu i przejaśnianiu ksylenem. W kolejnym kroku na przekrój tkanki nakłada się nakładkę LCM, a następnie za pomocą laserowego pulsowania wycina się wybrane fluorescencyjne komórki neuronów. Na koniec z wyizolowanych komórek izoluje się RNA do dalszych zastosowań, takich jak ilościowa R-T-P-C-R lub analizy mikromacierzy.

Cześć, jestem Dan Cox z Departamentu Biologii Molekularnej i Mikrobiologii oraz Instytutu Studiów Zaawansowanych Krasnow na George Mason University. Cześć, jestem Ish AER z laboratorium dr. Dana Coxa. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę izolacji komórek i oczyszczania RNA z pojedynczych lub wielu obwodowych neuronów drozydrosophila z wykorzystaniem laserowej mikrodysekcji przechwytującej.

Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu zbadania mechanizmów molekularnych pośredniczących w morfogenezie tempa DIN specyficznego dla danej klasy. Zatem zacznijmy. Wszystkie procedury przedstawione w tym filmie są przeprowadzane w ściśle wolnych od RNazy warunkach, zgodnie ze standardowymi procedurami.

Protokół należy rozpocząć od zebrania od 30 do 40 starszych larw trzeciego stadium rozwoju. Larwy należy przemyć wodą podwójnie destylowaną.

Krótko wypłucz, aby usunąć RNA, a następnie przemyj jeszcze raz wodą dwukrotnie destylowaną. Aby całkowicie usunąć RNA, użyj czystej chusteczki Kimwipe i dokładnie odsącz nadmiar wody. Następnie weź czystą formę do zatapiania tkanek i dodaj cienką warstwę OCT.

Umieść formę na bloku lodu, aby schłodzić ją do 0 °C. Za pomocą pęsety umieść w niej oczyszczone larwy oraz zimny OCT. Niska temperatura OCT pomoże ograniczyć ruchy larw.

Podczas procesu zatapiania ułóż larwy równolegle do siebie. Po ułożeniu larw powoli wypełnij formę OCT, nie naruszając ich położenia. Następnie gwałtownie schłodź.

Zamroź formę, kładąc ją na suchego lodu. Zapewni to ułożenie larwy w jednej płaszczyźnie, co zmaksymalizuje liczbę komórek dostępnych w każdym przekroju. Użyj kriostatu.

Wyciąć mrożone sekcje o grubości od 5 do 8 µm na zwykłych, opisanych, nieładowanych szkiełkach mikroskopowych wolnych od RNaz. Przechowywać szkiełka na suchym lodzie, a następnie przenieść je do temperatury -80 °C do momentu rozpoczęcia mikrodysekcji. Wszystkie roztwory do dehydratacji muszą być przygotowane na świeżo przed każdą sesją LCM.

Całkowite odwodnienie zamrożonych sekcji tkanek larwalnych jest niezbędne do osiągnięcia optymalnej wydajności mikrodysekcji. Wyjmijt slajdy zawierające zamrożone sekcje tkanek larwalnych z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieść je na suchym lodzie. Wyjmij pojedynczy slajd z kasetki i natychmiast umieść go w 50 mL probówce stożkowej wypełnionej 70% etanolem na okres od 3 do 10 sekund.

Następnie wypłucz preparat w 50 mililitrowej probówce stożkowej wypełnionej wolną od RNA dwukrotnie destylowaną wodą przez 5 do 10 sekund, aby usunąć kutykulę z przekrojów tkanek, która mogłaby zakłócać przechwytywanie metodą LCM. Ostrożnie nanieś pipetą 50 mikrolitrów 2,5% trypsyny bezpośrednio na przekrój tkanki i inkubuj przez 5 do 30 sekund w temperaturze pokojowej, po czym krótko wypłucz przekroje w 50 mililitrowej probówce stożkowej zawierającej wolną od RNA dwukrotnie destylowaną wodę, aby usunąć trypsynę oraz wszelkie luźno przylegające fragmenty kutykuli. Zakończ proces odwadniania, zanurzając preparaty kolejno w następujących roztworach.

70% etanol, 95% etanol, 100% etanol, 100% etanol, 100% ksylen. I na koniec, jeszcze raz w 100% ksylenie. Po odwodnieniu całkowicie wysusz preparaty pod łagodnym strumieniem powietrza przez 60 do 120 sekund w temperaturze pokojowej.

Jeśli to możliwe, przeprowadź mikrodyssekcję w pomieszczeniu z kontrolowaną wilgotnością, aby zapobiec spadkowi wydajności spowodowanemu zwiększoną wilgotnością. Najpierw włącz zasilanie mikroskopu i sterownika lasera. Załaduj do uchwytu na nakrętki nakrętki H-S-L-C-M.

Każda nakładka jest w stanie pochwycić liczne ciała komórkowe. Następnie należy uruchomić oprogramowanie Molecular Devices i wprowadzić szczegóły eksperymentu, w tym numer preparatu oraz numer partii nakładek. Umieść preparat z przekrojami tkanki larwalnej na stoliku mikroskopu do mikrodysekcji.

Załaduj nową nakładkę HS LCM z kasety na instrument P cell two ELCM i ustaw ją prawidłowo względem dżojstika, aby zapewnić właściwe pozycjonowanie nakładki w odniesieniu do obszaru przechwytywania; zlokalizuj komórki znakowane fluorescencyjnie w transgenicznych liniach reporterowych PPK GAL four U-A-S-M-C-D eight GFP lub 21 7 G four UASM CD eight GFP. Neurony arboryzacji dendrytycznej (DA) obwodowego układu nerwowego można łatwo zidentyfikować dzięki fluorescencji GFP. Aby zmaksymalizować swoistość, wybieraj komórki o silnym sygnale fluorescencyjnym i minimalnym nakładaniu się komórek.

Następnie należy dostosować parametry mocy i czasu trwania impulsu laserowego, aby uzyskać precyzyjny punkt stopienia polimeru, którego rozmiar odpowiada wybranej wielkości plamki laserowej do mikrodysekcji pojedynczych neuronów klasy DA. Zaleca się następujące ustawienia: średnica plamki 7,5 micrometers, moc lasera od 30 do 50 milliwatts, czas trwania impulsu od dwóch do czterech milliseconds oraz od jednego do dwóch strzałów na komórkę.

Ustawienia lasera mogą się różnić w zależności od rodzaju tkanki, jej grubości oraz rodzaju zastosowanej nakładki LCM. Ostatecznie ustawienia lasera wymagają testów empirycznych w celu uzyskania optymalnych wyników pobierania. Następnie poddaj tkankę procedurze LCM.

Podczas LCM nakładka jest umieszczana nad obszarem zainteresowania, a następnie kierowany jest przez nią impuls podczerwonego lasera o niskiej mocy na cienką termolabilną folię polimerową znajdującą się nad wybraną komórką lub komórkami. W momencie impulsu laserowego folia mięknie, przylega do docelowych komórek, a następnie ponownie twardnieje, przejmując przytwierdzone do niej komórki zainteresowania.

Po podniesieniu nakładki z przekroju tkanki, pojedyncza komórka lub grupa komórek zostają mikro wycięte z otaczającej tkanki; proces ten powtarza się w nowym polu, aby zebrać więcej komórek. Po zebraniu interesujących nas komórek należy podnieść nakładkę LCM i umieścić ją na czystym szkiełku, aby potwierdzić obecność pobranych komórek oraz brak niepożądanych komórek lub zanieczyszczeń. Należy wykonać obrazowanie nakładki HS LCM z wykorzystaniem fluorescencji oraz oświetlenia w świetle przechodzącym.

Przymocuj zakrętkę zawierającą mikro-disekcyjne komórki do urządzenia do ekstrakcji. Następnie dodaj 12 µL buforu do ekstrakcji RNA na powierzchnię zakrętki i podłącz odwróconą, cienkościenną probówkę reakcyjną, jak pokazano tutaj. Umieść cały zestaw na tacy wyrównawczej i przykryj go podgrzanym blokiem inkubacyjnym.

Następnie umieść taczkę w inkubatorze w temperaturze 42 °C na 30 minut, po czym przeprowadź inkubację i wirowanie. Wirowanie probówek zawierających ekstrakty należy przeprowadzić przy 800 ×g przez dwie minuty. Po wyjęciu probówek z wirówki należy je zamknąć i przechowywać ekstrakty komórkowe w temperaturze -80 °C do momentu oczyszczania RNA metodą kolumnową.

Zgodnie z instrukcją zestawu do ekstrakcji RNA pico pure, traktowanie DNA jest opcjonalne i może być przeprowadzone na kolumnie podczas oczyszczania RNA w razie potrzeby. Po oczyszczeniu RNA należy przechowywać je w temperaturze -80 °C. Do izolacji pojedynczych, specyficznych dla klasy lub wielu neuronów dopaminergicznych (DA) muszki *Drosophila* z larw trzeciego stadium rozwojowego wykorzystano laserową mikrosekcję sterowaną (LCM).

LCM umożliwia wysoki stopień precyzji i specyficzności w izolacji ciał komórkowych neuronów D muchówki drosophila. Przedstawiony tutaj reprezentatywny obraz obrazuje odwodniony i potraktowany trypsyną przekrój tkanki o grubości ośmiu mikronów. Przed przeprowadzeniem LCM dwa neurony DA klasy czwartej zostają znakowane GFP.

Grot strzałki wskazuje neuron wybrany do przechwycenia. Ciało komórkowe zaznaczonego neuronu zostaje precyzyjnie wyizolowane metodą mikrodyssekcji z wysoką specyficznością z przekroju tkanki. Na obrazie widoczny jest widok z góry pojedynczego neuronu DA klasy czwartej przechwyconego na nakładkę LCM.

Ustalono, że całkowite RNA oczyszczone z izolowanych neuronów DA jest doskonałej jakości, co potwierdzono obecnością ostrych piku rRNA 5,8 S i 28 S podczas analizy na bioanalizatorze Agilent 2100. W celu oceny specyficznego wzbogacenia izolowanych komórek w neurony przeprowadzono ilościową RT-PCR w czasie rzeczywistym dla specyficznego markera neuronalnego Lev, stosując metodę delta delta CT. W neuronach DA pobranych metodą LCM zaobserwowano ponad 2,5-krotny wzrost poziomu Lev w stosunku do całego organizmu.

Właśnie pokazaliśmy, jak izolować i oczyszczać RNA z neuronów w węzłach lub neuronów obwodowych za pomocą laserowej mikrodysekcji. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zoptymalizowanie stężenia trypsyny oraz czasu trawienia w zależności od tkanki poddawanej mikrodysekcji oraz grubości skrawka. Dłuższy czas inkubacji może prowadzić do utraty komórek docelowych ze skrawków tkanek, natomiast zbyt krótki czas inkubacji może być niewystarczający do usunięcia kutykuli larwy, co skutkuje nieefektywną mikrodysekcją laserową.

Ważne jest, aby wszystkie roztwory do dehydratacji tkanek były świeżo przygotowane. Ponadto, aby zapobiec uszkodzeniu polimeru osłonki LCM, ksylen musi zostać całkowicie odparowany przed przeprowadzeniem LCM. Wreszcie, w celu zachowania integralności RNA w oczyszczonych komórkach, niezbędne jest utrzymanie warunków wstępnych dla RNA przez cały czas trwania procedury.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.