Name: Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji neuronów obwodowych Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Poznaj metodę laserowej mikrodysekcji do izolacji neuronów obwodowych Drosophila z larw trzeciego stadium. Technika ta umożliwia precyzyjne pozyskanie RNA do analiz ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr. Yuh-Nung Janowi oraz dr. Wesowi Grueberowi za udostępnienie szczepów muszek wykorzystanych w niniejszym badaniu, a także Virginii Espinie, dr. Emanuelowi Petricoinowi i dr. Lance'owi Liottie za pomoc w przeprowadzeniu LCM. Autorzy dziękują Thomas F. and Kate Miller Jeffress Memorial Trust za wsparcie niniejszych badań (D.N.C.) oraz Biuru Prorektora George Mason University (E.P.R.I.).

<ol><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+establishment%2C+maintenance%2C+and+remodeling+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li>
<li>Wang, X., Starz-Gaiano, M., Bridges, T., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+populations+from+Drosophila+tissues+by+magnetic+bead+sorting%2C+for+use+in+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell populations from Drosophila tissues by magnetic bead sorting, for use in gene expression profiling.</a> Nature Protocols. , (2008).</li>
<li>Iyer, E. P. R., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+Drosophila+peripheral+neurons+by+magnetic+bead+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of Drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting.</a> J Vis Exp. 34, 2912-2917 (2004).</li>
<li>Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A., Tirouvanziam, R., Tirouvanziam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-activated+cell+sorting+%28FACS%29+of+Drosophila+hemocytes+reveals+important+functional+similarities+to+mammalian+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2912-2917 (2004).</li>
<li>Shigenobu, S., Arita, K., Kitadate, Y., Noda, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+germline+cells+from+Drosophila+embryos+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Isolation of germline cells from Drosophila embryos by flow cytometry.</a> Dev. Growth Differ. 48, 49-57 (2006).</li>
<li>Reeves, N., Posakony, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+programs+activated+by+proneural+proteins+in+the+developing+Drosophila+PNS%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic programs activated by proneural proteins in the developing Drosophila PNS.</a> Dev. Cell. 8, 413-425 (2005).</li>
<li>Jinushi-Nakao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knot%2FCollier+and+Cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knot/Collier and Cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56, 963-978 (2007).</li>
<li>Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mRNA+from+specific+tissues+of+Drosophila+by+mRNA+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging.</a> Nucl. Acids Res. 33, (2005).</li>
<li>Appay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+Gene+Expression+Profiling+of+Human+T+Cell+Subsets+Reveals+Parallel+Post-Thymic+Differentiation+for+CD4%2B+and+CD8%2B+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sensitive Gene Expression Profiling of Human T Cell Subsets Reveals Parallel Post-Thymic Differentiation for CD4+ and CD8+ Lineages.</a> J. Immunol. 179, 7406-7414 (2007).</li>
<li>Ginzinger, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+quantification+using+real-time+quantitative+PCR%3A+An+emerging+technology+hits+the+mainstream%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream.</a> Exp. Hematol. 30, 503-512 (2002).</li>
<li>Keays, K. M., Owens, G. P., Ritchie, A. M., Gilden, D. H., Burgoon, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+and+single-cell+RT-PCR+without+RNA+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection and single-cell RT-PCR without RNA purification.</a> J. Immunol. Methods. 302, 90-98 (2005).</li>
<li>Volgin, D. V., Swan, J., Kubin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RT-PCR+gene+expression+profiling+of+acutely+dissociated+and+immunocytochemically+identified+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell RT-PCR gene expression profiling of acutely dissociated and immunocytochemically identified central neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 136, 229-236 (2004).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li>
<li>Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+in+embryonic+mouse+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling in embryonic mouse lenses.</a> Mol. Vis. 12, 1692-1698 (2006).</li>
<li>Scharschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+osteoarthritic+connective+tissue+by+laser+capture+microdissection+and+QRT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Connect.+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of human osteoarthritic connective tissue by laser capture microdissection and QRT-PCR.</a> Connect. Tissue Res. 48, 316-323 (2007).</li>
<li>Spletter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regulates+Drosophila+olfactory+projection+neuron+identity+and+targeting+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">regulates Drosophila olfactory projection neuron identity and targeting specificity.</a> Neural Dev. 2, 14-14 (2007).</li>
<li>Hoopfer, E. D., Penton, A., Watts, R. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+Drosophila+neuronal+remodeling%3A+a+role+for+the+RNA-binding+protein+Boule+as+a+negative+regulator+of+axon+pruning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of Drosophila neuronal remodeling: a role for the RNA-binding protein Boule as a negative regulator of axon pruning.</a> J. Neurosci. 28, 6092-6103 (2008).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 5199-5204 (2007).</li>
<li>Espina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prot%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje naszą zoptymalizowaną metodę izolacji neuronów obwodowych Drosophila za pomocą LCM. Choć ten protokół LCM został opracowany do specyficznej izolacji pojedynczych, klasowo specyficznych lub wielu neuronów da Drosophila z trzeciego stadium larwalnego rozwoju, niewielkie modyfikacje procedury mogą zostać łatwo dostosowane do pobierania innych typów komórek Drosophila ze wszystkich etapów rozwoju, przy użyciu odrębnych transgenów raportujących GAL4,UAS-mCD8-...

<table><tbody><tr><td>10X roztwór soli fosforanowo-buforowanej (PBS)</td><td>MP Biomedicals</td><td>PBS10X02</td><td>Rozcieńczony do 1X roztworu roboczego</td></tr><tr><td>2,5% trypsyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>RNase-AWAY</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83931</td><td></td></tr><tr><td>Ksyleny, stopień histologiczny</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td></td></tr><tr><td>woda wolna od RNaz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP561-1</td><td></td></tr><tr><td>związek OCT (Optimal Cutting Temperature)</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji RNA PicoPure</td><td>Molecular Devices</td><td>KIT0204</td><td>Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta&amp;rsquo;instrukcje</td></tr><tr><td>Cienkościenna probówka reakcyjna z kopułkową zakrętką</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8010611</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do ekstrakcji próbek ExtracSure</td><td>Molecular Devices</td><td>LCM 0208</td><td></td></tr><tr><td>Blok inkubacyjny do ekstrakcji próbek z kapsułek CapSure HS</td><td>Molecular Devices</td><td>LCM0505</td><td></td></tr><tr><td>Kasetka do pozycjonowania nakładek CapSure HS LCM oraz urządzeń do ekstrakcji próbek ExtracSure</td><td>Molecular Devices</td><td>LCM0504</td><td></td></tr><tr><td>nakrętki CapSure HS LCM</td><td>Molecular Devices</td><td>LCM0213</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka przedmiotowe 75x100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>Formy do zatapiania tkanek</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9642669</td><td></td></tr><tr><td>Tłuczek polipropylenowy do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1415-5390</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol; 95% etanol; 100% etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suchy lód</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Sprzęt:&lt;/p&gt;&lt;ul&gt;&lt;li&gt;Kriostat&lt;/li&gt;&lt;li&gt;probówka stożkowa 50 ml do utrwalania preparatów, płukania, traktowania trypsyną oraz odwadniania etanolem/ksylolem&lt;/li&gt;&lt;li&gt;-80&amp;#x00B0;zamrażarka do niskich temperatur&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Inkubator&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Urządzenie do mikromanipulacji laserowej PixCell IIe z optyką epifluorescencyjną Fluor 300 zoptymalizowaną pod kątem EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices)&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

mikrodysekcja laserowa neuronów obwodowych drosophila

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Neurony arboryzacji dendrytycznej (da) obwodowego układu nerwowego (PNS) Drosophila stanowią doskonały system modelowy do badania molekularnych mechanizmów leżących u podstaw specyficznej dla danej klasy morfogenezy dendrytów1,2. Aby umożliwić analizy molekularne rozwoju neuronów da specyficznych dla danej klasy, kluczowe jest uzyskanie tych komórek w postaci czystej populacji. Choć dla komórek Drosophila istnieje szereg różnych technik izolacji RNA specyficznych dla komórek i tkanek, w tym oczyszczanie komórek z użyciem kulek magnetycznych3,4, sortowanie komórek metodą FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting)5-8 oraz strategie oparte na białkach wiążących RNA9, żadna z tych metod nie może być łatwo wykorzystana do izolacji pojedynczych lub wielu neuronów da Drosophila specyficznych dla danej klasy z wysoką precyzją przestrzenną. Mikrodysekcja sterowana laserem (LCM) okazała się niezwykle potężnym narzędziem, które można wykorzystać do izolowania specyficznych typów komórek z przekrojów tkanek z wysoką rozdzielczością i dokładnością przestrzenną. RNA uzyskane z izolowanych komórek może być następnie wykorzystane do analiz, w tym qRT-PCR i profilowania ekspresji za pomocą mikromacierzy w obrębie danego typu komórek10-16. Do tej pory LCM nie było szeroko stosowane w analizie tkanek i komórek Drosophila17,18, w tym neuronów da w trzecim stadium larwalnym rozwoju. 
W niniejszej pracy przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolacji neuronów da Drosophila z wykorzystaniem podczerwonego (IR) rodzaju LCM. Metoda ta umożliwia wychwyt pojedynczych, specyficznych dla danej klasy lub wielu neuronów da z wysoką specyficznością i rozdzielczością przestrzenną. W eksperymentach wykorzystano larwy trzeciego stadium o tym samym wieku, wykazujące ekspresję transgenu UAS-mCD8::GFP19 pod kontrolą specyficznego dla klasy IV neuronów da drivera ppk-GAL420 lub pan-neuronowego drivera 21-7-GAL421. RNA uzyskane z izolowanych neuronów da charakteryzuje się bardzo wysoką jakością i może być bezpośrednio wykorzystane w dalszych analizach, w tym w qRT-PCR lub analizach mikromacierzy. Co więcej, niniejszy protokół LCM można łatwo dostosować do wychwytu innych typów komórek Drosophila na różnych etapach rozwoju, w zależności od specyficznego dla danego typu komórek wzorca ekspresji GFP sterowanej przez GAL4.

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy metodę izolacji pojedynczych lub wielu neuronów dopaminergicznych (da) Drosophila z larw trzeciego stadium za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM) w klasie przechwytywania podczerwienią (IR). RNA uzyskane z wyizolowanych neuronów może być łatwo wykorzystane w dalszych zastosowaniach, w tym w analizach qRT-PCR lub mikromacierzach.

Mikrodysekcja laserowa neuronów obwodowych Drosophila

Neurony dendrytycznej arboryzacji (da) obwodowego układu nerwowego (PNS) muchy *Drosophila* stanowią doskonały model badawczy do analizy...

Mikrosekcja laserowa (laser capture MICRODISSECTION, LCM) stała się niezwykle potężnym narzędziem, które umożliwia izolowanie specyficznych typów komórek z przekrojów tkankowych z wysoką rozdzielczością przestrzenną i dokładnością. W niniejszej procedurze LCM jest wykorzystywane do wysekcjonowania neuronów obwodowych z larw oph w trzecim stadium rozwojowym. Larwy w trzecim stadium rozwojowym są osadzane w formie do krioembeddingu i mrożone, a następnie przy użyciu kriotomu wykonuje się seryjne przekroje tkankowe, które nanosi się na szkiełka przedmiotowe, rozmraża i utrwala w 70% ethanol.Następnie preparaty na szkiełkach inkubuje się z trypsyną w celu usunięcia pozostałości kutykuli larwalnej, a następnie poddaje odwodnieniu przy użyciu gradientu etanolu i przejaśnianiu ksylenem. W kolejnym kroku na przekrój tkanki nakłada się nakładkę LCM, a następnie za pomocą laserowego pulsowania wycina się wybrane fluorescencyjne komórki neuronów. Na koniec z wyizolowanych komórek izoluje się RNA do dalszych zastosowań, takich jak ilościowa R-T-P-C-R lub analizy mikromacierzy.Cześć, jestem Dan Cox z Departamentu Biologii Molekularnej i Mikrobiologii oraz Instytutu Studiów Zaawansowanych Krasnow na George Mason University. Cześć, jestem Ish AER z laboratorium dr. Dana Coxa. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę izolacji komórek i oczyszczania RNA z pojedynczych lub wielu obwodowych neuronów drozydrosophila z wykorzystaniem laserowej mikrodysekcji przechwytującej.Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu zbadania mechanizmów molekularnych pośredniczących w morfogenezie tempa DIN specyficznego dla danej klasy. Zatem zacznijmy. Wszystkie procedury przedstawione w tym filmie są przeprowadzane w ściśle wolnych od RNazy warunkach, zgodnie ze standardowymi procedurami.Protokół należy rozpocząć od zebrania od 30 do 40 starszych larw trzeciego stadium rozwoju. Larwy należy przemyć wodą podwójnie destylowaną.Krótko wypłucz, aby usunąć RNA, a następnie przemyj jeszcze raz wodą dwukrotnie destylowaną. Aby całkowicie usunąć RNA, użyj czystej chusteczki Kimwipe i dokładnie odsącz nadmiar wody. Następnie weź czystą formę do zatapiania tkanek i dodaj cienką warstwę OCT.Umieść formę na bloku lodu, aby schłodzić ją do 0 °C. Za pomocą pęsety umieść w niej oczyszczone larwy oraz zimny OCT. Niska temperatura OCT pomoże ograniczyć ruchy larw.Podczas procesu zatapiania ułóż larwy równolegle do siebie. Po ułożeniu larw powoli wypełnij formę OCT, nie naruszając ich położenia. Następnie gwałtownie schłodź.Zamroź formę, kładąc ją na suchego lodu. Zapewni to ułożenie larwy w jednej płaszczyźnie, co zmaksymalizuje liczbę komórek dostępnych w każdym przekroju. Użyj kriostatu.Wyciąć mrożone sekcje o grubości od 5 do 8 µm na zwykłych, opisanych, nieładowanych szkiełkach mikroskopowych wolnych od RNaz. Przechowywać szkiełka na suchym lodzie, a następnie przenieść je do temperatury -80 °C do momentu rozpoczęcia mikrodysekcji. Wszystkie roztwory do dehydratacji muszą być przygotowane na świeżo przed każdą sesją LCM.Całkowite odwodnienie zamrożonych sekcji tkanek larwalnych jest niezbędne do osiągnięcia optymalnej wydajności mikrodysekcji. Wyjmijt slajdy zawierające zamrożone sekcje tkanek larwalnych z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieść je na suchym lodzie. Wyjmij pojedynczy slajd z kasetki i natychmiast umieść go w 50 mL probówce stożkowej wypełnionej 70% etanolem na okres od 3 do 10 sekund.Następnie wypłucz preparat w 50 mililitrowej probówce stożkowej wypełnionej wolną od RNA dwukrotnie destylowaną wodą przez 5 do 10 sekund, aby usunąć kutykulę z przekrojów tkanek, która mogłaby zakłócać przechwytywanie metodą LCM. Ostrożnie nanieś pipetą 50 mikrolitrów 2,5% trypsyny bezpośrednio na przekrój tkanki i inkubuj przez 5 do 30 sekund w temperaturze pokojowej, po czym krótko wypłucz przekroje w 50 mililitrowej probówce stożkowej zawierającej wolną od RNA dwukrotnie destylowaną wodę, aby usunąć trypsynę oraz wszelkie luźno przylegające fragmenty kutykuli. Zakończ proces odwadniania, zanurzając preparaty kolejno w następujących roztworach.70% etanol, 95% etanol, 100% etanol, 100% etanol, 100% ksylen. I na koniec, jeszcze raz w 100% ksylenie. Po odwodnieniu całkowicie wysusz preparaty pod łagodnym strumieniem powietrza przez 60 do 120 sekund w temperaturze pokojowej.Jeśli to możliwe, przeprowadź mikrodyssekcję w pomieszczeniu z kontrolowaną wilgotnością, aby zapobiec spadkowi wydajności spowodowanemu zwiększoną wilgotnością. Najpierw włącz zasilanie mikroskopu i sterownika lasera. Załaduj do uchwytu na nakrętki nakrętki H-S-L-C-M.Każda nakładka jest w stanie pochwycić liczne ciała komórkowe. Następnie należy uruchomić oprogramowanie Molecular Devices i wprowadzić szczegóły eksperymentu, w tym numer preparatu oraz numer partii nakładek. Umieść preparat z przekrojami tkanki larwalnej na stoliku mikroskopu do mikrodysekcji.Załaduj nową nakładkę HS LCM z kasety na instrument P cell two ELCM i ustaw ją prawidłowo względem dżojstika, aby zapewnić właściwe pozycjonowanie nakładki w odniesieniu do obszaru przechwytywania; zlokalizuj komórki znakowane fluorescencyjnie w transgenicznych liniach reporterowych PPK GAL four U-A-S-M-C-D eight GFP lub 21 7 G four UASM CD eight GFP. Neurony arboryzacji dendrytycznej (DA) obwodowego układu nerwowego można łatwo zidentyfikować dzięki fluorescencji GFP. Aby zmaksymalizować swoistość, wybieraj komórki o silnym sygnale fluorescencyjnym i minimalnym nakładaniu się komórek.Następnie należy dostosować parametry mocy i czasu trwania impulsu laserowego, aby uzyskać precyzyjny punkt stopienia polimeru, którego rozmiar odpowiada wybranej wielkości plamki laserowej do mikrodysekcji pojedynczych neuronów klasy DA. Zaleca się następujące ustawienia: średnica plamki 7,5 micrometers, moc lasera od 30 do 50 milliwatts, czas trwania impulsu od dwóch do czterech milliseconds oraz od jednego do dwóch strzałów na komórkę.Ustawienia lasera mogą się różnić w zależności od rodzaju tkanki, jej grubości oraz rodzaju zastosowanej nakładki LCM. Ostatecznie ustawienia lasera wymagają testów empirycznych w celu uzyskania optymalnych wyników pobierania. Następnie poddaj tkankę procedurze LCM.Podczas LCM nakładka jest umieszczana nad obszarem zainteresowania, a następnie kierowany jest przez nią impuls podczerwonego lasera o niskiej mocy na cienką termolabilną folię polimerową znajdującą się nad wybraną komórką lub komórkami. W momencie impulsu laserowego folia mięknie, przylega do docelowych komórek, a następnie ponownie twardnieje, przejmując przytwierdzone do niej komórki zainteresowania.Po podniesieniu nakładki z przekroju tkanki, pojedyncza komórka lub grupa komórek zostają mikro wycięte z otaczającej tkanki; proces ten powtarza się w nowym polu, aby zebrać więcej komórek. Po zebraniu interesujących nas komórek należy podnieść nakładkę LCM i umieścić ją na czystym szkiełku, aby potwierdzić obecność pobranych komórek oraz brak niepożądanych komórek lub zanieczyszczeń. Należy wykonać obrazowanie nakładki HS LCM z wykorzystaniem fluorescencji oraz oświetlenia w świetle przechodzącym.Przymocuj zakrętkę zawierającą mikro-disekcyjne komórki do urządzenia do ekstrakcji. Następnie dodaj 12 µL buforu do ekstrakcji RNA na powierzchnię zakrętki i podłącz odwróconą, cienkościenną probówkę reakcyjną, jak pokazano tutaj. Umieść cały zestaw na tacy wyrównawczej i przykryj go podgrzanym blokiem inkubacyjnym.Następnie umieść taczkę w inkubatorze w temperaturze 42 °C na 30 minut, po czym przeprowadź inkubację i wirowanie. Wirowanie probówek zawierających ekstrakty należy przeprowadzić przy 800 ×g przez dwie minuty. Po wyjęciu probówek z wirówki należy je zamknąć i przechowywać ekstrakty komórkowe w temperaturze -80 °C do momentu oczyszczania RNA metodą kolumnową.Zgodnie z instrukcją zestawu do ekstrakcji RNA pico pure, traktowanie DNA jest opcjonalne i może być przeprowadzone na kolumnie podczas oczyszczania RNA w razie potrzeby. Po oczyszczeniu RNA należy przechowywać je w temperaturze -80 °C. Do izolacji pojedynczych, specyficznych dla klasy lub wielu neuronów dopaminergicznych (DA) muszki *Drosophila* z larw trzeciego stadium rozwojowego wykorzystano laserową mikrosekcję sterowaną (LCM).LCM umożliwia wysoki stopień precyzji i specyficzności w izolacji ciał komórkowych neuronów D muchówki drosophila. Przedstawiony tutaj reprezentatywny obraz obrazuje odwodniony i potraktowany trypsyną przekrój tkanki o grubości ośmiu mikronów. Przed przeprowadzeniem LCM dwa neurony DA klasy czwartej zostają znakowane GFP.Grot strzałki wskazuje neuron wybrany do przechwycenia. Ciało komórkowe zaznaczonego neuronu zostaje precyzyjnie wyizolowane metodą mikrodyssekcji z wysoką specyficznością z przekroju tkanki. Na obrazie widoczny jest widok z góry pojedynczego neuronu DA klasy czwartej przechwyconego na nakładkę LCM.Ustalono, że całkowite RNA oczyszczone z izolowanych neuronów DA jest doskonałej jakości, co potwierdzono obecnością ostrych piku rRNA 5,8 S i 28 S podczas analizy na bioanalizatorze Agilent 2100. W celu oceny specyficznego wzbogacenia izolowanych komórek w neurony przeprowadzono ilościową RT-PCR w czasie rzeczywistym dla specyficznego markera neuronalnego Lev, stosując metodę delta delta CT. W neuronach DA pobranych metodą LCM zaobserwowano ponad 2,5-krotny wzrost poziomu Lev w stosunku do całego organizmu.Właśnie pokazaliśmy, jak izolować i oczyszczać RNA z neuronów w węzłach lub neuronów obwodowych za pomocą laserowej mikrodysekcji. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zoptymalizowanie stężenia trypsyny oraz czasu trawienia w zależności od tkanki poddawanej mikrodysekcji oraz grubości skrawka. Dłuższy czas inkubacji może prowadzić do utraty komórek docelowych ze skrawków tkanek, natomiast zbyt krótki czas inkubacji może być niewystarczający do usunięcia kutykuli larwy, co skutkuje nieefektywną mikrodysekcją laserową.Ważne jest, aby wszystkie roztwory do dehydratacji tkanek były świeżo przygotowane. Ponadto, aby zapobiec uszkodzeniu polimeru osłonki LCM, ksylen musi zostać całkowicie odparowany przed przeprowadzeniem LCM. Wreszcie, w celu zachowania integralności RNA w oczyszczonych komórkach, niezbędne jest utrzymanie warunków wstępnych dla RNA przez cały czas trwania procedury.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

laser-capture-microdissection-of-drosophila-peripheral-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Laserowa mikrosekcja Drosophila komórek nerwowych obwodowych

Mikrosekcja laserowa została zastosowana do analizy profilu ekspresji genów w konkretnych przedziałach tarczki skrzydła Drosophila poddanych lokalnemu RNAi in vivo. RNA wyekstrahowany z równoważnych obszarów przedziałów wyciszonych i niewyciszonych przeanalizowano za pomocą ilościowej RT-PCR w celu określenia porównawczego profilu ekspresji genów w kontekście rodzimej mikroekologii tkanki.

Mikrosekcja laserowa zastosowana do profilowania ekspresji genów w podzbiorze komórek z dysku skrzydłowego Drosophila

Ludzkie komórki neuroprogenitorowe (NPC) były rozwijane w warunkach proliferacji. NPC różnicowano w kultury bogate w neurony w obecności kombinacji neurotrofin. Markery neuronalne wykryto za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Aby wyizolować czystą populację neuronów, NPC różnicowano na szkiełkach membranowych PEN i przeprowadzono mikrodysekcję wychwytywania laserowego.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji neuronów ze zróżnicowanych ludzkich komórek neuroprogenitorowych w hodowli

Tutaj opisujemy protokół optogenetycznej manipulacji aktywnością motoneuronalną podczas monitorowania zmian w wydatkach motorycznych (skurczu mięśni) u częściowo nienaruszonych larw Drosophila za pomocą laserów w konwencjonalnym mikroskopie konfokalnym. Technika ta umożliwia naukowcom osiągnięcie lokalnych zaburzeń aktywności neuronalnej w kilku neuromerach, aby wyjaśnić dynamikę obwodów motorycznych.

Optogenetyczne zaburzenia aktywności neuronalnej za pomocą oświetlenia laserowego u częściowo nienaruszonych larw Drosophila w ruchu

Larwy Drosophila są atrakcyjnym systemem modelowym do obrazowania na żywo ze względu na ich przezroczyste naskórki i silną genetykę. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać jednowarstwowe urządzenie PDMS, zwane "chipem larwowym" do obrazowania na żywo procesów komórkowych w neuronach larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym.

Wykorzystanie chipów mikroprzepływowych do obrazowania na żywo i badania reakcji na urazy u larw Drosophila

Izolacja pojedynczych neuronów dopaminowych lub brzusznego obszaru nakrywki za pomocą bezpośredniej lub pośredniej immunohistochemii jest demonstrowana za pomocą mikrodysekcji laserowej. Omówiono parametry izolacji tkanki ze szkiełka podstawowego za pomocą lasera na podczerwień oraz od szkiełek membranowych z wykorzystaniem kombinacji lasera podczerwonego i ultrafioletowego.

Mikrodysekcja laserowa - demonstracja izolacji pojedynczych neuronów dopaminowych i całego brzusznego obszaru nakrywki

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Tutaj opisujemy metodę, którą zastosowaliśmy do zobrazowania wysoce ruchliwych filopodiów dendrytycznych w żywym przygotowaniu mózgu larwy Drosophila, oraz opracowany przez nas protokół do ilościowego oznaczania zestawów danych obrazowania 3D w celu ilościowej oceny dynamiki dendrytów w rozwijających się neuronach.

Obrazowanie na żywo w trybie poklatkowym i kwantyfikacja dynamiki szybkich gałęzi dendrytycznych w rozwoju neuronów Drosophila

Opisujemy metodę wstecznego śledzenia embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych.

Wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualizacji sieci mikrotubul w połączeniach nerwowo-mięśniowych i komórkach mięśniowych. W połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi Drosophila melanogaster, protokół ten znacznie ułatwia genetyczne badania przesiewowe i analizę dynamiki mikrotubul pod kątem roli białek regulatorowych sieci mikrotubul w układzie nerwowym.

Wykorzystanie połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila i komórek mięśniowych do wizualizacji sieci mikrotubul

Ten protokół demonstruje laserową ablację komórek pojedynczych neuronów u nienaruszonych larw Drosophila. Metoda umożliwia badanie efektu zmniejszenia konkurencji między neuronami w rozwijającym się układzie nerwowym.

Laserowa ablacja komórek w nienaruszonych larwach Drosophila ujawnia konkurencję synaptyczną

Poznaj metodę laserowej mikrodysekcji do izolacji neuronów obwodowych Drosophila z larw trzeciego stadium. Technika ta umożliwia precyzyjne pozyskanie RNA do analiz ekspresji genów.

Mikrodysekcja laserowa neuronów obwodowych Drosophila

Przeglądaj więcej filmów