Name: Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji neuronów obwodowych Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Poznaj metodę laserowej mikrodysekcji do izolacji neuronów obwodowych Drosophila z larw trzeciego stadium. Technika ta umożliwia precyzyjne pozyskanie RNA do analiz ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr. Yuh-Nung Janowi oraz dr. Wesowi Grueberowi za udostępnienie szczepów muszek wykorzystanych w niniejszym badaniu, a także Virginii Espinie, dr. Emanuelowi Petricoinowi i dr. Lance'owi Liottie za pomoc w przeprowadzeniu LCM. Autorzy dziękują Thomas F. and Kate Miller Jeffress Memorial Trust za wsparcie niniejszych badań (D.N.C.) oraz Biuru Prorektora George Mason University (E.P.R.I.).

<ol><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+establishment%2C+maintenance%2C+and+remodeling+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li>
<li>Wang, X., Starz-Gaiano, M., Bridges, T., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+populations+from+Drosophila+tissues+by+magnetic+bead+sorting%2C+for+use+in+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell populations from Drosophila tissues by magnetic bead sorting, for use in gene expression profiling.</a> Nature Protocols. , (2008).</li>
<li>Iyer, E. P. R., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+Drosophila+peripheral+neurons+by+magnetic+bead+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of Drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting.</a> J Vis Exp. 34, 2912-2917 (2004).</li>
<li>Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A., Tirouvanziam, R., Tirouvanziam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-activated+cell+sorting+%28FACS%29+of+Drosophila+hemocytes+reveals+important+functional+similarities+to+mammalian+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2912-2917 (2004).</li>
<li>Shigenobu, S., Arita, K., Kitadate, Y., Noda, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+germline+cells+from+Drosophila+embryos+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Isolation of germline cells from Drosophila embryos by flow cytometry.</a> Dev. Growth Differ. 48, 49-57 (2006).</li>
<li>Reeves, N., Posakony, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+programs+activated+by+proneural+proteins+in+the+developing+Drosophila+PNS%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic programs activated by proneural proteins in the developing Drosophila PNS.</a> Dev. Cell. 8, 413-425 (2005).</li>
<li>Jinushi-Nakao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knot%2FCollier+and+Cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knot/Collier and Cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56, 963-978 (2007).</li>
<li>Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mRNA+from+specific+tissues+of+Drosophila+by+mRNA+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging.</a> Nucl. Acids Res. 33, (2005).</li>
<li>Appay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+Gene+Expression+Profiling+of+Human+T+Cell+Subsets+Reveals+Parallel+Post-Thymic+Differentiation+for+CD4%2B+and+CD8%2B+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sensitive Gene Expression Profiling of Human T Cell Subsets Reveals Parallel Post-Thymic Differentiation for CD4+ and CD8+ Lineages.</a> J. Immunol. 179, 7406-7414 (2007).</li>
<li>Ginzinger, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+quantification+using+real-time+quantitative+PCR%3A+An+emerging+technology+hits+the+mainstream%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream.</a> Exp. Hematol. 30, 503-512 (2002).</li>
<li>Keays, K. M., Owens, G. P., Ritchie, A. M., Gilden, D. H., Burgoon, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+and+single-cell+RT-PCR+without+RNA+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection and single-cell RT-PCR without RNA purification.</a> J. Immunol. Methods. 302, 90-98 (2005).</li>
<li>Volgin, D. V., Swan, J., Kubin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RT-PCR+gene+expression+profiling+of+acutely+dissociated+and+immunocytochemically+identified+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell RT-PCR gene expression profiling of acutely dissociated and immunocytochemically identified central neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 136, 229-236 (2004).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li>
<li>Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+in+embryonic+mouse+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling in embryonic mouse lenses.</a> Mol. Vis. 12, 1692-1698 (2006).</li>
<li>Scharschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+osteoarthritic+connective+tissue+by+laser+capture+microdissection+and+QRT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Connect.+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of human osteoarthritic connective tissue by laser capture microdissection and QRT-PCR.</a> Connect. Tissue Res. 48, 316-323 (2007).</li>
<li>Spletter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regulates+Drosophila+olfactory+projection+neuron+identity+and+targeting+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">regulates Drosophila olfactory projection neuron identity and targeting specificity.</a> Neural Dev. 2, 14-14 (2007).</li>
<li>Hoopfer, E. D., Penton, A., Watts, R. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+Drosophila+neuronal+remodeling%3A+a+role+for+the+RNA-binding+protein+Boule+as+a+negative+regulator+of+axon+pruning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of Drosophila neuronal remodeling: a role for the RNA-binding protein Boule as a negative regulator of axon pruning.</a> J. Neurosci. 28, 6092-6103 (2008).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 5199-5204 (2007).</li>
<li>Espina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prot%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje naszą zoptymalizowaną metodę izolacji neuronów obwodowych Drosophila za pomocą LCM. Choć ten protokół LCM został opracowany do specyficznej izolacji pojedynczych, klasowo specyficznych lub wielu neuronów da Drosophila z trzeciego stadium larwalnego rozwoju, niewielkie modyfikacje procedury mogą zostać łatwo dostosowane do pobierania innych typów komórek Drosophila ze wszystkich etapów rozwoju, przy użyciu odrębnych transgenów raportujących GAL4,UAS-mCD8-...

<table><tbody><tr><td>10X roztwór soli fosforanowo-buforowanej (PBS)</td><td>MP Biomedicals</td><td>PBS10X02</td><td>Rozcieńczony do 1X roztworu roboczego</td></tr><tr><td>2,5% trypsyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>RNase-AWAY</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83931</td><td></td></tr><tr><td>Ksyleny, stopień histologiczny</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td></td></tr><tr><td>woda wolna od RNaz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP561-1</td><td></td></tr><tr><td>związek OCT (Optimal Cutting Temperature)</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji RNA PicoPure</td><td>Molecular Devices</td><td>KIT0204</td><td>Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta&amp;rsquo;instrukcje</td></tr><tr><td>Cienkościenna probówka reakcyjna z kopułkową zakrętką</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8010611</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do ekstrakcji próbek ExtracSure</td><td>Molecular Devices</td><td>LCM 0208</td><td></td></tr><tr><td>Blok inkubacyjny do ekstrakcji próbek z kapsułek CapSure HS</td><td>Molecular Devices</td><td>LCM0505</td><td></td></tr><tr><td>Kasetka do pozycjonowania nakładek CapSure HS LCM oraz urządzeń do ekstrakcji próbek ExtracSure</td><td>Molecular Devices</td><td>LCM0504</td><td></td></tr><tr><td>nakrętki CapSure HS LCM</td><td>Molecular Devices</td><td>LCM0213</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka przedmiotowe 75x100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>Formy do zatapiania tkanek</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9642669</td><td></td></tr><tr><td>Tłuczek polipropylenowy do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1415-5390</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol; 95% etanol; 100% etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suchy lód</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Sprzęt:&lt;/p&gt;&lt;ul&gt;&lt;li&gt;Kriostat&lt;/li&gt;&lt;li&gt;probówka stożkowa 50 ml do utrwalania preparatów, płukania, traktowania trypsyną oraz odwadniania etanolem/ksylolem&lt;/li&gt;&lt;li&gt;-80&amp;#x00B0;zamrażarka do niskich temperatur&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Inkubator&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Urządzenie do mikromanipulacji laserowej PixCell IIe z optyką epifluorescencyjną Fluor 300 zoptymalizowaną pod kątem EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices)&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

mikrodysekcja laserowa neuronów obwodowych drosophila

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Neurony arboryzacji dendrytycznej (da) obwodowego układu nerwowego (PNS) Drosophila stanowią doskonały system modelowy do badania molekularnych mechanizmów leżących u podstaw specyficznej dla danej klasy morfogenezy dendrytów1,2. Aby umożliwić analizy molekularne rozwoju neuronów da specyficznych dla danej klasy, kluczowe jest uzyskanie tych komórek w postaci czystej populacji. Choć dla komórek Drosophila istnieje szereg różnych technik izolacji RNA specyficznych dla komórek i tkanek, w tym oczyszczanie komórek z użyciem kulek magnetycznych3,4, sortowanie komórek metodą FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting)5-8 oraz strategie oparte na białkach wiążących RNA9, żadna z tych metod nie może być łatwo wykorzystana do izolacji pojedynczych lub wielu neuronów da Drosophila specyficznych dla danej klasy z wysoką precyzją przestrzenną. Mikrodysekcja sterowana laserem (LCM) okazała się niezwykle potężnym narzędziem, które można wykorzystać do izolowania specyficznych typów komórek z przekrojów tkanek z wysoką rozdzielczością i dokładnością przestrzenną. RNA uzyskane z izolowanych komórek może być następnie wykorzystane do analiz, w tym qRT-PCR i profilowania ekspresji za pomocą mikromacierzy w obrębie danego typu komórek10-16. Do tej pory LCM nie było szeroko stosowane w analizie tkanek i komórek Drosophila17,18, w tym neuronów da w trzecim stadium larwalnym rozwoju. 
W niniejszej pracy przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolacji neuronów da Drosophila z wykorzystaniem podczerwonego (IR) rodzaju LCM. Metoda ta umożliwia wychwyt pojedynczych, specyficznych dla danej klasy lub wielu neuronów da z wysoką specyficznością i rozdzielczością przestrzenną. W eksperymentach wykorzystano larwy trzeciego stadium o tym samym wieku, wykazujące ekspresję transgenu UAS-mCD8::GFP19 pod kontrolą specyficznego dla klasy IV neuronów da drivera ppk-GAL420 lub pan-neuronowego drivera 21-7-GAL421. RNA uzyskane z izolowanych neuronów da charakteryzuje się bardzo wysoką jakością i może być bezpośrednio wykorzystane w dalszych analizach, w tym w qRT-PCR lub analizach mikromacierzy. Co więcej, niniejszy protokół LCM można łatwo dostosować do wychwytu innych typów komórek Drosophila na różnych etapach rozwoju, w zależności od specyficznego dla danego typu komórek wzorca ekspresji GFP sterowanej przez GAL4.

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy metodę izolacji pojedynczych lub wielu neuronów dopaminergicznych (da) Drosophila z larw trzeciego stadium za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM) w klasie przechwytywania podczerwienią (IR). RNA uzyskane z wyizolowanych neuronów może być łatwo wykorzystane w dalszych zastosowaniach, w tym w analizach qRT-PCR lub mikromacierzach.

Mikrodysekcja laserowa neuronów obwodowych Drosophila

Neurony dendrytycznej arboryzacji (da) obwodowego układu nerwowego (PNS) muchy *Drosophila* stanowią doskonały model badawczy do analizy...

Mikrosekcja laserowa (laser capture MICRODISSECTION, LCM) stała się niezwykle potężnym narzędziem, które umożliwia izolowanie specyficznych typów komórek z przekrojów tkankowych z wysoką rozdzielczością przestrzenną i dokładnością. W niniejszej procedurze LCM jest wykorzystywane do wysekcjonowania neuronów obwodowych z larw oph w trzecim stadium rozwojowym. Larwy w trzecim stadium rozwojowym są osadzane w formie do krioembeddingu i mrożone, a następnie przy użyciu kriotomu wykonuje się seryjne przekroje tkankowe, które nanosi się na szkiełka przedmiotowe, rozmraża i utrwala w 70% ethanol.Następnie preparaty na szkiełkach inkubuje się z trypsyną w celu usunięcia pozostałości kutykuli larwalnej, a następnie poddaje odwodnieniu przy użyciu gradientu etanolu i przejaśnianiu ksylenem. W kolejnym kroku na przekrój tkanki nakłada się nakładkę LCM, a następnie za pomocą laserowego pulsowania wycina się wybrane fluorescencyjne komórki neuronów. Na koniec z wyizolowanych komórek izoluje się RNA do dalszych zastosowań, takich jak ilościowa R-T-P-C-R lub analizy mikromacierzy.Cześć, jestem Dan Cox z Departamentu Biologii Molekularnej i Mikrobiologii oraz Instytutu Studiów Zaawansowanych Krasno

laser-capture-microdissection-of-drosophila-peripheral-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Laserowa mikrosekcja Drosophila komórek nerwowych obwodowych

Mikrosekcja laserowa została zastosowana do analizy profilu ekspresji genów w konkretnych przedziałach tarczki skrzydła Drosophila poddanych lokalnemu RNAi in vivo. RNA wyekstrahowany z równoważnych obszarów przedziałów wyciszonych i niewyciszonych przeanalizowano za pomocą ilościowej RT-PCR w celu określenia porównawczego profilu ekspresji genów w kontekście rodzimej mikroekologii tkanki.

Mikrosekcja laserowa zastosowana do profilowania ekspresji genów w podzbiorze komórek z dysku skrzydłowego Drosophila

Ludzkie komórki neuroprogenitorowe (NPC) były rozwijane w warunkach proliferacji. NPC różnicowano w kultury bogate w neurony w obecności kombinacji neurotrofin. Markery neuronalne wykryto za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Aby wyizolować czystą populację neuronów, NPC różnicowano na szkiełkach membranowych PEN i przeprowadzono mikrodysekcję wychwytywania laserowego.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji neuronów ze zróżnicowanych ludzkich komórek neuroprogenitorowych w hodowli

Tutaj opisujemy protokół optogenetycznej manipulacji aktywnością motoneuronalną podczas monitorowania zmian w wydatkach motorycznych (skurczu mięśni) u częściowo nienaruszonych larw Drosophila za pomocą laserów w konwencjonalnym mikroskopie konfokalnym. Technika ta umożliwia naukowcom osiągnięcie lokalnych zaburzeń aktywności neuronalnej w kilku neuromerach, aby wyjaśnić dynamikę obwodów motorycznych.

Optogenetyczne zaburzenia aktywności neuronalnej za pomocą oświetlenia laserowego u częściowo nienaruszonych larw Drosophila w ruchu

Larwy Drosophila są atrakcyjnym systemem modelowym do obrazowania na żywo ze względu na ich przezroczyste naskórki i silną genetykę. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać jednowarstwowe urządzenie PDMS, zwane "chipem larwowym" do obrazowania na żywo procesów komórkowych w neuronach larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym.

Wykorzystanie chipów mikroprzepływowych do obrazowania na żywo i badania reakcji na urazy u larw Drosophila

Izolacja pojedynczych neuronów dopaminowych lub brzusznego obszaru nakrywki za pomocą bezpośredniej lub pośredniej immunohistochemii jest demonstrowana za pomocą mikrodysekcji laserowej. Omówiono parametry izolacji tkanki ze szkiełka podstawowego za pomocą lasera na podczerwień oraz od szkiełek membranowych z wykorzystaniem kombinacji lasera podczerwonego i ultrafioletowego.

Mikrodysekcja laserowa - demonstracja izolacji pojedynczych neuronów dopaminowych i całego brzusznego obszaru nakrywki

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Tutaj opisujemy metodę, którą zastosowaliśmy do zobrazowania wysoce ruchliwych filopodiów dendrytycznych w żywym przygotowaniu mózgu larwy Drosophila, oraz opracowany przez nas protokół do ilościowego oznaczania zestawów danych obrazowania 3D w celu ilościowej oceny dynamiki dendrytów w rozwijających się neuronach.

Obrazowanie na żywo w trybie poklatkowym i kwantyfikacja dynamiki szybkich gałęzi dendrytycznych w rozwoju neuronów Drosophila

Opisujemy metodę wstecznego śledzenia embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych.

Wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualizacji sieci mikrotubul w połączeniach nerwowo-mięśniowych i komórkach mięśniowych. W połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi Drosophila melanogaster, protokół ten znacznie ułatwia genetyczne badania przesiewowe i analizę dynamiki mikrotubul pod kątem roli białek regulatorowych sieci mikrotubul w układzie nerwowym.

Wykorzystanie połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila i komórek mięśniowych do wizualizacji sieci mikrotubul

Ten protokół demonstruje laserową ablację komórek pojedynczych neuronów u nienaruszonych larw Drosophila. Metoda umożliwia badanie efektu zmniejszenia konkurencji między neuronami w rozwijającym się układzie nerwowym.

Laserowa ablacja komórek w nienaruszonych larwach Drosophila ujawnia konkurencję synaptyczną

Poznaj metodę laserowej mikrodysekcji do izolacji neuronów obwodowych Drosophila z larw trzeciego stadium. Technika ta umożliwia precyzyjne pozyskanie RNA do analiz ekspresji genów.

Mikrodysekcja laserowa neuronów obwodowych Drosophila

Przeglądaj więcej filmów