Dysocjacja mechaniczna: metoda uzyskiwania żywotnych komórek z tkanki

Najpierw zważ fragment tkanki i zmierz jego długość, szerokość i wysokość. Umieść tkankę w naczyniu hodowlanym z pożywką hodowlaną i pokrój ją na małe kawałki za pomocą skalpela. Przenieś wszystko do rurki C w celu homogenizacji za pomocą pipety Pasteura.

Umieść rurkę w dysocjatorze mechanicznym i uruchom cykle zgodnie z wymaganiami. Aparatura wykorzystuje siły mechaniczne do ekstrakcji żywotnych pojedynczych komórek z próbki tkanki przy zachowaniu integralności komórkowej, w tym białek powierzchniowych. Zdekantować homogenat przez sitko komórkowe zamocowane na probówce wirówkowej.

Ponownie homogenizować pozostałą tkankę i przecedzić homogenat przez sitko do komórek do probówki. Odwirować homogenat i usunąć supernatant. Teraz ponownie zawieś osad komórkowy w pożywce hodowlanej i przenieś niewielką ilość zawiesiny komórkowej do probówki zawierającej barwienie błękitem trypanowym.

Po zabarwieniu przenieś komórki na szkiełko hemocytometryczne. Policz przezroczyste żywe komórki. Martwe komórki przyjmują plamę, ponieważ ich błona komórkowa nie jest nienaruszona. W poniższym protokole przeprowadzimy nieenzymatyczną dysocjację świeżej tkanki ludzkiej w celu analizy ilościowej i jakościowej komórek CD45 +.

- Zacznij od zważenia próbki tkanki, a następnie zmierz długość, szerokość i wysokość tkanki. Następnie przenieś fragment tkanki na małą szalkę Petriego zawierającą 1 mililitr odpowiedniej, chemicznie zdefiniowanej, pozbawionej surowicy pożywki dla komórek krwiotwórczych i użyj sterylnego skalpela, aby pokroić próbki na małe kawałki o powierzchni od 1 do 2 milimetrów kwadratowych. Następnie przenieś zawartość naczynia do mechanicznej rurki C dysocjatora i opłucz naczynie i skalpel 2 mililitrami pożywki.

Dodaj płukanie do rurki C, a następnie uruchom program dysocjatora mechanicznego 8.01 dwa razy z rzędu, aby delikatnie homogenizować fragmenty tkanki w zawiesinę pojedynczej komórki. Po drugim cyklu zdekantować homogenat przez sitko o średnicy 40 mikrometrów do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Następnie użyj tej samej pipety Pasteura, która została użyta podczas mycia szalki Petriego, aby przenieść płyn pozostały w rurce C do sitka do komórek.

Następnie za pomocą mikropipety o pojemności 1 mililitra przenieś przefiltrowaną ciecz do 15-mililitrowej rurki stożkowej i przepłucz rurkę C dodatkowymi 3 mililitrami pożywki. Przelej ten płyn przez sitko do 50-mililitrowej probówki. Następnie delikatnie przesuń niehomogenizowaną tkankę wokół sitka czystą 1-mililitrową końcówką, aby wycisnąć maksymalną ilość pozostałego płynu uwięzionego w tkance do 50-mililitrowej tubki. Teraz umieść sitko do komórek do góry nogami na oryginalnej rurce C i przepłucz sitko 3 dodatkowymi mililitrami pożywki, aby niehomogenizowana tkanka opadła z powrotem do rurki C.

Ponownie homogenizuj tkankę przez dwa kolejne cykle, jak pokazano, a następnie ponownie przelej drugi homogenat przez sitko do komórek. Przepłucz rurkę C kolejnymi 3 mililitrami pożywki. Następnie przefiltrować supernatant przez sitko i wycisnąć pozostałą ciecz z tkanki, jak właśnie pokazano. W tym momencie objętość około 2,5 mililitra zawiesiny jednokomórkowej powinna być obecna w 15-mililitrowej probówce, a około 9 mililitrów powinna być obserwowana w 50-mililitrowej probówce.

Aby oddzielić supernatant tkankowy od komórek, należy najpierw odwirować obie probówki homogenatu przez 15 minut w temperaturze 600 G w temperaturze pokojowej. Zdekantować supernatant z 15-mililitrowej probówki do 1,5-mililitrowej probówki, umieszczając ją w temperaturze 4 stopni Celsjusza, i wyrzucić supernatant z 50-mililitrowej probówki. Następnie delikatnie postukaj każdą rurką o twardą powierzchnię, aby rozbić każdą z granulek komórek.

Zawiesić luźne ogniwa w 50-mililitrowej tubie z 500 mikrolitrami pożywki i przenieść komórki do 15-mililitrowej probówki w celu ponownego zawieszenia drugiej granulki. Następnie przepłucz 50-mililitrową probówkę kolejnymi 500 mikrolitrami pożywki i przenieś popłuczynę do 15-mililitrowej probówki, aby uzyskać maksymalny odzysk komórek. Po zliczeniu liczby żywotnych komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego, zawiesinę komórek należy otoczkować.

Na koniec odwirować zarezerwowany supernatant tkankowy. Następnie ostrożnie przenieść supernatant do co najmniej jednej czystej probówki, nie dotykając ani nie naruszając osadu i przechowuj go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do przyszłej analizy.