Wstrzyknięcie żyły ogonowej: metoda podawania komórek rakowych do badań przerzutowych w modelu mysim

Zacznij od dodania trypsyny do szalki Petriego zawierającej znakowane komórki raka piersi, aby oderwać je od powierzchni. Dodaj pożywkę zawierającą surowicę, aby zatrzymać działanie trypsyny. Przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki i odwiruj ją do komórki osadu.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami. Umieść probówkę na lodzie, aby spowolnić metabolizm komórkowy. Zawiesinę zawierającą wymaganą ilość komórek należy umieścić w strzykawce typu Luer lock i przymocować do niej igłę.

Umieść mysz w uwięzi dla gryzoni z ogonem na zewnątrz. Zanurz ogon w ciepłej wodzie, aby rozszerzyć żyły. Po bocznych stronach znajdują się dwie żyły, a po brzusznej stronie ogona tętnica. Przetrzeć ogon alkoholem, wprowadzić igłę i wstrzyknąć zawiesinę komórkową.

Po dostaniu się do krwiobiegu wstrzyknięte komórki rakowe wnikają do narządów, takich jak płuca, i namnażają się. Powoli wyjąć igłę i przyłożyć jałową gazę do miejsca wstrzyknięcia, aby wywrzeć ucisk w celu zatrzymania krwawienia. Umieść mysz z powrotem w klatce i zapewnij pełną regenerację. W poniższym protokole demonstrujemy wstrzyknięcie znakowanych przerzutowych komórek rakowych do modelu mysiego w celu ilościowego określenia przerzutów i kolonizacji raka piersi.

Odessać pożywkę i przepłukać płytki komórkowe 1X PBS. Trypsynizuj komórki za pomocą 5 mililitrów trypsyny na 15-centymetrową płytkę przez dwie do pięciu minut i przenieś wszystkie komórki do stożkowej probówki. Umyj pozostałe komórki z naczynia do hodowli tkankowej wystarczającą ilością kompletnego podłoża wzrostowego, aby wygasić trypsynę. Dodaj pranie do tej samej stożkowej rurki. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek, aby określić całkowitą liczbę komórek.

Następnie odwirować komórki w temperaturze 122 razy G przez trzy minuty i odessać supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1X PBS w żądanym stężeniu. Tutaj 25 000 komórek jest wstrzykiwanych każdej myszy w 100 mikrolitrach PBS, więc zawieszone komórki mają 250 000 komórek na mililitr. Zawiesiny komórkowe należy przechowywać na lodzie do czasu wstrzyknięcia.

Pracując w kapturze w obiekcie dla zwierząt, delikatnie, ale dokładnie wymieszaj komórki, odwracając rurkę lub używając 1-mililitrowej strzykawki, aby upewnić się, że są one równomiernie zawieszone. Teraz załaduj 1-mililitrową strzykawkę Luer lock zawiesiną komórek i usuń nadmiar pęcherzyków powietrza. Umieść igłę o rozmiarze 1/2 cala i rozmiarze 30 na strzykawce skosem do góry i usuń pęcherzyki powietrza.

Delikatnie umieść mysz w uchwycie dla gryzoni. Boczna żyła ogonowa powinna być widoczna i rozszerzona. Jeśli nie, delikatnie uszczypnij podstawę ogona i zanurz ogon w ciepłej wodzie z kranu, aby rozszerzyć żyły. Użyj chusteczki nasączonej alkoholem, aby wyczyścić ogon. Następnie włóż igłę do żyły ogonowej, skośnie do góry i wstrzyknij 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej. Jeśli igła jest prawidłowo wprowadzona do żyły, powinna łatwo przesuwać się lekko do przodu i do tyłu, a przy naciskaniu tłoka nie powinno być oporu.

Udane wstrzyknięcia powinny również skutkować uderzeniem gorąca, w którym niebieski kolor żyły zmienia kolor na biały na kilka sekund po wstrzyknięciu. Powoli wyjąć igłę i za pomocą jałowej gazy uciskać miejsce wstrzyknięcia, aby zatamować krwawienie. Umieść mysz z powrotem w klatce i monitoruj przez 15 minut, aby zapewnić pełne wyzdrowienie.