$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Zacznij od umieszczenia cienkiego wycinka tkanki w roztworze amoniaku, aby umożliwić delikatne pobranie antygenu. Przenieś przekrój na szkiełko pokryte polilizyną. Ujemnie naładowane komórki wiążą się z dodatnio naładowaną polilizyną. Następnie dodaj nadtlenek wodoru, aby zablokować endogenną aktywność peroksydazy. Umyj szkiełko w soli fizjologicznej buforowanej tris, TBS.
TBS wspomaga dostęp przeciwciał do antygenów poprzez zerwanie wiązań krzyżowych białek. Przemyć skrawek roztworem blokowym, aby zmniejszyć nieswoiste wiązanie przeciwciał. Dodaj przeciwciała pierwszorzędowe do sekcji i inkubuj przez noc. Przeciwciało pierwotne wiąże się ze swoim specyficznym antygenem obecnym na powierzchni komórki. Umyj szkiełko za pomocą TBS.
Dodaj przeciwciała drugorzędowe sprzężone z biotyną, które przyłączają się do regionu Fc przeciwciała pierwszorzędowego. Umyj sekcję enzymem peroksydazy streptawidyny-biotyny. Następnie dodaj chromogenny substrat peroksydazy do tkanki. Peroksydaza przekształca chromogen w barwny produkt nierozpuszczalny.
Przeciwbarwić tkankę roztworem hematoksyliny. Hematoksylina wiąże się z kwaśnymi składnikami komórek i zmienia ich kolor na niebieski. Obserwuj tkankę pod mikroskopem świetlnym. Antygeny są wykrywane jako czerwone, podczas gdy komórki wydają się niebieskie z powodu hematoksyliny. W poniższym protokole przeprowadzimy barwienie immunohistochemiczne w celu identyfikacji komórek CD45 i CD1a z biopsji wewnątrzoskrzelowych.
- Przed przecięciem osadzonej tkanki biopsyjnej należy ostrożnie ustawić uchwyt noża pod kątem bloku biopsyjnego tak, aby ostrze przylegało płasko do powierzchni bloku. Następnie powoli wytnij co najmniej dwa odcinki o grubości 2 mikronów z każdej próbki biopsji wewnątrzoskrzelowej, używając kleszczy, aby przenieść każdy świeżo pocięty plasterek tkanki do 0,05% roztworu amoniaku i wody destylowanej. Po 45 do 90 sekundach użyj szkiełka mikroskopowego pokrytego poli-l-lizyną, aby podnieść każdą rozłożoną sekcję i pozostawić sekcje do wyschnięcia na co najmniej godzinę.
Gdy skrawki wyschną, oznacz szkiełka jako odpowiednie dla eksperymentu i narysuj hydrofobową barierę wokół każdej próbki. Następnie nałóż 1 mililitr świeżo przygotowanego roztworu blokowego peroksydazy na sekcje. Po 30 minutach usuń roztwór blokujący peroksydazy, a następnie przemyj skrawki trzy razy przez pięć minut TBS, a następnie usuń TBS i dodaj 1% roztwór blokujący BSA na kolejne 30 minut inkubacji, aby zablokować wszelkie nieswoiste wiązania przeciwciał.
Pod koniec inkubacji dodać pierwszorzędowe przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania, rozcieńczone w TBS, i nakryć próbki do inkubacji przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego ranka umyj szkiełka trzy razy w TBS i nakładaj przeciwciało wtórne przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umyć szkiełka jeszcze trzy razy w świeżym TBS i inkubować próbki w świeżo przygotowanym roztworze kompleksu peroksydazy streptawidyny i biotyny przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie trzy kolejne łyżki tłuszczu stołowego.
Następnie potraktuj naczynia świeżo przygotowanym roztworem substratu peroksydazy AEC przez 20 do 30 minut. Gdy pojawi się pożądana intensywność barwienia, płucz szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez pięć minut i przeciwbarwić skrawki przefiltrowanym roztworem hematoksyliny Mayera. Po dwóch minutach umyj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez kolejne pięć minut, następnie osusz szkiełka i przykryj sekcje trwałym wodnym medium montażowym, susząc próbki w suszarce o temperaturze 80 stopni Celsjusza.
Po ostygnięciu zamocuj próbki za pomocą podłoża montażowego DPX i szkiełka nakrywkowego do ich analizy w 40-krotnym powiększeniu pod mikroskopem świetlnym.