Name: Odpowiedź chemotaktyczna mikroorganizmów morskich na warstwy składników odżywczych w mikroskali (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 38 s
Description: Poznaj metody mikrofluidyczne do badania chemotaksji mikroorganizmów morskich i ich zachowań pływackich w warunkach przepływu ścinającego. Technika ta pozwala analizować ekologiczne interakcje w mikroskali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Microsystems Technology Laboratories na MIT za umożliwienie nagrania części tego filmu w zapleczu typu clean room.

Przygotowanie
1. Przygotowanie maski&nbsp;
<blockquote>
Za pomocą oprogramowania CAD zaprojektuj kanał do druku o wysokiej rozdzielczości na folii przezroczystej. Będzie to pełnić rolę „maski”.
</blockquote>
W pomieszczeniu czystym:
2. Oczyść i wypal wafelek
W pierwszej kolejności opłucz wafelek acetonem, następnie szybko metanolem, a potem izopropanolem. Na koniec osusz wafelek azotem.
Wypiekaj wafle w piekarniku (130°C) przez 5 min.
3. Powlekanie płytki
Umieść wafelek w centrum urządzenia do powlekania wirowego. Wlej fotorezyst (SU-8) z butelki na wafelek. Pozostaw SU-8, aby się rozlał i ustabilizował przez ~ 10 s. Włącz powlekacz wirowy i zwiększaj jego prędkość od 0 do 500 rpm w ciągu 5 s; utrzymuj 500 rpm przez 10 s; zwiększaj prędkość do wartości końcowej w ciągu 10 s i utrzymuj ją przez 30 s. Prędkość końcowa zależy od docelowej grubości powłoki oraz użytego SU-8. Szczegółowe informacje można znaleźć pod adresem <a href="http://www.microchem.com/">http://www.microchem.com/</a>
4. Wygrzewanie wstępne (soft-bake)
Po pokryciu wafla, wypiecz go najpierw w temperaturze 65°C, a następnie w 95°C. Czas wypiekania zależy od docelowej grubości oraz rodzaju zastosowanego fotorezystu. Następnie pozostaw wafla w temperaturze pokojowej na co najmniej 5 min.
5. Ekspozycja
Umieść maskę na powierzchni wafla i naświetlaj wafel światłem UV przez czas zalecany w instrukcji SU-8.
6. Wygrzewanie po naświetlaniu
Wypiecz wafelek w temperaturze 65°C, a następnie w 95°C, zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi SU-8.
7. Wywoływanie wafla w celu uzyskania „matrycy” (formy)
Przygotuj zlewkę wypełnioną wywoływaczem (PMMA). Zanurz wafelek w zlewce, delikatnie nią kołysząc, aż do momentu wymycia nienaświetlonych części fotorezistu.
W naszym laboratorium:
8. Przygotuj PDMS i wlej go na wafer
Wymieszaj PDMS z utwardzaczem w stosunku 10:1 w kubku. Mieszaj do uzyskania homogenicznej konsystencji: spowoduje to powstanie wielu pęcherzyków powietrza i sprawi, że mieszanina stanie się mętna. Wlej mieszaninę na „matrycę”.
9. Odpowietrzanie w komorze próżniowej
Aby usunąć pęcherzyki powietrza, umieść matrycę oraz pokrytą nią mieszaninę PDMS w komorze próżniowej aż do całkowitego ich zniknięcia.
10. Wypiekanie w piekarniku
          Wypiekać przez co najmniej 12 godzin w piekarniku w temperaturze 65°C, aby utwardzić PDMS.
11. Wywierć otwory
Oderwij PDMS od matrycy i wywierć otwory dla wlotów i wylotów kanałów.
W pomieszczeniu czystym (niewidoczne)
12. Bondowanie plazmowe
Kanały są przytwierdzane do szkiełka przedmiotowego po potraktowaniu zarówno warstwy PDMS, jak i szkiełka plazmą tlenową przez 1 min.
Eksperymenty:
Eksperyment nr 1: Badanie odpowiedzi chemotaktycznej mikroorganizmów morskich na mikroprzestrzenne warstwy składników odżywczych
1) Przygotowanie eksperymentu
<ol>
<li>Wprowadź organizmy i podłoża do szklanych strzykawek</li>
<li>Umieść kanał mikroprzepływowy na stole mikroskopu i podłącz rurki do odpowiednich wlotów i wylotów</li>
<li>Podłącz rurki do zbiornika na odpady. Upewnij się, że rurka jest całkowicie zanurzona w cieczy w zbiorniku na odpady, aby uniknąć oscylacji ciśnienia</li>
<li>Umieść strzykawki w pompie strzykawkowej i podłącz je do zaworów i rurek</li>
<li>Skonfiguruj mikroskop: warunki oświetlenia, powiększenie itp.</li>
<li>Ustaw ostrość na odpowiednią pozycję w kanale</li>
<li>Usuń pęcherzyki powietrza z kanału, używając większej strzykawki wypełnionej sztuczną wodą morską</li>
<li>Ustaw odpowiednią prędkość przepływu w pompie strzykawkowej. W tym przypadku 2 ml/min, co odpowiada średniej prędkości przepływu 220 µm s-1 w kanale</li>
</ol>
2) Przeprowadzenie eksperymentu
<ol>
<li>Uruchom pompę strzykawkową, aby ustanowić gradient składników odżywczych w kanale</li>
<li>Po ustabilizowaniu przepływu i utworzeniu się pasma składników odżywczych, zatrzymaj przepływ w pompie strzykawkowej i rozpocznij pomiar czasu od tego momentu</li>
<li>Pasmo składników odżywczych zaczyna dyfundować bocznie</li>
<li>W regularnych odstępach czasu użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby zarejestrować sekwencje klatek w celu stworzenia „filmów”</li>
<li>Zidentyfikuj pływające organizmy, wykonując obrazy różnic czasowych&nbsp;między dwiema kolejnymi&nbsp;klatkami, tak aby&nbsp;widoczne były jedynie obiekty ruchome, co pozwoli odróżnić komórki ruchliwe od nieprzesuwających się cząsteczek i&nbsp;szumu tła</li>
<li>Wykonaj filmy, aby określić pozycje komórek w kanale w odniesieniu do położenia obszaru składników odżywczych</li>
<li>Nagrywaj filmy w regularnych odstępach czasu przez 10-20 min, aby przeanalizować pozycje i wzorce pływania organizmów</li>
<li>Wykorzystując oprogramowanie do analizy obrazu do nakładania na siebie pozycji organizmów w różnych klatkach (przypisując każdemu pikselowi maksymalną intensywność światła zarejestrowaną w tym pikselu w czasie trwania filmu), możemy&nbsp;uzyskać informacje o trajektorii pływających komórek&nbsp;</li>
</ol>
Eksperyment nr 2: Badanie wpływu sił ścinania na pływające bakterie morskie w wirze
<ol>
<li>Stosując różne geometrie kanału, możemy obserwować zachowanie bakterii pływających w wirze przy różnych prędkościach ścinania</li>
</ol>

<ol><li>Azam, F., Malfatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+structuring+of+marine+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial structuring of marine ecosystems.</a> Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).</li>
<li>Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+explicit+simulations+of+a+microbial+food+web.+%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Spatially explicit simulations of a microbial food web. </a> Limnology and Oceanography. 42, 613-622 (1997).</li>
<li>Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+nutrient+patches+in+plankton+habitats+shown+by+chemotactic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria.</a> Science. 282, 2254-2256 (1998).</li>
<li>Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+metapopulations+in+nanofabricated+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 103, 17290-17295 (2006).</li>
<li>Mao, H., Cremer, P. S., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 100, 5449-5454 (2003).</li>
<li>Marcos,, Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microorganisms+in+vortices%3A+a+microfluidic+setup%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Microorganisms in vortices: a microfluidic setup.</a> Limnology and Oceanography: Methods. 4, 392-398 (2006).</li>
<li>Park, S., Wolanin, P. M., Yuzbahyan, E. A., Lin, H., Darnton, N. C., Stock, J. B., Silberzan, P., Austin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+topology+on+bacterial+social+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Influence of topology on bacterial social interaction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13910-13915 (2003).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li>
</ol>

Zrozumienie sposobu, w jaki mikroby morskie oddziałują z lokalnym środowiskiem chemicznym i fizycznym, jest niezbędne dla pełniejszego i dokładniejszego postrzegania roli mikroorganizmów planktonicznych w oceanicznych cyklach składników odżywczych i węgla (Azam and Malfatti 2007). Jednak ze względu na małe skale (&lt; mm), w obrębie których zachodzi wiele istotnych interakcji mikrobiologicznych, ograniczenia techniczne uniemożliwiały szczegółowe badania zachowania mikrobów w niejednorodnym krajobrazie biofizykochemicznym...

<table><tbody><tr><td>PDMS, Sylgard 184</td><td>Zestaw do elastomeru silikonowego</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>http://www.ellsworth.com/sylgard.html</td></tr><tr><td>SU8-2100</td><td>Fotorezyst</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>www.microchem.com</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop Nikon Eclipse TE2000-E</td><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przewody PEEK (ID 0,762 mm, OD 1,59 mm)</td><td>Narzędzie</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>www.upchurch.com</td></tr><tr><td>Strzykawki (z końcówką Luer-Lok)</td><td>Narzędzie</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Złączka Part P-704-01</td><td>Narzędzie</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>Do połączenia przewodów ze strzykawkami z końcówką Luer-Lok</td></tr><tr><td>Pompa strzykawowa (programowalna PHD 2000)</td><td>Sprzęt</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD (PCO 1600)</td><td>Sprzęt</td><td>Cook</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

odpowiedź chemotaktyczna mikroorganizmów morskich na mikroskalowe warstwy składników odżywczych

Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

Stopień, w jakim mikroby planktonowe potrafią wykorzystywać mikroskalowe plamy zasobów, będzie miał znaczące implikacje dla trofodynamiki oceanicznej i strumieni biogeochemicznych. Jednak aby móc korzystać z plam nutrientów w oceanie, pływające mikroby muszą przezwyciężyć wpływ sił fizycznych, w tym dyfuzji molekularnej i ścinania turbulentnego, które ograniczają dostępność plam oraz zdolność bakterii do ich lokalizowania. Do niedawna ograniczenia metodologiczne uniemożliwiały bezpośrednie badania zachowań mikrobów w mozaikowych siedliskach i realistycznych warunkach przepływu w małej skali. W związku z tym znaczna część naszej obecnej wiedzy na temat zachowania mikrobów w oceanie została uzyskana z przewidywań teoretycznych. Aby pozyskać nowe informacje na temat zachowań żerujących mikrobów w oceanie, zastosowaliśmy techniki fabrykacji metodą miękkiej litografii do opracowania dwóch urządzeń mikrofluidycznych, których użyliśmy do stworzenia (i) mikroskalowych plam nutrientów o wymiarach i charakterystyce dyfuzyjnej istotnych dla procesów oceanicznych oraz (ii) mikroskalowych wirów, z szybkościami ścinania odpowiadającymi tym oczekiwanym w oceanie. Urządzenia mikrofluidyczne te umożliwiły pierwszą bezpośrednią analizę pływania i zachowań chemotaktycznych mikrobów w heterogenicznym i dynamicznym krajobrazie morskim. Połączenie mikroskopii epifluorescencyjnej i fazowo-kontrastowej pozwala na bezpośrednie badanie wymiarów fizycznych i charakterystyki dyfuzyjnej plam nutrientów, przy jednoczesnej obserwacji agregacyjnej odpowiedzi na poziomie populacyjnym, a także zachowań pływających poszczególnych mikrobów. Eksperymenty te wykazały, że niektóre gatunki fitoplanktonu, bakterie heterotroficzne i protisty fagotroficzne potrafią sprawnie lokalizować i wykorzystywać dyfundujące mikroskalowe plamy zasobów w bardzo krótkim czasie. Wykazaliśmy również, że przy umiarkowanych szybkościach ścinania bakterie morskie są w stanie przeciwstawić się przepływowi i pływać w swoim środowisku samodzielnie. Jednak powyżej wysokiego progu ścinania bakterie ustawiają się wzdłuż przepływu ścinającego i w mniejszym stopniu są w stanie pływać bez zakłóceń wywołanych przez przepływ. Mikrofluidyka stanowi nowatorskie i niedrogie podejście do badania ekologii mikrobów wodnych i ze względu na możliwość dokładnego tworzenia realistycznych pól przepływu oraz gradientów podłoża w mikroskali, jest idealnie zastosowalna do badań zachowań mikrobów w najmniejszych skalach interakcji. Sugerujemy zatem, że mikrofluidyka stanowi wartościowe narzędzie do lepszego zrozumienia ekologii mikroorganizmów w oceanie.

Opisano proces wytwarzania kanałów mikroprzepływowych oraz ich zastosowanie w eksperymentach służących do badania zachowań chemotaktycznych morskich drobnoustrojów w niejednorodnym środowisku nutrientowym (patchy nutrient seascape) oraz zachowań pływackich bakterii w przepływie ścinającym.

Odpowiedź chemotaktyczna mikroorganizmów morskich na mikroskalowe warstwy składników odżywczych

Stopień, w jakim mikroby planktonowe mogą wykorzystywać mikroskalowe plamy zasobów, będzie miał istotne znaczenie dla trofodynamiki oceanicznej i ...

Cześć, nazywam się Marcos. Pracuję z profesorem Romanem Stalkerem na wydziale Inżynierii Lądowej i Środowiskowej w MIT i pokażę wam, jak wykonać mikrokanał przy użyciu techniki autofotografii. Aby zacząć, musimy zaprojektować maskę.Oto maska, która w zasadzie stanowi ostateczny projekt mikrokanału, który zamierzamy wykonać. Jest to projekt wtryskiwacza, dzięki któremu możemy stworzyć cienką warstwę substancji odżywczej, w której umieścimy pływające mikroorganizmy, aby zaobserwować chemotaksję. Ten kanał z boczną wnęką służy do generowania mikrowiru wewnątrz wnęki, co zostanie pokazane w późniejszym filmie. Po otrzymaniu maski przenosimy podłoża krzemowe do czystego pomieszczenia i umieszczamy je na szalkach Petriego. Udajemy się teraz do czystego pomieszczenia.Po wydrukowaniu i przygotowaniu maski przechodzimy do pomieszczenia czystego, aby przeprowadzić właściwe mikrofabrykowanie. Teraz wezmę kawałek czystego wafla krzemowego, który właśnie kupiłem, i chcę się upewnić, że jest on wyjątkowo czysty, używając do tego trzech następujących rozpuszczalników. Pierwszym krokiem jest oczyszczanie przy użyciu acetonu, a następnie niezwłocznie metanolu.Ostatnim krokiem jest użycie izopropano

chemotactic-response-marine-micro-organisms-to-micro-scale-nutrient

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Odpowiedź chemotaktyczna morskich mikroorganizmów na warstwy składników odżywczych w skali mikroskopijnej

Badania nad chemotaksją bakteryjną z wykorzystaniem mikroprzepływów – wywiad

Niniejszy protokół opisuje opracowanie urządzenia mikroprzepływowego do badania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń chemoefektorów.

Urządzenie mikroprzepływowe do ilościowego oznaczania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń

Tutaj prezentujemy kompleksowy protokół do oceny dostępności organicznych i nieorganicznych składników odżywczych oraz obfitości i struktury społeczności mikroorganizmów i wirusów w odległych środowiskach morskich.

Odkrywanie niewidzialnych graczy w oceanie - przewodnik terenowy po chemii wody i mikrobiologii morskiej

Tutaj opisujemy metody oceny odpowiedzi komórkowej na ostrą stymulację mechaniczną. W teście opartym na mikroskopii badamy lokalizację biosensorów znakowanych fluorescencyjnie po krótkiej stymulacji przepływem ścinającym. Badamy również biochemicznie aktywację różnych interesujących nas białek w odpowiedzi na ostrą stymulację mechaniczną.

Ocena odpowiedzi Dictyostelium discoideum na ostrą stymulację mechaniczną

Przedstawiono protokół do generowania dynamicznych krajobrazów chemicznych przez fotolizę w układach mikroprzepływowych i milifluidowych. Metodologia ta jest odpowiednia do badania różnych procesów biologicznych, w tym zachowania ruchliwego, pobierania składników odżywczych lub adaptacji mikroorganizmów do substancji chemicznych, zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji.

Generowanie kontrolowanych, dynamicznych krajobrazów chemicznych w celu badania zachowania mikroorganizmów

Prezentowany jest tutaj protokół testu chemotaksji in situ, niedawno opracowanego urządzenia mikroprzepływowego, które umożliwia badanie zachowania mikroorganizmów bezpośrednio w środowisku.

Test chemotaksji in situ w celu zbadania zachowania mikroorganizmów w ekosystemach wodnych

Przedstawiamy protokół urządzenia do ciągłej kultury mikrofluidalnej (MCCD), które umożliwia uprawę populacji bakteryjnych w stałych warunkach niskiego pożywienia (aż do setek nanomolarnych stężeń) lub czasowych fluktuacji składników odżywczych w skali minut.

Urządzenie mikrofluidyczne do ciągłej hodowli przeznaczone do badania Escherichia coli w warunkach niskich i wahających się stężeń składników odżywczych

Jared Leadbetter zabiera nas na spacer po naturze, ukazując różnorodność życia zamieszkującego jelito tylne termita – mikrośrodowisko zawierające 250 różnych gatunków, których nie spotkamy nigdzie indziej na Ziemi. Jared wykazuje, że symbioza występująca w tym systemie jest wielowarstwowa i obejmuje nie tylko relację między termitem a mieszkańcami jego jelit, ale także złożoną sieć zależności symbiotycznych pomiędzy samymi mikrobami jelitowymi.

Warstwy symbiozy – wizualizacja społeczności mikrobiologicznej jelita tylnego termitów

Inżynieria w skali mikro w biologii komórki

Przedstawiamy metodę generowania cDNA z mRNA pochodzącego ze środowiska. W ujęciu ogólnym, najpierw pobiera się całkowity RNA ze środowiska, selektywnie usuwa rRNA, selektywnie amplifikuje mRNA, a następnie sekwencjonuje cDNA zsyntetyzowane z wzbogaconej puli mRNA. Odzyskane sekwencje można poddać adnotacji przy użyciu standardowych technik bioinformatycznych w celu identyfikacji ekspresyjnych genów.

Analiza ekspresji genów w morskich społecznościach drobnoustrojów z wykorzystaniem transkryptomiki środowiskowej

Poznaj metody mikrofluidyczne do badania chemotaksji mikroorganizmów morskich i ich zachowań pływackich w warunkach przepływu ścinającego. Technika ta pozwala analizować ekologiczne interakcje w mikroskali.

Odpowiedź chemotaktyczna mikroorganizmów morskich na mikroskalowe warstwy składników odżywczych

Przeglądaj więcej filmów