Odpowiedź chemotaktyczna mikroorganizmów morskich na mikroskalowe warstwy składników odżywczych

Cześć, nazywam się Marcos. Pracuję z profesorem Romanem Stalkerem na wydziale Inżynierii Lądowej i Środowiskowej w MIT i pokażę wam, jak wykonać mikrokanał przy użyciu techniki autofotografii. Aby zacząć, musimy zaprojektować maskę.

Oto maska, która w zasadzie stanowi ostateczny projekt mikrokanału, który zamierzamy wykonać. Jest to projekt wtryskiwacza, dzięki któremu możemy stworzyć cienką warstwę substancji odżywczej, w której umieścimy pływające mikroorganizmy, aby zaobserwować chemotaksję. Ten kanał z boczną wnęką służy do generowania mikrowiru wewnątrz wnęki, co zostanie pokazane w późniejszym filmie. Po otrzymaniu maski przenosimy podłoża krzemowe do czystego pomieszczenia i umieszczamy je na szalkach Petriego. Udajemy się teraz do czystego pomieszczenia.

Po wydrukowaniu i przygotowaniu maski przechodzimy do pomieszczenia czystego, aby przeprowadzić właściwe mikrofabrykowanie. Teraz wezmę kawałek czystego wafla krzemowego, który właśnie kupiłem, i chcę się upewnić, że jest on wyjątkowo czysty, używając do tego trzech następujących rozpuszczalników. Pierwszym krokiem jest oczyszczanie przy użyciu acetonu, a następnie niezwłocznie metanolu.

Ostatnim krokiem jest użycie izopropanolu. Pracujemy na błyszczącej stronie wafla, która została przygotowana do powlekania. Teraz osuszę go strumieniem azotu.

Po wysuszeniu wafla, umieszczamy go w piecu o temperaturze około 130 °C i wypalamy przez 5 do 10 minut. W międzyczasie, oczekując na zakończenie wypalania wafla, możemy przygotować dwie płyty grzewcze, jedną ustawioną na 65 °C, a drugą na 95 °C. Po pięciu minutach wypalania wyjmujemy wafelek z pieca i pozostawiamy go w temperaturze pokojowej przez około pięć minut.

Następnie możemy przystąpić do powlekania rotacyjnego. Przed nalaniem fotorezystu należy upewnić się, że na powierzchni nie ma cząsteczek kurzu, dlatego używamy azotu do przedmuchania płytki. Ruch przedmuchiwania wykonujemy od środka na zewnątrz.

Teraz wyleję fotorezyst na powierzchnię tego wafla. Wylewamy ilość około 3 mL. Staraj się trzymać butelkę jak najniżej, aby podczas wylewania fotorezystu na wafel nie powstały pęcherzyki powietrza.

Teraz pozostawmy fotorezyst na waflu przez około minutę przed rozpoczęciem wirowania. Jak wspomniałem, przygotuję powłokę o grubości 100 µm. Ustawiamy całkowity czas wirowania na 55 sekund i możemy rozpocząć proces.

W pierwszej kolejności zwiększamy prędkość wirowania od zera do 500 RPM w ciągu pięciu sekund i pozwalamy na wirowanie przez około 10 sekund, aby upewnić się, że fotorezyst pokrywa cały podłoże, a następnie zwiększamy prędkość do 3000 RPM przez około siedem sekund i pozostawiamy do wirowania przez 30 sekund. Po pokryciu podłoża fotorezystem kładę je na płycie grzejnej i przeprowadzam wstępne wygrzewanie (soft bake) w temperaturze 65 °C przez pięć minut oraz w 95 °C przez 20 minut. Po zakończeniu wstępnego wygrzewania w 95 °C schładzamy próbkę do temperatury pokojowej, jednak wcześniej obniżamy temperaturę do 65 °C na około dwie do trzech minut, aby uniknąć gwałtownego spadku temperatury.

Następnie pozostawiamy próbkę w temperaturze pokojowej do wystudzenia przez około pięć minut. Teraz poddam ją naświetlaniu światłem UV, aby część naświetlona uległa utwardzeniu, a część nienaświetlona została później wypłukana. W tym etapie wykorzystujemy maskę; jak widać, maska składa się z dwóch części: części przezroczystej oraz części całkowicie nieprzezroczystej lub czarnej w tej konfiguracji.

Teraz nałożę tę maskę na pokryty wafer. Maska otrzymana z drukarni ma dwie strony. Jedna z nich to ta, na której znajduje się nadruk wykonany tuszem.

Jest to miejsce, które należy dopasować do wafla. Teraz naświetlę wafel przez maskę światłem UV. Ze względów bezpieczeństwa założę te okulary ochronne.

Czas ekspozycji zależy od stosowanego SUA oraz od grubości, którą zamierzamy uzyskać. Po naświetlaniu umieszczam podłoże krzemowe na płycie grzejnej o temperaturze 65°C i ponownie wygrzewam przez 5 minut, a następnie w temperaturze 95°C przez 20 minut. Przypominam, że czas wygrzewania różni się w zależności od pożądanej grubości oraz stosowanego rodzaju SUA.

W kolejnym kroku przeprowadzimy wywoływanie wafla. Wywoływanie polega na usunięciu niepożądanej części fotorezystu, tak aby na waflu pozostał jedynie obszar naświetlony. W celu wywołania wafla i wypłukania niepożądanej części fotorezystu używamy wywoływacza.

W tym przypadku jako wywoływacz stosuję octan pomonalu; wlewam ten rozpuszczalnik do zlewki, następnie umieszczam w niej wafelek i zanurzam go na około 10 minut. Ponownie zaznaczam, że czas ten różni się w zależności od grubości warstwy oraz stosowanego rozpuszczalnika. Po 10 minutach widać, że na wafelku pozostał pożądany projekt kanału, a wszystkie niepotrzebne fragmenty zostały wypłukane; teraz wystarczy go opłukać.

Używamy tego samego rozpuszczalnika, świeżej porcji, tego samego octanu polionowego i po prostu rozpylamy go na płytce krzemowej, aby ją opłukać. Na koniec, aby usunąć rozpuszczalnik, używamy izopropanolu i ponownie płuczemy płytkę. Następnie osuszamy ją strumieniem azotu.

W ten sposób otrzymaliśmy czysty wafelek z pożądanym wzorem. Nazywamy go matrycą. Teraz wracamy do laboratorium, aby wylać na nią PDMS i kontynuować pozostałe etapy procedury.

Wracamy zatem z pomieszczenia czystego z gotową matrycą, która w zasadzie stanowi formę dla naszego procesu. W następnym kroku wlejemy PDMS, czyli polimer, który następnie ulegnie utwardzeniu. Jak widać, po wylaniu polimeru na tę formę, na jego powierzchni powstaną rowki, a po połączeniu go z podstawką szklaną, sam polimer będzie tworzył kanał.

Teraz przygotujemy PDMS. Jest to PDMS, czyli polimer polidimetylosiloksan. A to jest utwardzacz.

Wleję utwardzacz do tego kubka, a PDMS do drugiego, a następnie wymieszam je w stosunku 1:10. Zazwyczaj używamy mieszadła, aby uzyskać jednorodną zawiesinę. Podczas mieszania powstaje wiele pęcherzyków powietrza, których obecność wskazuje, czy próbka została odpowiednio wymieszana.

Teraz, po wymieszaniu PDMS z czynnikiem sieciującym, jesteśmy gotowi do wylania tej mieszaniny na matrycę, którą jest płytka krzemowa. Aby upewnić się, że płytka nie przesunie się podczas wylewania, przymocowaliśmy ją za pomocą taśmy. Przed wylaniem mieszaniny PDMS na płytkę, chcemy oczyścić jej powierzchnię z kurzu, który mógł na nią opaść.

Włączamy kompresor, aby odpylić wafelek. Jak widać, w PDMS znajduje się wiele pęcherzyków powietrza. Usuniemy je, umieszczając próbkę w komorze próżniowej.

Proces odgazowywania w próżni trwa około 30 minut, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza. Po usunięciu pęcherzyków wyjmujemy próbkę i umieszczamy ją w piekarniku w temperaturze 65°C, gdzie wypiekamy ją przez co najmniej 12 godzin. Po upływie 12 godzin wafle będą gotowe do cięcia.

Użyję tego noża do przecięcia PDMS i oddzielenia go od wafla, a następnie użyję tego dziurkacza, aby wykonać otwory dla wlotów i wylotów rurek. Podczas cięcia należy prowadzić nóż aż do zetknięcia z waflem, ale nie należy wywierać zbyt dużego nacisku, aby nie uszkodzić wafla, i wycinać obszar wokół kanału. Teraz można go odkleić.

Widzą Państwo, że jest to kanał, który stanowi wzorzec z wafla krzemowego. Widać zatem, że są one identyczne. Ten wzorzec został teraz wygrawerowany w tym polimerze, czyli PDMS.

Po przyklejeniu go do płytki szklanej powstanie kanał do naszego eksperymentu. Kolejnym, istotnym krokiem jest wykonanie otworów, abyśmy mogli wprowadzić wloty i wyloty do mikrokanałów w PDMS. Użyliśmy taśmy klejącej, aby zakleić stronę kanału, czyli miejsce, w którym znajduje się rowek.

Przyczyną, dla której zaklejamy ten kanał taśmą klejącą, jest usunięcie wszystkich cząsteczek kurzu. Następnym krokiem jest wiązanie plazmowe. Przed procesem wiązania plazmowego, który przeprowadzimy w innym laboratorium, usuniemy taśmę i odsłonimy powierzchnię, którą chcemy połączyć — mianowicie tę powierzchnię oraz szkiełko przedmiotowe — a następnie poddamy je działaniu plazmy tlenowej, po czym je ze sobą połączymy, co spowoduje ich związanie.

Witajcie, nazywam się Justin Seymour i jestem pracownikiem naukowym na etapie postdoc w laboratorium Romana Stockera w MIT. Moje badania koncentrują się na ekologii mikroorganizmów, a konkretnie na tym, w jaki sposób mikroby morskie są w stanie odnajdywać skupiska pożywienia w oceanie. Wykorzystujemy techniki mikroprzepływowe, aby badać tego rodzaju wzorce.

Użyjemy kanału, którego wykonanie zaprezentował wcześniej Marcus, po przeprowadzeniu wiązania plazmowego. Możemy go teraz wykorzystać w eksperymencie mikroprzepływowym. Przed przystąpieniem do eksperymentu musimy przygotować podłoża, które zostaną w nim użyte.

W dzisiejszym eksperymencie przyjrzymy się temu, w jaki sposób morski fitoplankton donella tur electro jest w stanie odnaleźć mikroskalowe skupiska pokarmu. W tym przypadku jest to amon, który dostarczymy w stężeniu 100 µM. W tych doświadczeniach jesteśmy w stanie zwizualizować skupiska pokarmu poprzez dodanie barwnika fluorescencyjnego do dostarczanych składników odżywczych.

W tym celu stosujemy barwnik fluoresceinę. Tutaj pipetuję fluoresceinę do stężenia końcowego 100 µM do amonu, który służy nam jako substancja odżywcza. Następnie możemy zwizualizować tę substancję odżywczą pod mikroskopem fluorescencyjnym, co pozwala nam obserwować, jak dyfunduje obszar substancji odżywczych, a następnie analizować reakcję organizmów na ten obszar.

W eksperymentach mikroprzepływowych wykorzystujemy szklane strzykawki. Pierwszym krokiem jest dodanie podłoży oraz organizmów do strzykawek, których będziemy używać. Następnym etapem jest wprowadzenie rurek do układu mikroprzepływowego.

Czynność tę wykonujemy na stoliku mikroskopu. Umieszczamy kanał mikroprzepływowy na stoliku mikroskopu, a następnie wkładamy rurki do wlotów i wylotów. Następnie wstawiamy zbiornik na odpady i upewniamy się, że zbiornik jest wypełniony cieczą do połowy, aby rurka w zbiorniku była całkowicie zanurzona.

Pozwala to na utrzymanie stałego ciśnienia wewnątrz kanału. Następnie podłączamy strzykawki do rurek zasilających kanał mikroprzepływowy zawierający organizmy, którymi w tym przypadku są donella i lector, oraz podłoże odżywcze, którym w tym przypadku jest amoniak. Następnie ustawiamy mikroskop i sprawdzamy, czy kanał mikroprzepływowy znajduje się w odpowiedniej pozycji przed rozpoczęciem eksperymentów.

Gdy kanał znajduje się już na właściwej pozycji, przełączamy widok na kamerę, aby móc go z wizualizować na komputerze. Możemy teraz dokonać precyzyjniejszych ustawień ostrości i zlokalizować injektor, za pomocą którego podajemy składniki odżywcze. Składa się on z igły o średnicy 100 µm wbudowanej w kanał mikrofluidyczny.

Gradient substancji odżywczych możemy wytworzyć poprzez ich wstrzyknięcie. Przed rozpoczęciem eksperymentów musimy usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogły przedostać się do układu mikroprzepływowego. Robimy to za pomocą strzykawki wypełnionej w tym przypadku sztuczną wodą morską, którą możemy podłączyć do kanału mikroprzepływowego za pomocą zaworu.

Następnie przesuwamy tłok strzykawki, aby usunąć pęcherzyki powietrza z kanału. Możemy usunąć pęcherzyki na jeden z dwóch sposobów: albo wypychając je przez wylot za pomocą ciśnienia wytwarzanego przez strzykawkę, albo wymuszając ich przenikanie przez ścianki materiału PDMS, który jest przepuszczalny dla gazów. Po usunięciu pęcherzyków i przygotowaniu do rozpoczęcia eksperymentu, ustawiamy za pomocą pompy strzykawkowej odpowiednie prędkości przepływu dla iniekcji i materiałów wprowadzanych do kanału.

W tym przypadku stosujemy szybkość przepływu wynoszącą 2 µL/min, co odpowiada prędkości przepływu w kanale na poziomie 266 µm/s. Po ustawieniu odpowiedniej szybkości przepływu możemy rozpocząć eksperyment, uruchamiając przepływ, który tworzy wąski pas substancji odżywczych. Aby zwizualizować substancje odżywcze w momencie wstrzykiwania ich do kanału z punktu wtrysku, dodajemy do nich barwnik fluoresceinowy i obrazujemy go za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej APF. Następnie możemy badać dynamikę plam, zatrzymując przepływ w kanale mikroprzepływowym i obserwując pas substancji odżywczych dyfundujących lateralnie z ich pierwotnej pozycji.

Następnie przechodzimy do mikroskopii w kontraście fazowym, aby zwizualizować organizmy pływające w kanale i ocenić ich położenie względem plamy składników odżywczych. Możemy to osiągnąć, wykonując sekwencję klatek z częstotliwością 10 klatek na sekundę, co pozwala na stworzenie filmu, na którym widać te organizmy. Pływające organizmy możemy następnie zwizualizować, obliczając różnice czasowe między dwiema poszczególnymi klatkami poprzez odjęcie jednej klatki od poprzedniej, dzięki czemu widoczne są jedynie obiekty w ruchu.

Dzięki temu możemy usunąć szum tła z obrazów. Następnie rejestrujemy filmy w regularnych odstępach czasu przez 10 do 20 minut po początkowym uwolnieniu plamki składników odżywczych. Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu w celu nałożenia na siebie pozycji organizmów z jednej klatki sekwencji na drugą, możemy analizować zmiany pozycji tych organizmów, aby uzyskać informacje o ich trajektoriach pływania, z których następnie możemy wywieść bardziej szczegółowe dane statystyczne dotyczące pływania, w tym prędkości i zmian kierunku.

Dzięki tym eksperymentom mogliśmy po raz pierwszy bezpośrednio zbadać, w jaki sposób mikroby morskie są w stanie odnajdywać i wykorzystywać mikroskalowe plamy składników odżywczych. Może to mieć istotne znaczenie dla dynamiki troficznej i cyklu biogenów w oceanie. Nawiązując do słów Justina, sposób, w jaki mikroorganizmy, a w szczególności bakterie, wchodzą w interakcję z pożywieniem w oceanie, może mieć wielostronny wpływ na cykle biogeochemiczne.

Należy jednak pamiętać, że ocean nie jest nieruchomy; istnieją liczne warunki przepływu, takie jak turbulencje generowane przez wiatr lub na powierzchni. W skali mikroorganizmów to, czego one doświadczają, to nie tyle wielka turbulencja, co ścinanie, a najmniejsze pozostałości turbulencji znane są jako wiry Kolmogorowa. Tym, co staramy się tutaj zrobić, i co chcemy zbadać, jest określenie wpływu tych wirów na zachowanie pływaków mikroorganizmów.

Aby to osiągnąć, tworzymy kolejny kanał, wykorzystując masę, którą pokazałem wcześniej. W centrum znajduje się wnęka. Pozwolę sobie ją narysować, aby powiększyć schemat.

Oto jak wygląda kanał; jest to widok z góry. Wtłaczamy przepływ z lewej na prawą stronę, a w wyniku ścinania wewnątrz tej wnęki tworzy się obszar recyrkulacji. Wnęka ta stanowi reprezentację szczeliny w błonie. Możemy wykorzystać ten sam układ, który Justin wyjaśnił wcześniej; gdy pompa strzykawkowa jest wyłączona i nie uruchomiono przepływu, można zauważyć, że bakterie pływają wewnątrz tej wnęki w sposób niemalże losowy i swobodny.

Nie występuje preferowana orientacja. Film, który Państwo widzą, przedstawia różnicę czasu, co jest dokładnie tą samą techniką, której używa Justin. Zatem gdy przepływ jest bardzo szybki, jak widać, bakterie są wyprowadzane przez wir.

Trajektoria samych bakterii podąża wzdłuż linii prądu wiru. To, co jest w rzeczywistości bardziej interesujące, następuje po włączeniu pompy strzykawkowej, jednak prędkość nie jest zbyt wysoka.

Nie jest to zbyt szybkie, aby bakterie nie były w stanie z tym walczyć. Jednak w pewnym sensie w tym filmie wciąż można dostrzec podobieństwo do wiru. Z tego eksperymentu dowiedzieliśmy się, że w obecności bardzo silnego, turbulentnego przepływu bakterie są całkowicie zależne od niego i nie są w stanie mu się przeciwstawić.

Jednak w obszarze o niewielkiej turbulencji są one nadal w stanie pływać samodzielnie.