Modele eksperymentalne do badania fizjologii i patofizjologii nabłonka barwnikowego siatkówki

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie kultur ludzkiego płodowego pigmentu siatkówki, nabłonka lub RPE, które można wykorzystać jako model. W badaniach nad chorobami oczu u ludzi tkanki są pobierane od dawców w postaci nienaruszonych kul ocznych. Pierwszym krokiem zabiegu jest usunięcie dodatkowych mięśni i tkanki łącznej, a następnie otwarcie oka poprzez usunięcie rogówki i soczewki.

Oko jest traktowane dispą i spłaszczane, a następnie monowarstwa RPE jest odrywana od naczyniówki. Rozcięta. RPE wysiewa się do kolb i hoduje przez kilka tygodni, aż osiągną zlewające się monowarstwy i rozwiną pigment. Hodowle komórkowe są wykorzystywane w eksperymentach funkcjonalnych in vitro.

Udane eksperymenty in vitro są powtarzane w przedklinicznych modelach zwierzęcych, w których reakcje RPE mogą być lepiej oceniane w bardziej złożonym otoczeniu sygnalizacyjnym. Zademonstrowany tutaj model doprowadzi do lepszego zrozumienia fizjologii RPE i nowych interwencji terapeutycznych w leczeniu chorób oczu. Cześć, nazywam się Sheldon Miller.

Moje laboratorium znajduje się w Narodowym Instytucie Oka, który jest częścią National Institutes of Health na kampusie Bethesda Maryland. Cześć, jestem Arki z Miller Lab. Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę przygotowania pierwotnych kultur komórek nabłonka barwnikowego siatkówki ludzkiego płodu.

Ogniwa te zostaną przygotowane jako zlewające się monowarstwy, które można montować w zmodyfikowanych komorach do spawania. Wykorzystamy również te izolowane ludzkie komórki RPE do badań z zakresu biochemii i genetyki. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do tworzenia pierwotnych kultur komórek nabłonkowych w celu zbadania funkcji i regulacji procesów fizjologicznych i patofizjologicznych oraz opracowania klinicznych zwierzęcych modeli chorób.

Skupiamy się na nabłonku barwnikowym siatkówki lub RPE, który znajduje się w tylnej części oka, oddzielając siatkówkę nerwową i dopływ krwi do naczyniówki. Ten schematyczny schemat oka pokazuje położenie arkusza RPE w tylnej części oka, tuż obok fotoreceptorów. Wkładka pokazuje komórki siatkówki z fotoreceptorami po prawej stronie i komórkami zwojowymi po lewej.

Nabłonek ten jest metabolicznie niezwykle aktywny. Fagocytoza fotoreceptory w sposób ciągły w ciągu dobowym i przechowuje reis, mizes i transportuje wizualny pigment witaminę A do fotoreceptorów. W cyklu wzrokowym działa homeostatycznie, aby utrzymać skład chemiczny i objętość otaczających przestrzeni zewnątrzkomórkowych.

Krytyczną właściwością nabłonka jest jego polarność. Ciągłe asymetryczne dostarczanie białek do błony wierzchołkowej i podstawnej błony bocznej jest regulowanym procesem, który umożliwia nabłonkowi przeprowadzanie wektorowego ruchu metabolitów, jonów i płynu z jednej przestrzeni zewnątrzkomórkowej do drugiej. Ta aktywność pomaga nabłonkowi utrzymać zdrowie i integralność siatkówki nerwowej.

Preparat in vitro, który tutaj opisujemy, umożliwia analizę białek transportowych, receptorów i szlaków sygnałowych, które określają polarność i funkcję nabłonka przed rozpoczęciem sekcji. Przygotuj 12-dołkową płytkę w okapie z przepływem laminarnym z roztworami o temperaturze pokojowej. Każde oko wymaga jednej studzienki zawierającej 10 x antybiotykowego roztworu przeciwgrzybiczego, dwóch studzienek po jedną XPBS i jednej studzienki po dwie jednostki na mililitr przestrzeni dyskowej rozcieńczonej w 5% pożywce RPE z surowicą Napełnij wyściełane silikonem naczynie preparacyjne jednym X-H-B-S-S, s, odcedź płyn i przenieś każde oko do jednej studzienki z antybiotykowym roztworem przeciwgrzybiczym.

Inkubować przez trzy do pięciu minut w temperaturze pokojowej. Unikaj wywierania nadmiernego nacisku na gałkę oczną. Przepłukać oko w dwóch kolejnych studzienkach jednego XPBS, aby usunąć nadmiar antybiotyku.

Następnie za pomocą kleszczy przenieś go do naczynia preparacyjnego wypełnionego jednym X-H-B-S-S pod mikroskopem stereoskopowym do preparacji. Użyj nożyczek do tęczówki, aby usunąć nadmiar mięśni i tkanki łącznej wokół oka. Ustaw oko tak, aby rogówka była skierowana do góry.

Użyj dwóch sterylnych igieł o rozmiarze 27, aby przypiąć oko tkanką łączną bez uszkadzania twardówki silikonowej podkładki. W tej orientacji użyj bocznego noża do portu, aby wykonać nacięcie przez twardówkę. Cięcie powinno wynosić jedną trzecią odległości od równika oka do powierzchni przedniej.

Użyj nożyczek do tęczówki, aby kontynuować cięcie okrężnie wokół oka, aby uniknąć uszkodzenia pigmentu siatkówki. Nabłonek, w skrócie RPE przez przyciąganie siatkówki ciała szklistego. Użyj tych samych nożyczek, aby przeciąć ciało szkliste, aby oddzielić przednią klapkę oka od muszli ocznej.

Podnieś przednią część IOA i wyrzuć ją. Użyj kleszczy, aby przenieść otwarte oko do studni dys. Upewnij się, że w oku nie ma pęcherzyków powietrza. Filiżanka.

Inkubować przez 40 do 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Przenieś oko z dysmisji z powrotem do naczynia sekcyjnego, które zostało wypełnione świeżą temperaturą pokojową jeden X-H-B-S-S. Ustaw oko kubkiem skierowanym do góry i zabezpiecz je 2 igłami o rozmiarze 27.

Pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą cienkich kleszczyków delikatnie unieś częściowo oddzieloną siatkówkę nożyczkami do siatkówki. Odetnij siatkówkę od nerwu wzrokowego. Wyrzuć siatkówkę nożyczkami do tęczówki.

Wykonaj nacięcie od obwodu oka do nerwu wzrokowego. Przypnij oko za pomocą 5 igieł o rozmiarze 27. Aby rozciągnąć warstwę RPE, użyj nożyczek do siatkówki, aby wykonać okrągłe nacięcie wokół nerwu wzrokowego.

Oddzielenie warstwy RPE przełącza się na powiększenie 250x lub większe. Znajdź krawędź arkusza RPE wzdłuż cięcia wykonanego nożyczkami do tęczówki i blisko nerwu wzrokowego. Użyj dwóch par kleszczy, aby oddzielić błonę RPE i brus od warstwy tkanki naczyniówkowej.

Wypróbuj kilka obszarów wzdłuż krawędzi cięcia, aby znaleźć miejsce, w którym połączenie między RPE a naczyniówką jest najsłabsze. Delikatnie oderwij membranę z powrotem, aby całkowicie ją usunąć. Umieść arkusze RPE w 15-mililitrowej stożkowej rurce wypełnionej wyzwalaczami w temperaturze pokojowej w EDTA.

Gdy wszystkie arkusze zostaną zebrane, zakryj probówkę, inkubuj probówki w łaźni wodnej przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Energicznie potrząśnij rurką, aby rozdzielić RPE na małe grona. Brak zagęszczeń ciemnych komórek oznacza, że separacja jest całkowita.

Włóż rurkę z powrotem do łaźni wodnej na kolejne pięć minut. Użyj pasty, pipety i delikatnego ssania, aby usunąć wszelkie niestrawione resztki tkanek. Wiruj komórki w wirówce w temperaturze 280 5G przez cztery minuty.

Usunąć supernatant. Doprowadzić końcową objętość do dziewięciu mililitrów za pomocą średniej pipety 15% RPE w celu ponownego zawieszenia. Komórki pipetują trzy mililitry zawiesiny komórek do kolby o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych.

Dodaj dwa mililitry świeżej pożywki o temperaturze pokojowej 15% RPE. Komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. W miarę dojrzewania kultur ich pigmentacja wzrośnie po trzech do czterech tygodniach.

Udane kultury będą zlewające się i jednolicie, intensywnie zabarwione. Właśnie pokazaliśmy, jak przygotować pierwotne kultury RP u ludzkiego płodu. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.