Test tworzenia kuli: metoda in vitro do identyfikacji komórek macierzystych raka trzustki i terapii przesiewowych

- Gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC) zawiera podzbiór wyłącznie rakotwórczych komórek macierzystych raka (CSC). CSC są samoodnawialne, pluripotencjalne i zdolne do tworzenia nowotworów. Wyrażają białka antyapoptotyczne, a także zawierają geny oporności wielolekowej, dzięki czemu są odporne na chemioterapię. Aby zidentyfikować nowotworowe komórki macierzyste i zbadać wpływ leków na nie, przeprowadzamy test tworzenia kuli.

Najpierw zawiesić wyekstrahowane rakowe komórki macierzyste w żądanym pożywce do hodowli komórek. Następnie wysiewaj zawiesinę komórkową na płytkę wielodołkową i inkubuj przez żądany czas. Dodaj wymaganą ilość interesującego narkotyku do kilku studzienek i placebo w innych studzienkach jako kontrolę negatywną. Inkubuj komórki przez żądany czas. Rakowe komórki macierzyste tworzą kolonie w kształcie kuli w nieprzylegającym środowisku hodowlanym.

Po inkubacji odpipetować niewielką ilość zawiesiny komórek na hemocytometr i umieścić ją w automatycznym liczniku komórek. Teraz policz liczbę utworzonych kul. Komórki leczone lekami zwykle wykazują znaczne zmniejszenie rozmiaru i liczby kulek. W poniższym protokole przeprowadzimy test tworzenia kuli w celu identyfikacji komórek macierzystych raka trzustki i oceny wpływu metforminy.

- Aby ułatwić tworzenie się sfery nowotworowej w celu wzbogacenia rakowych komórek macierzystych, rozcieńczyć komórki w odpowiedniej objętości pożywki z rakowych komórek macierzystych do końcowego stężenia 2 razy 10 do 3 komórek na mililitr i schłodzić je na lodzie przez kilka minut. Następnie, po dodaniu 500 mikrolitrów PBS do pierwszego i ostatniego rzędu 24 płytek z ogniwami o bardzo niskim mocowaniu, ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety i zasiać 1 mililitr komórek na studzienkę do pustych dołków płytki.

Cztery studzienki komórkowe należy potraktować lekiem będącym przedmiotem zainteresowania i co najmniej cztery studzienki kontroli ujemnej nośnikiem. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez tydzień. Co drugi dzień dodawaj nowy zabieg lub pojazd do każdej z studni.

W 5 lub 7 dniu oceń liczbę utworzonych kul guza za pomocą automatycznego licznika komórek, który umożliwia identyfikację większych struktur. Do seryjnego pasażowania kulek nowotworowych, w dniu 7 należy użyć 40-mikrometrowego sitka do komórek, aby zebrać kulki. Następnie odwiruj kulki i inkubuj je w 1-mililitrze trypsyny przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zdysocjować osad na zawiesinę jednokomórkową. Następnie rozszerzaj komórki przez kolejne siedem dni, jak właśnie pokazano.