JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:25 min. • April 30th, 2023
- Morfologia substratu ma ogromny wpływ na zachowanie komórek nowotworowych i odpowiedzi przerzutowe. Dynamiczna sieć cytoszkieletu aktynowego zapewnia strukturalne wsparcie komórkom i pośredniczy w ruchu komórkowym. Duże kompleksy białkowe związane z błoną, zwane zrostami ogniskowymi, łączą cytoszkielet z macierzą zewnątrzkomórkową, ułatwiając rozprzestrzenianie się komórek.
Aby rozpocząć barwienie, weź hodowlę komórek rakowych i potraktuj je paraformaldehydem, aby utrwalić i przepuszczalność komórek. Teraz inkubuj komórki za pomocą odczynnika wzmacniającego sygnał zawierającego białka, aby przygotować komórki do zmniejszenia barwienia tła. Dodaj pierwotne przeciwciała anty-winkulinowe, które wiążą się z winkuliną, jednym z białek w ogniskowym kompleksie adhezyjnym.
Następnie inkubuj próbkę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z barwnikiem fluorescencyjnym, skierowanym przeciwko przeciwciału pierwszorzędowemu. Na koniec potraktuj komórki fluorescencyjnymi koniugatami falloidyny, które selektywnie wiążą się z filamentami aktynowymi cytoszkieletu. Obserwuj komórki pod konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym, aby zbadać ich sygnały fluorescencyjne.
Komórki o dobrze rozsianej morfologii wykazują zdefiniowane włókna aktynowe i mają wyraźne i wydłużone zrosty ogniskowe zawierające winkulinę. I odwrotnie, słabo rozproszone komórki nie mają zdefiniowanych włókien aktyny, ale wykazują punktowe zrosty ogniskowe zawierające winkulinę. W poniższym protokole zademonstrujemy test immunofluorescencyjny w celu zbadania cytoszkieletu i organizacji adhezji ogniskowej w komórkach pierwotnego raka jelita grubego.
- Przenieś podłoża, które mają być wybarwione immunologicznie, do okapu laminarnego i usuń pożywkę hodowlaną. Następnie przepłucz podłoża solą fizjologiczną buforowaną fosforanami lub PBS i utrwal komórki 4% paraformaldehydem w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Umyj podłoża PBS przez pięć minut, w sumie trzy razy. Następnie inkubuj substraty z 500 mikrolitrami wzmacniacza sygnału przez 30 minut przed spłukaniem PBS.
Następnie inkubować komórki z przeciwciałem monoklonalnym anty-winkulinowym w rozcieńczeniu od 1 do 250 w PBS przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Następnie myj podłoża PBS przez pięć minut, w sumie trzy razy. Inkubować próbki z drugorzędowym przeciwciałem przeciw mysim przeciwciałom Alexa Fluor 488 w rozcieńczeniu od 1 do 200 w PBS w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie ponownie umyj podłoża PBS przez pięć minut, w sumie trzy razy.
Aby uwidocznić strukturę F-aktyny, inkubuj komórki z koniugatami tetrametylorodaminy-falloidyny w stężeniu 50 mikrolitrów na mililitr przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie umyj podłoża jak poprzednio. Na koniec przystąp do obrazowania próbek za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.