Test organizacji cytoszkieletu i adhezji ogniskowej: metoda oparta na immunofluorescencji do badania adhezji komórek i rozprzestrzeniania się na podłożach

- Morfologia substratu ma ogromny wpływ na zachowanie komórek nowotworowych i odpowiedzi przerzutowe. Dynamiczna sieć cytoszkieletu aktynowego zapewnia strukturalne wsparcie komórkom i pośredniczy w ruchu komórkowym. Duże kompleksy białkowe związane z błoną, zwane zrostami ogniskowymi, łączą cytoszkielet z macierzą zewnątrzkomórkową, ułatwiając rozprzestrzenianie się komórek.

Aby rozpocząć barwienie, weź hodowlę komórek rakowych i potraktuj je paraformaldehydem, aby utrwalić i przepuszczalność komórek. Teraz inkubuj komórki za pomocą odczynnika wzmacniającego sygnał zawierającego białka, aby przygotować komórki do zmniejszenia barwienia tła. Dodaj pierwotne przeciwciała anty-winkulinowe, które wiążą się z winkuliną, jednym z białek w ogniskowym kompleksie adhezyjnym.

Następnie inkubuj próbkę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z barwnikiem fluorescencyjnym, skierowanym przeciwko przeciwciału pierwszorzędowemu. Na koniec potraktuj komórki fluorescencyjnymi koniugatami falloidyny, które selektywnie wiążą się z filamentami aktynowymi cytoszkieletu. Obserwuj komórki pod konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym, aby zbadać ich sygnały fluorescencyjne.

Komórki o dobrze rozsianej morfologii wykazują zdefiniowane włókna aktynowe i mają wyraźne i wydłużone zrosty ogniskowe zawierające winkulinę. I odwrotnie, słabo rozproszone komórki nie mają zdefiniowanych włókien aktyny, ale wykazują punktowe zrosty ogniskowe zawierające winkulinę. W poniższym protokole zademonstrujemy test immunofluorescencyjny w celu zbadania cytoszkieletu i organizacji adhezji ogniskowej w komórkach pierwotnego raka jelita grubego.

- Przenieś podłoża, które mają być wybarwione immunologicznie, do okapu laminarnego i usuń pożywkę hodowlaną. Następnie przepłucz podłoża solą fizjologiczną buforowaną fosforanami lub PBS i utrwal komórki 4% paraformaldehydem w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Umyj podłoża PBS przez pięć minut, w sumie trzy razy. Następnie inkubuj substraty z 500 mikrolitrami wzmacniacza sygnału przez 30 minut przed spłukaniem PBS.

Następnie inkubować komórki z przeciwciałem monoklonalnym anty-winkulinowym w rozcieńczeniu od 1 do 250 w PBS przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Następnie myj podłoża PBS przez pięć minut, w sumie trzy razy. Inkubować próbki z drugorzędowym przeciwciałem przeciw mysim przeciwciałom Alexa Fluor 488 w rozcieńczeniu od 1 do 200 w PBS w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie ponownie umyj podłoża PBS przez pięć minut, w sumie trzy razy.

Aby uwidocznić strukturę F-aktyny, inkubuj komórki z koniugatami tetrametylorodaminy-falloidyny w stężeniu 50 mikrolitrów na mililitr przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie umyj podłoża jak poprzednio. Na koniec przystąp do obrazowania próbek za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.

• Focal Adhesion - Protein complex facilitating cell-cytoskeleton and extracellular matrix connection.
• Vinculin - An integral protein within the focal adhesion complex.
• Actin Cytoskeleton - Provides structural support to cells and mediates cellular movement.
• Immunofluorescence - A staining method used to visualize components within a cell.
• Cell Spreading - The process related to cell movement and attachment involving focal adhesions and actin filaments.

• Introduce Focal Adhesion - Protein complex connecting actin cytoskeleton and extracellular matrix (e.g., vinculin).
• Key Concepts - Supporting cell's structural integrity, movement, and interactions (e.g., actin network).
• Underlying Mechanisms - Fundamental processes facilitating cell adhesion, spreading, and movement.
• Connect to Experiment - Using immunofluorescence to visualize actin and vinculin in cancer cells.

• What is focal adhesion and how does it facilitate cellular movement and interaction?
• How does vinculin function within the focal adhesion complex?
• How is immunofluorescence used to study the organization of actin cytoskeleton and focal adhesion?

• Practical Applications – Understanding cellular behavior and responses through immunofluorescence (e.g., cancer research).
• Industry Impact – Enhancing the understanding of cell morphology in biomedical sector (e.g., drug development).
• Societal Importance – Broadening comprehension of diseases trajectory and treatment options (e.g., cancer).
• Link to Scientific Advancements - Immunofluorescence marks a significant advancement in cell biology studies.