Test organizacji cytoszkieletu i adhezji ogniskowej: metoda oparta na immunofluorescencji do badania adhezji komórek i rozprzestrzeniania się na podłożach

- Morfologia substratu ma ogromny wpływ na zachowanie komórek nowotworowych i odpowiedzi przerzutowe. Dynamiczna sieć cytoszkieletu aktynowego zapewnia strukturalne wsparcie komórkom i pośredniczy w ruchu komórkowym. Duże kompleksy białkowe związane z błoną, zwane zrostami ogniskowymi, łączą cytoszkielet z macierzą zewnątrzkomórkową, ułatwiając rozprzestrzenianie się komórek.

Aby rozpocząć barwienie, weź hodowlę komórek rakowych i potraktuj je paraformaldehydem, aby utrwalić i przepuszczalność komórek. Teraz inkubuj komórki za pomocą odczynnika wzmacniającego sygnał zawierającego białka, aby przygotować komórki do zmniejszenia barwienia tła. Dodaj pierwotne przeciwciała anty-winkulinowe, które wiążą się z winkuliną, jednym z białek w ogniskowym kompleksie adhezyjnym.

Następnie inkubuj próbkę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z barwnikiem fluorescencyjnym, skierowanym przeciwko przeciwciału pierwszorzędowemu. Na koniec potraktuj komórki fluorescencyjnymi koniugatami falloidyny, które selektywnie wiążą się z filamentami aktynowymi cytoszkieletu. Obserwuj komórki pod konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym, aby zbadać ich sygnały fluorescencyjne.

Komórki o dobrze rozsiane