Izolacja keratynocytów ludzkiej skóry: metoda hodowli pierwotnych keratynocytów z próbek skóry

- Keratynocyty są najbardziej widocznymi komórkami obecnymi w naskórku, czyli najbardziej zewnętrznej warstwie skóry. Układają się w wiele warstw nad skórą właściwą, związaną z różnymi innymi typami komórek, takimi jak melanocyty, komórki dendrytyczne i komórki Merkla.

Aby wyizolować keratynocyty, zacznij od pobrania tkanki naskórka z ludzkiej skóry. Następnie potraktuj buforem do trawienia enzymatycznego. Enzymy w buforze degradują białka macierzy zewnątrzkomórkowej obecne w tkance naskórka, inicjując w ten sposób dysocjację komórek. Teraz dodaj odpowiednią pożywkę i mechanicznie rozerwij tkankę.

Aby uwolnić zdysocjowane komórki do zawiesiny, przefiltruj zawiesinę komórek naskórka przez sitko, aby usunąć wszelkie grudki komórek lub zanieczyszczenia. Odwirować w celu granulacji komórek naskórka i oddzielenia ich od supernatantu zawierającego enzym. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą preferowanej pożywki wzrostowej keratynocytów. Hoduj komórki przez żądany czas.

Podczas hodowli zoptymalizowane podłoża wzbogacają ekspansję keratynocytów, promując ich selektywny wzrost w stosunku do innych typów komórek naskórka. W poniższym protokole pokażemy izolację keratynocytów z tkanki skórnej dorosłego człowieka.

- Zbierz próbki skóry o wymiarach 10 na 15 centymetrów od zdrowych dorosłych ochotników poddawanych operacji plastycznej. Utrzymuj skórę w chłodzie, transportując próbki skóry w styropianowym pudełku zawierającym element chłodzący. W razie potrzeby przechowuj próbkę skóry w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc. Za pomocą wysterylizowanych nożyczek, skalpeli i kleszczy usuń tłuszcz spod skóry.

Następnie, za pomocą igieł, zapnij część skóry na sterylnej osłonie na wierzchu płytki. Suchym, wysterylizowanym gazikiem oczyść skórę. Następnie dodaj 70% etanolu na wysterylizowaną gazikę. Następnie za pomocą strugarki nożnej odetnij górną warstwę naskórka części skóry i przenieś ją na 9-centymetrową szalkę Petriego.

Następnie natychmiast dodaj 25 mililitrów wcześniej przygotowanego roztworu DPBS/trypsyna/glukozy na szalkę Petriego. Próbki należy inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Za pomocą pipety usuń roztwór DPBS/trypsyny/glukozy z szalki Petriego i dodaj 10 mililitrów RPMI-1640 plus 2% FBS, aby dezaktywować trypsynę.

Teraz za pomocą dwóch kleszczyków uwolnij komórki naskórka do podłoża, delikatnie zeskrobując i mieszając zarówno naskórkowy, jak i skórny przedział części skóry. Przefiltruj zawiesinę komórek naskórka przez metalowy filtr i zbierz filtrat do 50-mililitrowej probówki. Dodaj pozostałe skrawki skóry do 50-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów RPMI-1640 bez FBS i wiruj przez 10 sekund.

Przefiltruj tę zawiesinę przez metalowy filtr do 50-mililitrowej probówki zawierającej zawiesinę komórek naskórka. Następnie dodaj DPBS do całkowitej objętości 50 mililitrów. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 450 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie usuń supernatant i w zależności od wielkości osadu komórkowego ponownie zawieś osad komórek naskórka w około 10 mililitrach 37 stopni Celsjusza KSFM.

Stosując metodę barwienia błękitem trypanowym, policz komórki pod mikroskopem. Następnie do każdej kolby hodowlanej o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych przenieś 8 razy 10 do szóstej komórki wraz z 12 mililitrami KSFM o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Delikatnie wstrząsnąć kolbami hodowlanymi, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Inkubuj keratynocyty w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przy wilgotności 100% i 5% CO_{2 .} Zmień podłoże po dwóch dniach, a następnie 3 razy w tygodniu.