Dlaczego izolacja komórek CD133-dodatnich ma znaczenie dla walidacji celu w czerniaku?

Izolowanie komórek CD133-dodatnich umożliwia funkcjonalne badanie zdolności do tumorigenezy i samoodnawiania, które są kluczowe dla walidacji celów terapeutycznych w obrębie nowotworowych komórek macierzystych w czerniaku. Taka puryfikacja redukuje szum pochodzący z komórek niebędących komórkami macierzystymi, zwiększając wiarygodność testów zależności od danego celu. Metoda ta wspomaga ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie ekspresji CD133 z potencjałem inicjacji guza.

W jaki sposób magnetyczne sortowanie komórek (MACS) umożliwia izolację niezależnych zmiennych w badaniach nad komórkami macierzystymi?

Magnetyczna separacja komórek (MACS) izoluje frakcje CD133-dodatnie i ujemne poprzez znakowanie wyłącznie populacji docelowej biotynzylowanymi przeciwciałami i mikrokulkami, co pozwala na stworzenie zdefiniowanych grup eksperymentalnych. Taka izolacja zmiennej niezależnej (statusu CD133) umożliwia badaczom przypisanie różnic funkcjonalnych konkretnie wzbogaceniu w komórki macierzyste. Technika ta zapewnia, że obserwowany w testach fenotyp jest powiązany z izolowaną zmienną, a nie z populacjami mieszanymi.

Jakie pomiary ilościowych zmiennych zależnych są możliwe dzięki izolacji frakcji czerniaka zdefiniowanych przez CD133?

Wyizolowane frakcje umożliwiają pomiary ilościowe, takie jak wydajność tworzenia sfer, częstotliwość inicjowania guzów in vivo oraz różnicowe wskaźniki odpowiedzi na leki. Zmienne zależne te zapewniają numeryczne odczyty do porównywania fenotypów związanych z właściwościami macierzystości pomiędzy komórkami CD133-dodatnimi a ujemnymi. Metoda ta wspiera analizę statystyczną częstotliwości występowania komórek macierzystych oraz ich potencjału funkcjonalnego w różnych warunkach eksperymentalnych.

Dlaczego wymagania dotyczące replikacji są istotne dla izolacji wiarygodnych komórek czerniaka CD133-dodatnich i ujemnych?

Replikacja zapewnia, że izolacja pozwala na uzyskanie spójnej czystości i żywotności frakcji zdefiniowanych przez CD133 w różnych eksperymentach, co jest niezbędne dla powtarzalności testów funkcjonalnych. Zmienność w wydajności separacji mogłaby zaburzyć porównania między populacjami macierzystymi a niemacierzystymi, podważając wysiłki w zakresie walidacji celu. Zstandaryzowane protokoły z powtórzeniami pomagają w ustanowieniu solidnych progów czystości i odzysku w warunkach przemysłowych.

Jakie możliwości analizy statystycznej są wymagane przed wdrożeniem izolacji CD133 w procedurach dotyczących komórek macierzystych czerniaka?

Wdrożenie wymaga możliwości ilościowego określenia czystości i wydajności za pomocą cytometrii przepływowej lub podobnych metod w celu oceny wydajności separacji. Porównanie statystyczne testów funkcjonalnych (np. tworzenia guza, proliferacji) pomiędzy wyizolowanymi frakcjami wymaga narzędzi do obliczania istotności i wielkości efektu. Dostęp do oprogramowania do analizy danych z powtórzeń zapewnia, że zaobserwowane różnice w fenotypach komórek macierzystych są statystycznie istotne i nie wynikają ze zmienności procesu izolacji.

Izolacja komórek macierzystych czerniaka: metoda uzyskiwania dodatnich i ujemnych komórek czerniaka CD133 za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie

JoVE Encyclopedia of Experiments

Badania nad rakiem

0 wyświetleń • 5:40 min • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- Czerniak zawiera niewielką subpopulację nowotworowych komórek macierzystych posiadających zarówno zdolność do samoodnawiania, jak i inicjacji guza. CD133 lub Prominina-1, transbłonowa glikoproteina pentaspanu, jest jednym z kluczowych markerów wyrażanych przez komórki macierzyste raka czerniaka z przerzutami. Aby wyizolować komórki CD133-dodatnie, należy rozpocząć od zawieszenia pierwotnych komórek czerniaka w odpowiednim buforze.

Inkubować z odczynnikiem blokującym zawierającym białka, które blokują niespecyficzne miejsca wiązania na powierzchni komórki. Potraktuj komórki biotynylowanymi przeciwciałami pierwotnymi CD133. Przeciwciała te wiążą się z antygenami CD133 ulegającymi ekspresji na komórkach CD133-dodatnich. Teraz dodaj do zawiesiny mikrokulki magnetyczne antybiotyny. Inkubuj, aby mikrogranulki związały się z komórkami znakowanymi biotyną.

Na koniec przepuść inkubowaną zawiesinę przez kolumnę umieszczoną w polu magnetycznym. Pod wpływem magnetycznym wszystkie komórki CD133-dodatnie znakowane mikrogranulkami przyklejają się do kolumny, podczas gdy nieznakowane komórki przechodzą przez. Zbierz te nieoznakowane komórki CD133-ujemne. Usuń kolumnę z pola magnetycznego. Przepłukać zawartość za pomocą odpowiedniego buforu w celu elucji i zebrania komórek CD133-dodatnich.

W poniższym protokole pokażemy izolację CD133-dodatnich i ujemnych nowotworowych komórek macierzystych z hodowli pierwotnego czerniaka uzyskanej z tkanki nowotworowej. Umyj 80% zlewających się komórek wstępnie podgrzanym PBS. Dodać odpowiednią ilość Accutase i inkubować, aż komórki oderwą się od powierzchni hodowli. Zbierz komórki w pożywce Quantum 263 i przenieś do 50-mililitrowej probówki.

Wylicz komórki. Następnie odwiruj wymaganą liczbę komórek przez 5 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze od 4 do 8 stopni Celsjusza. Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić do 1 razy 10 do ósmych komórek w buforze MACS o pojemności 350 mikrolitrów. Dodaj 100 mikrolitrów odczynnika blokującego FcR i 50 mikrolitrów CD133/1-Biotyny. Dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Umyj komórki 10 mililitrami buforu MACS, a następnie odwiruj przez 5 minut w temperaturze 300 x g i 4 do 8 stopni Celsjusza. Całkowicie odessać supernatant. Po drugim praniu ponownie zawiesić osad komórkowy w 400 mikrolitrach buforu MACS. Dodaj 100 mikrolitrów mikrogranulek antybiotyny i dobrze wymieszaj. Inkubować w temperaturze od 4 do 8 stopni Celsjusza przez 15 minut.

W międzyczasie, aby przygotować separator MACS do separacji magnetycznej, należy przymocować QuadroMACS do MACS Separator Multi Stand. Włóż wymaganą liczbę kolumn LS ze skrzydłami kolumny do przodu w polu magnetycznym QuadroMACS. Umieść filtr wstępnej separacji w każdej kolumnie LS i odpowiednią rurkę zbiorczą pod każdą kolumną.

Przepłukać filtr i kolumnę 3 mililitrami buforu MACS i wyrzucić przepływ. Po umyciu komórek w buforze MACS, jak opisano wcześniej, ponownie zawiesić komórki w buforze MACS o pojemności 500 mikrolitrów i nałożyć zawiesinę komórek na przygotowaną kolumnę LS. Przemyć trzy razy 3 mililitrami buforu MACS na kolumnę. Zebrać całkowite ścieki z nieoznakowanej frakcji komórkowej CD133-ujemnej.

Następnie wyrzuć filtr wstępnej separacji, wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją na odpowiedniej probówce zbiorczej. Zastosuj 5 mililitrów bufora MACS. Natychmiast wypłukać oznakowane komórki CD133-dodatnie, mocno wciskając tłok do kolumny. Aby zwiększyć czystość frakcji ujemnej, nałóż zawiesinę komórek na nową zrównoważoną kolumnę LS i zbierz frakcję ujemną CD133 w ściekach.