JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 5:40 min. • April 30th, 2023
- Czerniak zawiera niewielką subpopulację nowotworowych komórek macierzystych posiadających zarówno zdolność do samoodnawiania, jak i inicjacji guza. CD133 lub Prominina-1, transbłonowa glikoproteina pentaspanu, jest jednym z kluczowych markerów wyrażanych przez komórki macierzyste raka czerniaka z przerzutami. Aby wyizolować komórki CD133-dodatnie, należy rozpocząć od zawieszenia pierwotnych komórek czerniaka w odpowiednim buforze.
Inkubować z odczynnikiem blokującym zawierającym białka, które blokują niespecyficzne miejsca wiązania na powierzchni komórki. Potraktuj komórki biotynylowanymi przeciwciałami pierwotnymi CD133. Przeciwciała te wiążą się z antygenami CD133 ulegającymi ekspresji na komórkach CD133-dodatnich. Teraz dodaj do zawiesiny mikrokulki magnetyczne antybiotyny. Inkubuj, aby mikrogranulki związały się z komórkami znakowanymi biotyną.
Na koniec przepuść inkubowaną zawiesinę przez kolumnę umieszczoną w polu magnetycznym. Pod wpływem magnetycznym wszystkie komórki CD133-dodatnie znakowane mikrogranulkami przyklejają się do kolumny, podczas gdy nieznakowane komórki przechodzą przez. Zbierz te nieoznakowane komórki CD133-ujemne. Usuń kolumnę z pola magnetycznego. Przepłukać zawartość za pomocą odpowiedniego buforu w celu elucji i zebrania komórek CD133-dodatnich.
W poniższym protokole pokażemy izolację CD133-dodatnich i ujemnych nowotworowych komórek macierzystych z hodowli pierwotnego czerniaka uzyskanej z tkanki nowotworowej. Umyj 80% zlewających się komórek wstępnie podgrzanym PBS. Dodać odpowiednią ilość Accutase i inkubować, aż komórki oderwą się od powierzchni hodowli. Zbierz komórki w pożywce Quantum 263 i przenieś do 50-mililitrowej probówki.
Wylicz komórki. Następnie odwiruj wymaganą liczbę komórek przez 5 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze od 4 do 8 stopni Celsjusza. Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić do 1 razy 10 do ósmych komórek w buforze MACS o pojemności 350 mikrolitrów. Dodaj 100 mikrolitrów odczynnika blokującego FcR i 50 mikrolitrów CD133/1-Biotyny. Dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 10 minut.
Umyj komórki 10 mililitrami buforu MACS, a następnie odwiruj przez 5 minut w temperaturze 300 x g i 4 do 8 stopni Celsjusza. Całkowicie odessać supernatant. Po drugim praniu ponownie zawiesić osad komórkowy w 400 mikrolitrach buforu MACS. Dodaj 100 mikrolitrów mikrogranulek antybiotyny i dobrze wymieszaj. Inkubować w temperaturze od 4 do 8 stopni Celsjusza przez 15 minut.
W międzyczasie, aby przygotować separator MACS do separacji magnetycznej, należy przymocować QuadroMACS do MACS Separator Multi Stand. Włóż wymaganą liczbę kolumn LS ze skrzydłami kolumny do przodu w polu magnetycznym QuadroMACS. Umieść filtr wstępnej separacji w każdej kolumnie LS i odpowiednią rurkę zbiorczą pod każdą kolumną.
Przepłukać filtr i kolumnę 3 mililitrami buforu MACS i wyrzucić przepływ. Po umyciu komórek w buforze MACS, jak opisano wcześniej, ponownie zawiesić komórki w buforze MACS o pojemności 500 mikrolitrów i nałożyć zawiesinę komórek na przygotowaną kolumnę LS. Przemyć trzy razy 3 mililitrami buforu MACS na kolumnę. Zebrać całkowite ścieki z nieoznakowanej frakcji komórkowej CD133-ujemnej.
Następnie wyrzuć filtr wstępnej separacji, wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją na odpowiedniej probówce zbiorczej. Zastosuj 5 mililitrów bufora MACS. Natychmiast wypłukać oznakowane komórki CD133-dodatnie, mocno wciskając tłok do kolumny. Aby zwiększyć czystość frakcji ujemnej, nałóż zawiesinę komórek na nową zrównoważoną kolumnę LS i zbierz frakcję ujemną CD133 w ściekach.