Mapowanie losów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przez tworzenie potworniaków
1 sierpnia 2010
Ukierunkowane różnicowanie hESC na konkretne komórki wzbudziło duże zainteresowanie medycyną regeneracyjną. Udostępniamy zwięzły, krok po kroku protokół określania losu in vivo wybranych hESC, który stanowi cenne narzędzie do charakteryzowania odczynników specyficznych tkankowo do terapii komórkowej.
Ogólnym celem tej procedury jest różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych in vivo i określenie ich specyficznych dla tkanek losów. Osiąga się to poprzez stworzenie najpierw osadu z genetycznie oznakowanych komórek będących przedmiotem zainteresowania. Drugim etapem zabiegu jest chirurgiczne umieszczenie osadu pod torebką nerkową myszy z obniżoną odpornością.
Trzecim etapem procedury jest umożliwienie różnicowania się osadu komórkowego przez osiem do 12 tygodni pod torebką nerki myszy. Ostatnim etapem procedury jest pobranie powstałego potworniaka, utrwalenie go formaliną i analiza losu oznakowanych komórek za pomocą immunohistochemii. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują, że oznakowane komórki rozwijają się w jeden lub więcej z trzech listków zarodkowych poprzez histologię i immunohistochemię powstałych potworniaków.
Cześć, nazywam się Carissa Ritner i pracuję w laboratorium dr Harolda Bernsteina w Instytucie Badań Sercowo-Naczyniowych na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę rozwoju potworniaków poprzez wszczepienie torebki nerkowej. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania różnicowania embrionalnych komórek macierzystych, zarówno po to, aby upewnić się, że każda linia, z którą pracujemy, może rozwinąć się w każdą z trzech listków rozrodczych, jak i przyciągnąć los genetycznie znakowanych komórek macierzystych in vivo.
Wszystkie procedury, które pokażemy, są wykonywane za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania UCSF. Ponadto wszystkie prace z ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi są wykonywane za zgodą Komitetu Nadzoru nad Komórkami Macierzystymi UCSF. Więc zacznijmy.
Aby przygotować hodowle ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, należy zapoznać się z częścią tekstową niniejszego protokołu. Aby uzyskać nuty w okapie z przepływem blaszki, potraktuj ludzkie embrionalne komórki macierzyste potraktowane inhibitorem skały jednym miligramem na mililitr kolagenazy cztery, inkubuj przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a 5% dwutlenek węgla odessaj kolagenazę cztery z dołka. Zastąp go jednym mililitrem DPBS o temperaturze pokojowej uzupełnionym 10% penicyliną streptomycyną.
Użyj podnośnika komórkowego z płaską głowicą, aby zeskrobać kolonie z płytki i przenieś 0,5 mililitra zawiesiny komórek do każdej z dwóch probówek mikrowirówek. Przepłukać studzienkę jednym mililitrem DPBS i przenieść 0,5 mililitra płukania do każdego impulsu probówki. Wiruj probówki przez 20 sekund przy 8 000 razy grawitacji, zasysaj supinat i ponownie zawieś każdą granulkę w 500 mikrolitrach świeżego DPBS po 100 mikrolitrach jednego miligrama na mililitr.
Fasi vulgaris lektyna w DPBS do każdej probówki, aby pomóc związać komórki ze sobą do przeszczepu. Inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Obracaj komórki pod kątem 8 000 razy grawitacji przez dwie minuty, aby wyrównać granulkę.
Obróć rury o 180 stopni w ich wgłębieniach wirnika. Następnie zakręć ponownie 8 000 razy. Grawitacja przez dwie minuty.
Ostrożnie zassaj nasinę SUP, pozostawiając granulki nienaruszone, aby usunąć granulki z tuby. Delikatnie odpipetować 200 mikrolitrów pożywki KSR obok krawędzi osadu, aż powoli się uniesie. Po usunięciu osadu należy natychmiast wciągnąć pożywkę do miliogniwa o wielkości 0,4 mikrometra.
Włóż do studzienki trzy mililitry KSR. Średni. Inkubować przez dwie godziny do nocy w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Umieść znieczuloną mysz z niedoborem odporności na poduszce grzewczej, aby zapobiec hipotermii.
Użyj nożyczek operacyjnych i kleszczyków do tęczówki, aby wykonać 2,5-centymetrowe nacięcie przez skórę równolegle do kręgosłupa. Ale tylko poza centrum. Wykonaj mniejsze nacięcie przez mięsień tuż pod żebrami i około jednego centymetra od kręgosłupa.
Nacięcie powinno być wystarczająco duże, aby przeciągnąć nerkę, ale na tyle małe, aby nerka nie wsunęła się z powrotem do jamy brzusznej bez użycia siły. Za pomocą pipety do makaronu, która została wciągnięta w kształt haczyka, delikatnie przeciągnij nerkę przez nacięcie mięśnia. Okresowo zwilżaj nerkę sterylnym DPBS, aby zapobiec wysychaniu delikatnej kapsułki za pomocą cienkich kleszczyków.
Delikatnie odciągnąć kapsułkę od nerki. Użyj nożyczek Venice Spring, aby wykonać dwumilimetrowe nacięcie w kapsułce. Na środku nerki włożyć pipetę do makaronu, która została przyciągnięta do bardzo cienkiej, stępionej sondy między kapsułką w nerce i delikatnie poruszać, aby powtórzyć małe kieszonkowe po drugiej stronie nerki, tak aby pozostały dwie kieszenie.
Po jednym na każdym biegunie nerki. Używanie końcówki do pipety o dużym otworze na jednorazowym transferze. Pipeta podnosi pojedynczą granulkę z wkładu milikomórkowego.
Weź jak najmniej podłoża, ponieważ nadmiar podłoża może zakłócać przenoszenie granulek. Użyj kleszczy, aby przytrzymać krawędź kieszeni na nerce. Delikatnie umieść granulkę obok otworu i użyj wyciągniętej sondy do pipety, aby wepchnąć ją do kieszeni w kierunku jednego bieguna nerki.
Umieść drugi śrut w kieszeni w kierunku przeciwległego bieguna. Ostrożnie umieść kapsułkę z powrotem na granulkach. Do zamknięcia kapsułki nie są konieczne żadne szwy.
Użyj haczykowatej pipety, aby delikatnie wepchnąć nerkę z powrotem do jamy brzusznej. Nacięcie mięśnia powinno być na tyle małe, aby można je było uszczelnić pojedynczym szwem jedwabnym. Zamknij skórę serią czterech do pięciu przerwanych szwów i pozwól zwierzęciu dojść do siebie po operacji przed powrotem do placówki dla zwierząt osiem do 12 tygodni po operacji.
Usuń potworniaka nerki i wszelkie otaczające torbiele z jamy brzusznej jako blok tkanki. Umieść cały blok tkanki akcyzowej w 50-mililitrowej tubie polipropylenowej zawierającej 10% buforowaną formułę. Pozwól potworniakowi utrwalić się w czterech stopniach Celsjusza przez noc.
Wyjmij potworniaka z rurki i umieść go na macie. Użyj skalpela, aby wyciąć wszelkie torbiele i jak najwięcej nerek, nie uszkadzając samego potworniaka. Większe potworniaki można przeciąć na pół, aby ułatwić rozwarstwienie i osadzenie.
Przetwarzaj potworniaka przy użyciu standardowej techniki utrwalania parafiny i sekcji do mocowania barwnika na szkiełkach w celu analizy i obrazowania. Szczegółowe informacje można znaleźć w uwagach w części tekstowej protokołu. Tutaj pokażemy Ci skrawki tkanek z typowego potworniaka.
Ten potworniak został wybarwiony hematem i eoiną w celu identyfikacji tkanek embrionalnych, reprezentatywnych dla wszystkich trzech listków zarodkowych i wykazuje powstającą strukturę cewy nerwowej reprezentatywną dla skóry wektorowej. W tej sekcji przedstawiono kolejny przykład skóry wektorowej, w tym przypadku prymitywnego nabłonka płaskonabłonkowego. Tutaj chrząstka otoczona torebką ze skondensowanej mezenchymy reprezentuje tkanki pochodzące z mezodermy embrionalnej.
Wreszcie, ta sekcja przedstawiająca strukturę jelita gruczołowego demonstruje końcową tkankę skórną w potworniaku, aby zmapować los genetycznie znakowanych komórek macierzystych, potworniaki zostały wysiane mieszaniną ludzkich embrionalnych komórek macierzystych typu dzikiego i CD 1 33 dodatnich. Komórki pochodne CD 1 33 dodatnie oznaczone strzałkami obserwowano w tkankach powstających z embrionalnego hederu, w szczególności w nabłonku nerwowym i powstających strukturach przypominających cewy nerwowe. Nazywam się Dr. Harold Bernstein.
Carissa właśnie pokazała, jak tworzyć potworniaki z hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, aby zapewnić test rozwoju in vivo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby zachować ostrożność z komórkami i obserwować technikę aseptyczną. Więc to wszystko.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) in vivo oraz następującą po tym analizę ich tkankowo swoistych przeznaczeń. Metoda polega na utworzeniu pelletu komórkowego z genetycznie znakowanych hESCs i jego implantacji pod torebkę nerki myszy z niedoborem odporności w celu różnicowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Medycyna regeneracyjna
- Biologia komórek macierzystych
- Różnicowanie in vivo
Wstęp
- Ludzkie embrionalne komórki macierzyste wykazują potencjał w terapiach regeneracyjnych.
- Zrozumienie losów hESC jest kluczowe dla opracowania terapii opartych na komórkach.
- Badania in vivo dostarczają informacji na temat różnicowania specyficznego dla tkanek.
- Zatwierdzenia etyczne są niezbędne w badaniach z wykorzystaniem ludzkich komórek i modeli zwierzęcych.
Cel badania
- Opracowanie protokołu śledzenia różnicowania hESC in vivo.
- Analiza losów genetycznie znakowanych hESC po implantacji.
- Zapewnienie wiarygodnej metody badania powstawania i różnicowania teratoma.
Zastosowane metody
- Przygotowanie kultur hESC i tworzenie pelletów komórkowych.
- Chirurgiczna implantacja pelletów komórkowych pod torebkę nerki myszy.
- Monitorowanie różnicowania przez okres od 8 do 12 tygodni.
- Pobieranie i analiza potworniaków z wykorzystaniem immunohistochemii.
Główne wyniki
- Zaobserwowano skuteczną różnicowanie hESC w różne warstwy zarodkowe.
- W organizmie powstały potworniaki, stanowiące model do badania różnicowania.
- Analiza immunohistochemiczna potwierdziła losy znakowanych komórek.
- Protokół może być wykorzystany do oceny potencjału różnicowania różnych linii hESC.
Wnioski
- Protokół stanowi cenne narzędzie dla badań nad medycyną regeneracyjną.
- Śledzenie hESCs in vivo pozwala na lepsze zrozumienie ich różnicowania.
- Wyniki potwierdzają potencjał hESCs w zastosowaniach terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia zespołom badawczo-rozwojowym w sektorze biofarmaceutycznym walidację potencjału różnicowania in vivo linii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, co stanowi krytyczny etap ograniczania ryzyka w przypadku kandydatów do zastosowania w medycynie regeneracyjnej. Dzięki śledzeniu komórek znakowanych genetycznie podczas tworzenia potworniaków, badacze zyskują pewność mechanistyczną w kwestii determinacji linii komórkowej i pluripotencji przed przejściem do etapu rozwoju przedklinicznego. Metoda ta wspomaga walidację celu i przygotowanie testów dla terapii opartych na komórkach macierzystych, zapewniając powtarzalne, potwierdzone histologicznie mapowanie losów komórek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotezy terapeutycznej poprzez potwierdzenie pluripotencji i różnicowania w kierunku trzech listków zarodkowych wybranych hESCs in vivo.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośrednią obserwację losu znakowanych komórek w tkankach pochodzących z potworniaków.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję linii komórkowych w portfelu badawczym poprzez identyfikację linii o wysokim potencjale różnicowania w wielorakie listki zarodkowe.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane linie hESC do dalszego przesiewania poprzez potwierdzenie zdolności do różnicowania in vivo.
- Powtarzalność: Standaryzuje tworzenie potworniaków poprzez przeszczepy agregatów komórkowych (pelletów) i model gospodarza z niedoborem odporności w celu uzyskania spójnych wyników.
- Wynik ilościowy: Umożliwia ilościowe określenie immunohistochemiczne udziału znakowanych komórek w pochodnych ektodermy, mezodermy i endodermy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Mapowanie losu zmodyfikowanych hESC w celu oceny ich przydatności do generowania konkretnych typów tkanek istotnych dla zastosowań terapeutycznych.
- Ciągłość translacyjna: Połączenie manipulacji in vitro z walidacją in vivo, co wspomaga decyzje o postępach w badaniach w oparciu o analizę ryzyka.
- Mechanistyczne ograniczanie ryzyka: Zmniejszenie niepewności co do potencjału różnicowania poprzez dostarczenie potwierdzenia losu komórek w oparciu o histologię przed rozpoczęciem inwestycji w badania przedkliniczne.
Integracja potoków i przepływów pracy
Test tworzenia potworniaków wpisuje się w proces odkrywania leków, wspierając wczesną identyfikację wiodących związków poprzez walidację potencjału komórek macierzystych przed znacznymi inwestycjami przedklinicznymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących manipulacji genetycznych poprzez umożliwienie mapowania losów znakowanych hESC in vivo.
- Przesiewy: Dostarcza gotowe do analizy linie komórkowe z potwierdzoną zdolnością do różnicowania, przeznaczone do przesiewów związków lub modulatorów.
- Analityka: Zapewnia odczyty immunohistochemiczne pozwalające na ilościowe określenie wkładu specyficznych linii komórkowych, co umożliwia analizę porównawczą warunków.
- Badania translacyjne: Łączy inżynierię komórek macierzystych z ciągłością przedkliniczną poprzez walidację tworzenia tkanek in vivo.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny jakości linii hESC oraz efektów modyfikacji genetycznych w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Przewidywalna pewność co do potencji komórek macierzystych, zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w odniesieniu do twierdzeń o różnicowaniu.
- Wartość operacyjna: Standaryzowany protokół chirurgicznego przeszczepiania i fiksacji zapewnia powtarzalność w różnych ośrodkach i przez różnych operatorów.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez walidację pluripotencji, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach programów regeneracyjnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację linii hESC z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o wykazany potencjał trzech linii zarodkowych in vivo.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w sterylnej hodowli komórek, technikach mikrochirurgicznych oraz immunohistochemii.
- Konieczny jest dostęp do modelu myszy z niedoborem odporności oraz do sterylnych pomieszczeń operacyjnych.
- Niezbędna jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie przygotowania pelletów, umieszczania przeszczepów i przetwarzania tkanek.
- Kwestie adaptacyjne obejmują kompatybilność znaczników genetycznych oraz stopień szczegółowości analizy teratoma w różnych systemach modelowych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują ramy czasowe wynoszące 8-12 tygodni oraz wymóg posiadania wiedzy histologicznej w celu interpretacji mapowania losów komórek.
