Name: Mapowanie losów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przez tworzenie potworniaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-01T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Poznaj metodę różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych in vivo poprzez tworzenie potworniaków pod torebką nerkową myszy. Technika ta umożliwia śledzenie losów genetycznie oznakowanych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez Kompleksowy Grant Badawczy z California Institute for Regenerative Medicine (RC-00104), grant Public Health Service (HL085377) z NHLBI oraz darowiznę z Pollin Foundation dla H.S.B.

<ol><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Hoof, D. V. an, D'Amour, K. A., German, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+insulin-producing+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).</li>
<li>Li, Z., Han, Z., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells+for+vascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human embryonic stem cell-derived endothelial cells for vascular diseases.</a> J Cell Biochem. 106, 194-194 (2009).</li>
<li>Safinia, N., Minger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of hepatocytes from human embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 481, 169-180 (2009).</li>
<li>Nury, D., Neri, T., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+and+cardiac+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells and cardiac cell fate.</a> J Cell Physiol. 218, 455-459 (2009).</li>
<li>Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Witmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+embryonic+stem-cell+lines+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts.</a> N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).</li>
<li>Schatten, G., Smith, J., Navara, C., Park, J. H., Pedersen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Culture of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 2, 455-463 (2005).</li>
<li>Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>King, F. W., Ritner, C., Liszewski, W., Kwan, H. C., Pedersen, A., Leavitt, A. D., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpopulations+of+human+embryonic+stem+cells+with+distinct+tissue-specific+fates+can+be+selected+from+pluripotent+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Subpopulations of human embryonic stem cells with distinct tissue-specific fates can be selected from pluripotent cultures.</a> Stem Cells Dev. 18, 1441-1450 (2009).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelio-mesenchymal+interactions+in+primordial+gland+structures+which+become+responsive+to+androgenic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Epithelio-mesenchymal interactions in primordial gland structures which become responsive to androgenic stimulation.</a> Anat Rec. 172, 179-195 (1972).</li>
<li>Kirsch, J. H., Klaus, J. A., Blizzard, K. K., Hurn, P. D., Murphy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pain+evaluation+and+response+to+buprenorphine+in+rats+subjected+to+sham+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp+Top+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Pain evaluation and response to buprenorphine in rats subjected to sham middle cerebral artery occlusion.</a> Contemp Top Lab Anim Sci. 41, 9-14 (2002).</li>
<li>Lee-Parritz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analgesia+for+rodent+experimental+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Isr+J+Vet+Med%22%5BJournal%5D)">Analgesia for rodent experimental surgery.</a> Isr J Vet Med. 62, 74-78 (2007).</li>
<li>Julou, L., Guyonnet, J. C., Ducrot, R., Pasquet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+pharmacological+and+toxicological+studies+on+ketoprofen%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatol+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Some pharmacological and toxicological studies on ketoprofen.</a> Rheumatol Rehabil. , Suppl 5-10. (1976).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Zaadaptowaliśmy wysoce wydajny test tworzenia potworniaków w celu mapowania losów różnicujących się hESC w środowisku in vivo. Niewielka liczba specjalnie wybranych hESC jest mieszana z nieróżnicującymi się hESC typu dzikiego oraz lektyną z Phaseolus vulgaris w celu utworzenia pelletu komórkowego. Jest on następnie przeszczepiany pod torebkę nerki u myszy z niedoborem odporności. Losy pierwotnie wybranych hESC można następnie określić za pomocą immunohistochemii (Rycina 5), zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami (9). Metoda ta stanowi cenne narzędzie do identyfikacji i wytwarzania odczynników specyficznych tkankowo dla terapii komórkowych.

<table><tbody><tr><td>2-metylo-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240486</td><td>Awertin</td></tr><tr><td>2,2,2-tribromo&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td>Avertin</td></tr><tr><td>nici jedwabne 4-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td>641G</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>233FB</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7536</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046-341</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>pinceta Dupont nr 5</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500233</td><td>Torebka nerkowa</td></tr><tr><td>Eozyna Y</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-658</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (kwalifikowana)</td><td>Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol Flex</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046344</td><td></td></tr><tr><td>Skrzela&amp;rsquo;Hematoksylina nr 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-204</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyk hemostatyczny, prosty</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501241</td><td>Chirurgia ogólna</td></tr><tr><td>Pinceta irydowa</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>15914</td><td>Chirurgia ogólna</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2012</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy KnockOut</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25020-081</td><td></td></tr><tr><td>inserty MILLICELL</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Niezbędne aminokwasy niepodstawowe</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501754</td><td>Chirurgia ogólna</td></tr><tr><td>Parafina (TissuePrep)</td><td>Fisher Scientific</td><td>8002-74-02</td><td></td></tr><tr><td>penicylina/streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>PHA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1668</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna wieprzowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6144</td><td></td></tr><tr><td>inhibitor ROCK</td><td>Calbiochem</td><td>Y-27632</td><td></td></tr><tr><td>myszy SCID beige</td><td>Charles River Laboratories</td><td>250</td><td></td></tr><tr><td>Scott&amp;rsquo;Płukanie</td><td>Fisher Scientific</td><td>6697-32</td><td>Ricca Chemicals</td></tr><tr><td>nożyczki sprężynowe Vannasa</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14003</td><td>Torebka nerkowa</td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr></tbody></table>

mapowanie losów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych poprzez tworzenie potworniaków

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESCs) posiadają nieograniczoną zdolność do samoodnawiania się oraz zdolność do różnicowania się w komórki pochodzące ze wszystkich trzech embrionalnych listków zarodkowych (1). Kierowana dyferencjacja hESCs w konkretne typy komórek wzbudziła duże zainteresowanie w dziedzinie medycyny regeneracyjnej (np. (2-5)), a metody określaniain vivolos wybranych lub zmodyfikowanych hESC jest kluczowy dla tego przedsięwzięcia. W tym celu zaadaptowaliśmy wysoce wydajny test tworzenia potworniaków. Niewielka liczba specyficznie wybranych hESC jest mieszana z nieróżnicowanymi hESC typu dzikiego oraz lektyną z Phaseolus vulgaris w celu utworzenia pelletu komórkowego. Następnie zostaje on przeszczepiony pod torebkę nerki u myszy z niedoborem odporności. Już 2,5 x 105Do utworzenia 16 cm potrzebne są hESC3teratoma w ciągu 8-12 tygodni. Los pierwotnie wybranych hESC można następnie określić za pomocą immunohistochemii. Metoda ta stanowi wartościowe narzędzie do charakteryzacji reagentów specyficznych dla tkanek w terapii komórkowej.

Kierowana różnicowanie hESC w konkretne komórki wzbudziło duże zainteresowanie w medycynie regeneracyjnej. Przedstawiamy zwięzły, szczegółowy protokół służący do określania losów wybranych hESC in vivo, który stanowi cenne narzędzie do charakteryzacji reagentów specyficznych dla tkanek w terapiach komórkowych.

Mapowanie losów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych poprzez tworzenie potworniaków

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) posiadają nieograniczoną zdolność do samoodnawiania oraz zdolność do różnicowania się w komórki pochodzące ze wszystkich trzech...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych in vivo oraz określenie ich tkankowo specyficznych przeznaczeń. Osiąga się to poprzez najpierw utworzenie granulatu z genetycznie oznakowanych komórek docelowych. Drugim krokiem procedury jest chirurgiczne umieszczenie granulatu pod torebką nerkową myszy z niedoborem odporności.Trzecim krokiem procedury jest pozostawienie pelletu komórkowego do różnicowania przez 8 do 12 tygodni pod torebką nerki myszy. Ostatnim krokiem procedury jest pobranie powstałego potworniaka, utrwalenie go w formalinie oraz analiza losów znakowanych komórek za pomocą immunohistochemii. W rezultacie, dzięki badaniu histologicznemu i immunohistochemicznemu powstałych potworniaków, można uzyskać wyniki wykazujące, że znakowane komórki rozwinęły się w jedną lub więcej z trzech warstw zarodkowych.Witam, jestem Carissa Ritner z laboratorium dr. Harolda Bernsteina w Instytucie Badań Sercowo-Naczyniowych na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco. Dzisiaj przedstawimy procedurę opracowania teratoma poprzez przeszczep do torebki nerki. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu badania różnicowania embrionalnych komórek macierzystych, zarówno aby upewnić się, że każda linia, z którą pracujemy, może przekształcić się w każdą z trzech warstw zarodkowych, jak i aby śledzić losy genetycznie oznakowanych komórek macierzystych in vivo.Wszystkie prezentowane przez nas procedury zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco (UCSF). Ponadto wszystkie prace z ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi są wykonywane za zgodą Komitetu Nadzoru nad Badaniami nad Komórkami Macierzystymi UCSF. Przejdźmy zatem do części praktycznej.W celu przygotowania kultur ludzkich embrionalnych komórek macierzystych należy zapoznać się z częścią tekstową niniejszego protokołu. Pracując w laminarnym komorze z przepływem powietrza, kultury ludzkich embrionalnych komórek macierzystych traktowane inhibitorem ROCK należy inkubować z kolagenazą IV w stężeniu 1 mg/mL przez 5 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2, a następnie odessać kolagenazę IV z dołka. Należy zastąpić ją 1 mL DPBS o temperaturze pokojowej z dodatkiem 10% penicyliny i streptomycyny.Używając skrobaka do komórek z płaską końcówką, zeskrob kolonie z płytki i przenieś 0,5 mililitra zawiesiny komórkowej do każdej z dwóch probówek do mikrocentryfugi. Przepłucz studzienkę jednym mililitrem DPBS i przenieś 0,5 mililitra płukanki do każdej probówki. Wiruj probówki przez 20 sekund przy 8 000 ×g, odessij nadsącz i resuspenduj każdy osad w 500 mikrolitrach świeżego DPBS oraz 100 mikrolitrach roztworu o stężeniu jeden miligram na mililitr.Do każdej probówki dodaj lektynę z Fasi vulgaris w DPBS, aby wspomóc agregację komórek przed transplantacją. Inkubuj zawiesinę komórkową w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Wirować komórki przy 8, 000 ×g przez dwie minuty w celu ujednolicenia osadu.Obrócić probówki o 180 stopni w gniazdach wirówki. Następnie ponownie wirować przy 8 000 ×g przez dwie minuty.Ostrożnie odessaj supernatant, pozostawiając osady nienaruszone, aby oddzielić je od ścianek probówki. Delikatnie nanieś pipetą 200 µL medium KSR obok krawędzi osadu, aż zacznie on powoli odrywać się od dna. Gdy tylko osad zostanie oddzielony, natychmiast przenieś medium wraz z nim do filtrystrycentryfugi (milli-cell) o rozmiarze porów 0,4 µm.Wprowadzić do studzienki zawierającej trzy mililitry KSR.Medium. Inkubować od dwóch godzin do nocy w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Umieścić znieczuczoną mysz z niedoborem odporności na podkładkę grzewczą, aby zapobiec hipotermii.Za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety irydowej wykonaj nacięcie skóry o długości 2,5 centymetra równolegle do kręgosłupa, lecz lekko przesunięte z centrum. Wykonaj mniejsze nacięcie przez mięśnie tuż poniżej żeber i w odległości około jednego centymetra od kręgosłupa.Nacięcie powinno być na tyle duże, aby można było wyciągnąć nerkę, ale na tyle małe, aby nerka nie wślizgnęła się z powrotem do jamy brzusznej bez użycia siły. Używając pipety pasterskiej, którą uformowano w kształt tępego haka, delikatnie wyciągnij nerkę przez nacięcie w mięśniu. Okresowo nawilżaj nerkę sterylnym DPBS za pomocą precyzyjnej pincety, aby zapobiec wysychaniu delikatnej torebki.Delikatnie odciągnij torebkę od nerki. Za pomocą nożyczek Venice Spring wykonaj dwumilimetrowe nacięcie w torebce. W centralnej części nerki, pomiędzy torebką a nerką, wprowadź pipetę pasterską, która została wyciągnięta do postaci bardzo cienkiej, stępionej sondy, i delikatnie poruszaj nią, aby utworzyć małą kieszonkę; powtórz tę czynność po drugiej stronie nerki, tak aby powstały dwie kieszonki.Po jednej na każdym biegunie nerki. Używając końcówki pipety o dużej średnicy na jednorazowym transferze, pobierz pojedynczy pellet z wkładki milli cell.Pobrać jak najmniejszą ilość pożywki, ponieważ jej nadmiar może utrudnić transfer pelletu. Za pomocą pęsety unieść krawędź kieszonki w nerce. Delikatnie umieścić pellet obok otworu, a następnie za pomocą dociągniętej końcówki pipety wprowadzić go do kieszonki w kierunku jednego z biegunów nerki.Umieść drugi pellet w kieszeni skierowanej w stronę przeciwległego bieguna. Ostrożnie nałóż kapsułę z powrotem na pellety. Zamknięcie kapsuły nie wymaga zastosowania szwów.Za pomocą zakrzywionej pipety ostrożnie przesuń nerkę z powrotem do jamy brzusznej. Nacięcie mięśni powinno być na tyle małe, aby można je było zamknąć pojedynczym szwem jedwabnym. Zamknij skórę serią od czterech do pięciu szwów przerywanych i pozwól zwierzęciu dojść do siebie po operacji przed powrotem do pomieszczenia dla zwierząt od 8 do 12 tygodni po zabiegu.Usunąć teratoma nerki oraz wszelkie otaczające go torbiele z jamy brzusznej w postaci jednego bloku tkanki. Cały blok wyciętej tkanki umieścić w 50 mililitrowej probówce z polipropylenu zawierającej 10% buforowaną formalinę. Pozostawić teratoma do utrwalenia w temperaturze czterech stopni Celsius overnight.Wyjmij potworniaka z probówki i umieść go na macie. Za pomocą skalpela wypreparuj wszelkie torbiele oraz jak największą część nerki, uważając, aby nie uszkodzić samego potworniaka. Większe potworniaki można przekroić na pół, aby ułatwić dyssekcję i zatopienie w parafinie.Przetwórz potworniaka przy użyciu standardowej techniki utrwalania w parafinie, a następnie zabarw i zamontuj przekroje na szkiełkach w celu przeprowadzenia analizy i obrazowania. Szczegóły znajdują się w uwagach w części tekstowej protokołu. Poniżej zaprezentujemy przekroje tkankowe z typowego potworniaka.Ten potworniak został zabarwiony hematoksyliną i eozyną w celu zidentyfikowania tkanek embrionalnych, reprezentujących wszystkie trzy listki zarodkowe, i wykazuje pierwotną strukturę cewy nerwowej będącą przykładem ectodermy. Ten przekrój stanowi kolejny przykład ectodermy, w tym przypadku prymitywnego nabłonka płaskiego. Tutaj chrząstka otoczona torebką z zagęszczonego mezenchymy reprezentuje tkanki pochodzące z mezodermy embrionalnej.Na koniec, ten przekrój przedstawiający gruczołową strukturę jelita obrazuje tkankę endodermy wewnątrz potworniaka. Aby prześledzić losy genetycznie oznakowanych komórek macierzystych, potworniaki zasiedlono mieszaniną ludzkich embrionalnych komórek macierzystych typu dzikiego oraz komórek pozytywnych pod kątem CD 1 33. Komórki pochodne pozytywne pod kątem CD 1 33, wskazane strzałkami, zaobserwowano w tkankach wywodzących się z ektodermy embrionalnej, a konkretnie w neuroepithelium i powstających strukturach przypominających cewkę nerwową. Jestem dr Haroldem Bernsteinem.Carissa właśnie pokazała Państwu, jak tworzyć potworniaki z hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, aby uzyskać test rozwoju in vivo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o ostrożności w obchodzeniu się z komórkami oraz o zachowaniu zasad aseptyki. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

fate-mapping-of-human-embryonic-stem-cells-by-teratoma-formation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Odwzorowanie losu ludzkich komórek macierzystych zarodkowych poprzez tworzenie teratomu

Transplantacja komórek u rybek zebrafish umożliwia połączenie genetyki i embriologii w celu generowania chimer specyficznych dla danej tkanki. Niniejsze wideo demonstruje transplantacje komórek na etapie gastruli, które pozwoliły naszemu laboratorium zbadać role populacji astroglialnych oraz specyficznych sygnałów prowadzących podczas formowania się spoiw w przedmózgowiu.

Chimery embrionalne z ukierunkowaniem tkankowym: transplantacja komórek gastruli rybki danio-pręgawki

Genetyczne mapowanie losu indukowalne (GIFM) pozwala na znakowanie i śledzenie komórek z precyzyjną kontrolą przestrzenną i czasową in vivo oraz wyjaśnia, w jaki sposób komórki z konkretnej linii genetycznej przyczyniają się do tworzenia tkanek w rozwoju i u dorosłych osobników. Przedstawione tutaj techniki umożliwiają mapowanie losu zarodków myszy w stadium E12.5 na potrzeby analizy epifluorescencyjnej i analizy eksplantatów.

Praktyczne podejście do genetycznego indukowalnego mapowania losów: wizualny przewodnik po znakowaniu i śledzeniu komórek in vivo

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSCs) mają potencjał do leczenia wielu różnych chorób. Użyteczność tych komórek wynika z faktu, że mogą one różnicować się w każdy typ komórek w organizmie. W niniejszym materiale opisujemy test teratomiowy, który służy do wykazania pluripotencji hPSCs.

Generowanie potworniaków w torebce jądra

Los pojedynczej komórki embrionalnej może być determinowany przez cząsteczki dziedziczne i/lub sygnały pochodzące od sąsiednich komórek. Wykorzystując mapy losów embrionu Xenopus w stadium podziałów, można zidentyfikować pojedyncze blastomery w celu ich izolowanej hodowli, aby ocenić wpływ cząsteczek dziedzicznych w stosunku do oddziaływań międzykomórkowych.

Eksplanty blastomerów do badania determinacji losów komórek podczas rozwoju embrionalnego

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają wrodzoną zdolność do różnicowania się i samoorganizacji w odrębne wzorce tkankowe; chociaż wymaga to prezentacji przestrzennych gradientów środowiskowych. Przedstawiamy mikrowzorce szablonowe jako prostą i solidną metodę generowania gradientów biochemicznych i mechanicznych w celu kontrolowania wzorców różnicowania hPSC.

Szablonowe mikrowzorce ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badania przestrzennej organizacji losów różnicowania

W tym badaniu generujemy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z komórek płynu owodniowego myszy, używając systemu transpozonów nieopartego na wirusach.

Produkcja pluripotencjalnych komórek macierzystych z komórek płynu owodniowego myszy przy użyciu systemu transpozonów

Ten protokół opisuje przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i błonowych mezenchymalnych komórek macierzystych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu nieintegrującego podejścia epizodycznego w pełni zdefiniowanych chemicznie warunkach. Szczegółowo opisano procedury ekstrakcji, hodowli, przeprogramowania i charakterystyki powstałych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą rygorystycznych metod.

Przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i komórek błonowych do pluripotencji w warunkach wolnych od ksenotypów

Ligandy macierzy zewnątrzkomórkowej mogą być wzorowane na hydrożelach poliakrylamidowych, aby umożliwić hodowlę ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w zamkniętych koloniach na podatnych podłożach. Metodę tę można połączyć z mikroskopią sił trakcyjnych i testami biochemicznymi w celu zbadania wzajemnych zależności między geometrią tkanki, siłami generowanymi przez komórkę i specyfikacją losu.

Modelowanie geometrii kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na podatnych podłożach w celu kontrolowania mechaniki na poziomie tkankowym

W tym badaniu przedstawiamy test in vitro komórkowy do identyfikacji teratogenicznych substancji chemicznych. Dynamikę sygnalizacji czynników wzrostu fibroblastów (FGF)/współczynnika odpowiedzi surowicy (SRF) mierzono w ludzkich indukowanych pluripotentnych komórkach macierzystych (iPS), a ryzyko teratogenności oceniano poprzez kwantyfikację chemicznego zakłócenia tego szlaku sygnalizacyjnego.<br...

Testy toksyczności rozwojowej oparte na monitorowaniu sygnału czynnika wzrostu fibroblastów w ludzkich indukowanych pluripotentnych komórkach macierzystych w czasie rzeczywistym

Rozprzestrzenianie się człowieka zarodkowych komórek macierzystych (ES) Cells

Poznaj metodę różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych in vivo poprzez tworzenie potworniaków pod torebką nerkową myszy. Technika ta umożliwia śledzenie losów genetycznie oznakowanych komórek.

Mapowanie losów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych poprzez tworzenie potworniaków

Przeglądaj więcej filmów