Transgeneza wektorowa miniCoopR: technika badań przesiewowych genów indukujących czerniaka w modelu guza danio pręgowanego

- U danio pręgowanego czerniak powstaje w wyniku złośliwej transformacji melanocytów - komórek wytwarzających melaninę. Aby zbadać początek czerniaka, użyj podatnego na czerniaka i niedoboru melanocytów transgenicznego modelu danio pręgowanego. W tym modelu brakuje melanocytów z powodu mutacji powodującej utratę funkcji w specyficznym dla melanocytów promotorze mitfa.

Zacznij od pobrania jednokomórkowego zarodka tego transgenicznego modelu na płytce agarowej. Wspólnie wstrzyknąć do zarodka mieszaninę zawierającą wektor miniCoopR oparty na transpozonach i mRNA enzymu transpozazy. Wektor zawiera kasetę genów, zawierającą minigen mitfa przenoszący promotor sprzężony z genem kandydującym umieszczonym między dwoma elementami transpozonu.

Współwstrzykiwane mRNA kodują białka transpozazy. Białka te działają na elementy transpozonu i katalizują wycięcie kasety z wektora miniCoopR, a następnie jego integrację z genomowym DNA zarodka. Następnie promotor kasety steruje ekspresją zarówno genu mitfa, jak i genu kandydującego.

Gen mitfa wspomaga ratowanie i rozwój melanocytów, podczas gdy gen kandydujący, jeśli jest onkogenny, indukuje początek czerniaka. Przesiewaj rozwiniętego danio pręgowanego. U ryb transgenicznych z uratowanymi melanocytami rozwija się pigmentacja melaniny, podczas gdy u ryb z czerniakiem pojawiają się wypukłe zmiany barwnikowe.

W poniższym protokole pokażemy badania przesiewowe modyfikatorów początku czerniaka przy użyciu wektorów miniCoopR w transgenicznych modelach guza danio pręgowanego.

- Aby wygenerować konstrukty do wstrzyknięcia, zacznij od stworzenia klonów środkowego wejścia Gateway przez PCR, amplifikując pełnowymiarową otwartą ramkę odczytu genów będących przedmiotem zainteresowania i rekombinując do pDONR221. Następnie użyj technologii Multisite Gateway, aby zrekombinować specyficzny dla melanocytów promotor mitfa, gen zainteresowania i sygnał poliadenylacji w wektor miniCoopR, aby umieścić interesujące geny pod kontrolą promotora mitfa.

Wstrzyknij 25 pikogramów każdego klonu wraz z 25 pikogramami mRNA transpozazy Tol2 do jednokomórkowych, transgenicznych, potrójnie homozygotycznych zarodków danio pręgowanego. Zwierzęta ze mutacją mitfa-BRAF-p53 mają niedobór melanocytów i są podatne na transformację i tworzenie czerniaka. Wraz z genem będącym przedmiotem zainteresowania, wektor miniCoopR zawiera ratujący minigen mitfa. Tak więc, pomyślnie wstrzyknięte zwierzęta rozwiną uratowane melanocyty, które wyrażają interesujący gen.

Inkubować wstrzyknięte zarodki w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza. Po 24 godzinach od zapłodnienia, czyli hpf, usuń wszelkie martwe zarodki. Po 72 godzinach od zapłodnienia, używając mikroskopu preparacyjnego w świetle padającym na białym tle, wybierz transgeniczne zwierzęta z uratowanymi melanocytami.

Gdy zwierzęta osiągną 4 dni po zapłodnieniu, przenieś je do 3-litrowych zbiorników w odchowalni danio pręgowanego. W wieku 2 miesięcy wybierz zwierzęta, których co najmniej jeden obszar ratowania melanocytów jest większy niż 4 milimetry kwadratowe. Co tydzień badaj wybrane zwierzęta pod kątem obecności guzów. Wyizoluj zwierzęta z nowotworem do badań.

Narysuj krzywe przeżycia wolnego od czerniaka z wiekiem i tygodniami na odciętych oraz procentem przeżycia wolnego od czerniaka na rzędnej. Porównaj zwierzęta z melanocytami, które wyrażają interesujący gen, ze zwierzętami kontrolnymi, które wyrażają EGFP w melanocytach. Użyj testu logarytmiczno-szeregowego, aby określić, czy dwie krzywe różnią się statystycznie.