Name: Wybór aptamerów bez podkładów przy użyciu losowej biblioteki DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Poznaj metodę selekcji aptamerów bez podkładów wiążących białko S100B z losowej biblioteki DNA. Protokół SELEX eliminuje interferencję sekwencji stałych, zwiększając swoistość.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Craigowi Paulowi z Microarray Core Facility za pomoc. Praca ta była finansowana z grantu NIH/NCI nr #CA118591 w ramach programu IMAT. SLD dziękuje również za wsparcie finansowe w ramach stypendium Pennsylvania Space Grant Consortium. Publikacja ta była również wspierana przez Pennsylvania State University Materials Research Institute Nano Fabrication Network oraz National Science Foundation w ramach umowy o współpracy nr 0335765, National Nanotechnology Infrastructure Network, we współpracy z Cornell University.

<ol><li>Kulbachinskiy, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+selection+of+aptamers+to+protein+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Moscow%29%22%5BJournal%5D)">Methods for selection of aptamers to protein targets.</a> Biochemistry (Moscow). 72, 1505-1518 (2006).</li>
<li>Mairal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers%3A+molecular+tools+for+analytical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Aptamers: molecular tools for analytical applications.</a> Anal Bioanal Chem. 390, 989-1007 (2008).</li>
<li>Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SELEX+--+A+%28r%29evolutionary+method+to+generate+high-affinity+nucleic+acid+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolec+Engineering%22%5BJournal%5D)">SELEX -- A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands.</a> Biomolec Engineering. 24, 381-403 (2007).</li>
<li>Que-Gewirth, N. S., Sullenger, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+progress+and+prospects%3A+RNA+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy progress and prospects: RNA aptamers.</a> Gene Ther. 14, 283-2891 (2007).</li>
<li>Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+analysis+of+the+contribution+of+primer+sequences+to+aptamer+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Evol%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures.</a> J Mol Evol. 67, 95-102 (2008).</li>
<li>Shtatland, T., Gill, S. C., Javornik, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+Escherichia+coli+RNA+with+bacteriophage+MS2+coat+protein%3A+genomic+SELEX%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Interactions of Escherichia coli RNA with bacteriophage MS2 coat protein: genomic SELEX.</a> Nucleic Acids Res. 28, E93-E93 (2000).</li>
<li>Jarosch, F., Buchner, K., Klussmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+using+a+dual+RNA+library+that+allows+primerless+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro selection using a dual RNA library that allows primerless selection.</a> Nucleic Acids Res. 34, E86-E86 (2006).</li>
<li>Vater, A., Jarosch, F., Buchner, K., Klussmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+bioactive+Spiegelmers+to+migraine-associated+calcitonin+gene-related+peptide+rapidly+identified+by+a+novel+approach%3A+tailored-SELEX%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Short bioactive Spiegelmers to migraine-associated calcitonin gene-related peptide rapidly identified by a novel approach: tailored-SELEX.</a> Nucleic Acids Res. 31, E130-E130 (2003).</li>
<li>Wen, J. D., Gray, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+genomic+sequences+that+bind+tightly+to+Ff+gene+5+protein%3A+primer-free+genomic+SELEX%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection of genomic sequences that bind tightly to Ff gene 5 protein: primer-free genomic SELEX.</a> Nucleic Acids Res. 32, E182-E182 (2004).</li>
<li>Musheev, M. U., Krylov, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+aptamers+by+systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+addressing+the+polymerase+chain+reaction+issue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Selection of aptamers by systematic evolution of ligands by exponential enrichment: addressing the polymerase chain reaction issue.</a> Anal Chim Acta. 564, 91-916 (2006).</li>
<li>Pan, W. H., Clawson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-free+aptamer+selection+using+a+random+DNA+library%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Primer-free aptamer selection using a random DNA library.</a> Methods Mol Biol. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Pan, W., Xin, P., Clawson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal-Primer+and+Primer-Free+SELEX+Protocols+for+Selection+of+Aptamers+from+Random+DNA+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Minimal-Primer and Primer-Free SELEX Protocols for Selection of Aptamers from Random DNA Libraries.</a> BioTechniques. 44, 351-360 (2008).</li>
<li>Nicewarner-Pena, S., Freeman, G., Reiss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submicrometer+metallic+barcodes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Submicrometer metallic barcodes.</a> Science. 294, 137-141 (2001).</li>
<li>JC, H. ulteen, CR, M. artin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+template-based+method+for+the+preparation+of+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Materials+Chem%22%5BJournal%5D)">A general template-based method for the preparation of nanomaterials.</a> J Materials Chem. 7, 1075-1087 (1997).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

<table><tbody><tr><td>Tris-HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA HotMaster TAQ</td><td>5 PRIME</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka dNTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor UltraPure 10X TBE</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Persiarczan amonu</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marker DNA PhiX174 DNA/Hinf I</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bro מקid etydynyum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-dCTP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenol:CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;:IAA</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enzymy restrykcyjne</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Film fotograficzny</td><td>ECE Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuleczki agarozowe Ni-NTA</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolumna polipropylenowa</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaAc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komórki Detroit-551</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komórki SK-MEL-31</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza RNA Sp6</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNaza I wolna od RNaz</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SensiScript odwrotna transkryptaza</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wektor pCR-2.1-TOPO</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komórki kompetentne DH5&amp;alpha;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do minipreparatykiki plazmidów</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vector NTI</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polinukleotydowa kinaza T4</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#947;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-ATP</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

selekcja aptamerów bez użycia starterów z wykorzystaniem losowej biblioteki dna

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Aptamery to silnie ustrukturyzowane oligonukleotydy (DNA lub RNA), które mogą wiązać się z celami z powinowactwem porównywalnym do przeciwciał 1. Są one identyfikowane poprzez proces selekcji in vitro zwany SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment), aby rozpoznawać szeroką gamę celów, od małych cząsteczek po białka i inne makrocząsteczki 2-4. Aptamery posiadają właściwości, które dobrze nadają się do diagnostycznych i/lub terapeutycznych zastosowań in vivo: poza dobrą swoistością i powinowactwem, są one łatwo syntetyzowane, wytrzymują bardziej rygorystyczne warunki przetwarzania, charakteryzują się niską immunogennością, a ich stosunkowo niewielki rozmiar może skutkować łatwiejszą penetracją tkanek.
Aptamery identyfikowane za pomocą standardowego procesu SELEX zazwyczaj składają się z około 80 nukleotydów (nt), ponieważ są one typowo selekcjonowane z bibliotek kwasów nukleinowych z randomizowanymi regionami o długości ok. 40 nt oraz stałymi miejscami dla starterów o długości ok. 20 nt po każdej stronie. Stałe sekwencje starterów mogą zatem stanowić blisko 50% sekwencji biblioteki, co może w sposób pozytywny lub negatywny wpływać na identyfikację aptamerów w procesie selekcji 3, choć podejścia bioinformatyczne sugerują, że stałe sekwencje nie przyczyniają się znacząco do struktury aptameru po selekcji 5. Aby rozwiązać te potencjalne problemy, sekwencje starterów blokowano za pomocą komplementarnych oligonukleotydów lub zmieniano na inne sekwencje w połowie rund SELEX 6, bądź przycinano je do 6-9 nt 7, 8. Wen i Gray 9 opracowali metodę genomowego SELEX bez użycia starterów, w której sekwencje starterów zostały całkowicie usunięte z biblioteki przed selekcją, a następnie zregenerowane, aby umożliwić amplifikację wybranych fragmentów genomowych. Jednakże, aby zastosować tę technikę, należy skonstruować unikalną bibliotekę genomową o ograniczonej różnorodności, a regeneracja po rundach selekcji opiera się na liniowym etapie reamplifikacji. Alternatywnie, próby uniknięcia problemów spowodowanych stałymi sekwencjami starterów poprzez zastosowanie wysokowydajnego rozdziału napotykają trudności związane z amplifikacją PCR 10.
Opracowaliśmy metodę selekcji bez użycia starterów (primer-free, PF), która znacznie upraszcza procedury SELEX i skutecznie eliminuje problemy związane z interferencją starterów 11, 12. Protokoły te działają w sposób bezpośredni. Centralny randomowy region biblioteki jest oczyszczany bez dodatkowych sekwencji flankujących, a następnie wiązany z odpowiednim celem (na przykład z oczyszczonym białkiem lub złożonymi mieszaninami, takimi jak linie komórkowe). Następnie otrzymuje się sekwencje związane, łączy się je ponownie z sekwencjami flankującymi i przeprowadza reamplifikację w celu wygenerowania wybranych podbibliotek. Jako przykład wyselekcjonowaliśmy aptamery do białka S100B, będącego markerem czerniaka. Analizy wiązania wykazały wartości Kd w zakresie 10-7 - 10-8 M po kilku rundach selekcji; wykazujemy również, że aptamery te działają efektywnie w formacie wiązania typu kanapkowego (sandwich).

Protokoły SELEX obejmują wiele rund selekcji, z których każda wymaga regeneracji związanych ligandów, co z kolei wymaga stałych sekwencji starterów flankujących regiony losowej biblioteki. Te stałe sekwencje starterów mogą zakłócać proces selekcji (powodując wyniki fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne). Przedstawiamy tutaj protokół bez użycia starterów.

Selekcja aptamerów bez użycia starterów z wykorzystaniem losowej biblioteki DNA

Aptamery to wysoko ustrukturyzowane oligonukleotydy (DNA lub RNA), które mogą wiązać się z celami z powinowactwem porównywalnym do przeciwciał 1. Są one identyfikowane...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zidentyfikowanie aptamerów z losowej biblioteki, które specyficznie wiążą się z białkiem docelowym, w tym przypadku z białkiem S 100 B. Jest to realizowane poprzez wstępne trawienie biblioteki endonukleazą restrykcyjną w celu uwolnienia losowych sekwencji z flankujących je stałych sekwencji starterów. Drugim krokiem procedury jest związanie losowych sekwencji z biblioteki z oczyszczonym białkiem S 100 B i ich odzyskanie.Trzecim krokiem procedury jest ponowne połączenie związanych sekwencji z unieruchomionymi sekwencjami starterów poprzez hybrydyzację i ligację. Ostatnim etapem procedury jest transkrypcja produktów ligacji w celu umożliwienia reamplifikacji związanej puli kandydujących abers za pomocą R-T-P-C-R, a następnie przeprowadzenie kolejnych rund tej procedury selekcyjnej. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące specyficzne wiązanie wybranych abers z białkiem S 100 B.Na przykład w tym przypadku testy wiązania typu kanapkowego są przeprowadzane z wykorzystaniem mikromacierzy, a testy z użyciem wtórnych przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie są również przeprowadzane przy użyciu funkcjonalizowanych nanodrutów oraz wtórnych przeciwciał sprzężonych z 15 nanometrowymi nanocząsteczkami złota. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wyboru optymalnych przeciwciał, które wiążą białko S100B z losowej biblioteki sekwencji DNA. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w wielu celach, w tym do opracowania platformy sensorycznej do wczesnego wykrywania nowotworów.Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować bibliotekę DNA wolną od starterów (PF), zgodnie z wcześniejszym opisem. Rozszczepienie dwuniciowej biblioteki DNA, a następnie oczyszczanie żelowe za pomocą 10% denaturującego żelu poliakrylamidowego, pozwoli uzyskać fragment 32 nukleotydów z grupą fosforanową na końcu 5' w pozycji 30 oraz fragment 30 nukleotydów z grupą fosforanową na końcu 5' w pozycji 30, określane odpowiednio jako fragmenty 32 plus i 30 plus.Fragment 32 plus zawiera 30-nukleotydową domenę randomową z minimalną sekwencją flankującą CC na końcu 3', podczas gdy fragment 30 plus składa się wyłącznie z sekwencji 30-nukleotydowej domeny randomowej. Aby przygotować fragmenty DNA biblioteki PF do selekcji aptr, należy resuspendować każdy z fragmentów 32 plus oraz 30 plus w 40 µL 20 mM Tris-HCl pH 7,4. Następnie próbki należy podgrzewać przez trzy minuty w temperaturze 85 °C po inkubacji.Próbki inkubowano przez trzy minuty w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C, następnie dodano 760 µL buforu selekcyjnego i inkubowano przez trzy minuty w temperaturze 37 °C. Po trzech minutach próbkę pozostawiono w temperaturze pokojowej na 10 minut. Po inkubacji roztwór przepuszczono przez kolumnę zawierającą kule agarowe Ni-NTA, uprzednio przemyte buforem selekcyjnym.Aby usunąć niespecyficzne DNA, należy zebrać fragmenty DNA z biblioteki PF, które nie związały się z kolumną, i odłożyć je na później. Aby przygotować koraliki z wiążącym białkiem S 100 B, w pierwszej kolejności należy odwirować 400 µL koralików niklowych NDA przez trzy sekundy w mikrowirówce i odrzucić nadosad. Następnie koraliki należy przemyć 400 µL buforu wiążącego, delikatnie pipetując pięć razy.Następnie odwiruj kuleczki i odlej nadsącz. Powtórz tę czynność. Przepłucz dwukrotnie.Następnie przelej wcześniej oczyszczone białko z tagiem histydynowym przez kuleczki. W tym przypadku zastosowano ludzkie białko S100 wiążące wapń B. Delikatnie pipetuj roztwór w górę i w dół pięć razy co trzy minuty przez łącznie 15 minut.Po 15 minutach odwiruj kuleczki i odlej nadsącz. Na koniec przemyj związane z kuleczkami S 100 B 400 µL buforu selekcyjnego, delikatnie pipetując ciecz w górę i w dół trzy razy. Ponownie odwiruj kuleczki i odlej nadsącz.Powtórz ten krok dwukrotnie, aby w sumie przeprowadzić trzy końcowe płukania w celu wyselekcjonowania przeciwciał związanych z S 100 B. Odzyskaj fragmenty 32 plus i 30 plus, które zostały wcześniej odłożone. Dodaj fragmenty do S 100 B związanego z kuleczkami. Następnie inkubuj próbkę przez 15 minut.Mieszając co trzy minuty poprzez delikatne pipetowanie w górę i w dół, a po 15 minutach krótko wirując kuleczki w celu ich osadzenia, odrzuć supernatant, a następnie przemyj kompleks S 100 BDNA 800 mikrolitrami buforu selekcyjnego, delikatnie pipetując. Następnie odwiruj kuleczki i odrzuć supernatant. Powtórz ten etap płukania dwukrotnie.Aby odzyskać S 100, należy dodać do kuleczek 200 µL 20 mM TRIS-HCl o pH 7,4. Następnie zawiesinę należy podgrzewać przez trzy minuty w temperaturze 85 °C. Po inkubacji.Mieszaj kulki na wirówce typu vortex przez jedną minutę, a następnie odwiruj je. Następnie przenieś nadsącz do nowej probówki. Powtórz ten krok raz i połącz oba nadsącze.Na koniec należy oczyścić wybrane fragmenty DNA. Produkty PCR należy dwukrotnie ekstrahować równą objętością fenolu, chloroformu i alkoholu izopropylowego. Następnie należy je wytrącić za pomocą 250 millimolar sodium chloride oraz 2,5-krotnej objętości 100%Ethanol w temperaturze minus 70 degrees Celsius przez 15 minut.Wiruj z prędkością 21 000 GS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie odlej nadsącz. Skutecznie przemyj osad 75% etanolem.Odwiruj przy 21 000 GS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut i odrzuć supernatant. Osad wysusz w wirówce próżniowej przez trzy minuty po 10 rundach selekcji. Klonuj uzyskane fragmenty DNA amplifikowane metodą PCR do wektora PCR 2.1 topo otrzymanego z witrogen core.Następnie przeprowadź sekwencjonowanie od 40 do 50 pojedynczych kolonii dla każdego z wybranych fragmentów N 30 cc oraz N 30, wykorzystując starter M 13 forward. Wybrane sekwencje wyrównaj za pomocą oprogramowania Infomax Vector NTI. Następnie, na podstawie otrzymanych wyrównań, wyznacz sekwencje konsensusowe.Po zidentyfikowaniu sekwencji konsensusowych należy zakupić oligonukleotydy konsensusowe zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Pierwszy syntetyzowany aptamer z grupą Amin C6 na końcu 5' należy zawiesić w buforze do drukowania do końcowego stężenia 15 µM. Następnie należy nanieść roztwór aptameru na slajdy aktywowane CodeLink za pomocą matrycy mikroprzestrzennej Apogen Discoveries.Należy postępować zgodnie z zalecanymi protokołami podanymi w linku do kodu. Każdy slajd należy wydrukować z 12 macierzami. Należy zastosować format dwa na osiem.Kaseta do hybrydyzacji mikromacierzy przeznaczona do hybrydyzacji. Rozcieńczyć białko S 100 B do odpowiedniego stężenia w 70 µL PBS. Następnie nanieść roztwór do studzienek kasety mikromacierzy.Uszczelnij kasetę z mikromacierzą za pomocą wolnej od nukleaz folii uszczelniającej, aby zapobiec odparowaniu. Pozostaw białko do związania z przeciwciałami naniesionymi na płytkę kodową. Inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Przemyj dołki kasety trzy razy za pomocą PBS z 5 mM chlorkiem magnezu lub PBSM. Następnie rozcieńcz znakowane fluorescencyjnie przeciwciała wtórne do stężenia 0,125 µM w 70 µL PBSM. Podgrzewaj mieszaninę przez trzy minuty w temperaturze 85 °C.Następnie należy schłodzić znakowane ABERS na lodzie. Przez trzy minuty nanosić ABERS do dołków kasety mikroarray. Ponownie uszczelnić kasetę folią klejącą i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Ponownie, pojedynczo. Po przemyciu opłucz dołki trzy razy przy użyciu PBSM. Rozmontuj kasetę i wypłucz cały preparas PBSM.Następnie należy dokładnie osuszyć preparat poprzez wirowanie. Na koniec skanuje się preparat przy użyciu skanera Packard Biosciences scan array. Wiązanie 4 000 XL określono dla aptamerów znakowanych na końcu 5' za pomocą gamma P 32 A TP w odniesieniu do białka S 100 B, a następnie nanieśli wyniki na wykres w funkcji stężenia w celu wyznaczenia KD.Reprezentatywne wartości Kd po około siedmiu rundach selekcji znajdują się zazwyczaj w zakresie 10⁻⁷ M. Aptamery pierwszego celu 5' sprzęgnięto z mikromacierzami CodeLink. Oczyszczone białko S100B związano z pierwszym aptamerem, a następnie do kompleksów pierwszego aptameru z S100B przyłączono drugi aptamer znakowany LOR 546.Fluorescencję zmierzono ilościowo za pomocą skanera tablicowego. Środkowy rząd przedstawia wiązanie typu „sandwich”, charakteryzujące się wiązaniem addytywnym w analizach KD w rzędach powyżej i poniżej. Brak wiązania typu „sandwich” dla abers pięcioprymowych pochodnych tiolowych; pierwsze abers zostały sprzęgnięte z nanodrutami złotymi przy użyciu standardowej chemii tiolowej.Drugie przeciwciała sprzęgnięto z 50 nM złocistych nanocząsteczek w ten sam sposób. Następnie oczyszczone białko S 100 B związano najpierw z nanodrutami pochodnymi, a potem do kompleksów nanodrut-pierwsze przeciwciało-S 100 B związano 50 nM złocistych nanocząsteczek z drugim aptamerem. Powstałe kompleksy kanapkowe zwizualizowano za pomocą FE-SEM.Kontrola negatywna została przedstawiona dla testu wiązania przeprowadzonego z białkiem HTRA one zamiast białka S 100 B. Jednym z najważniejszych aspektów tej procedury jest zastosowanie podejścia bezprimerowego, w którym nie używamy stałych sekwencji; zapobiega to powstawaniu wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych, które mogłyby wystąpić, gdyby same sekwencje zdominowały region losowy. Podczas wykonywania tej procedury należy upewnić się, że matryca DNA została zniszczona przed każdą reakcją odwrotnej transkrypcji oraz zachować ostrożność przy izolowaniu konkretnego produktu RT-PCR po każdej reamplifikacji.To wszystko. Dziękujemy za obejrzenie i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

primer-free-aptamer-selection-using-a-random-dna-library

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Selekcja aptamerów bez starterów z wykorzystaniem losowej biblioteki DNA

Dostępny jest protokół do wyboru aptamerów przełączających strukturę dla małych cząsteczek w oparciu o przestrajalną metodę selekcji kulek magnetycznych z regulacją. Aptamery wybrane ze względu na właściwości przełączania struktur są korzystne w testach, które wymagają zmiany konformacyjnej w celu zasygnalizowania obecności celu, takich jak opisany test nanocząstek złota.

Metoda wyboru aptamerów przełączających strukturę zastosowana do kolorymetrycznego testu nanocząstek złota

Ten manuskrypt opisuje zautomatyzowane podejście do wyboru rozmiaru żelu do oczyszczania fragmentów DNA do sekwencjonowania nowej generacji. Technologia Ranger zapewnia pełną automatyzację całego procesu ładowania żelem agarozowym, analizy elektroforetycznej i odzyskiwania docelowych fragmentów DNA, co pozwala na uzyskanie wysokiej przepustowości i wysokiej jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji.

Zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej

Przedstawiamy protokół do oceny funkcjonalnej kompleksowych bibliotek mutagenezy saturacji pojedynczym miejscem białek wykorzystujących sekwencjonowanie wysokoprzepustowe. Co ważne, podejście to wykorzystuje ortogonalne pary starterów do budowy i sekwencjonowania bibliotek multipleksowych. Przedstawiono reprezentatywne wyniki przy użyciu TEM-1 β-laktamazy dobranej w klinicznie istotnej dawce ampicyliny.

Protokół oceny funkcjonalnej bibliotek mutagenezy nasycenia całych białek wykorzystujących sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości

Termoforeza w mikroskali (MST) to czuła technologia do charakteryzowania interakcji aptamer-cel. Niniejszy manuskrypt opisuje protokół MST do charakteryzowania oddziaływań aptamer-małe cząsteczki.

Mapowanie miejsca wiązania aptameru na ATP za pomocą termoforezy w mikroskali

Przedstawiono protokół selekcji in vitro i charakterystyki aptamerów DNA wiążących estry kwasu ftalowego specyficznych dla grupy. Uwzględniono również zastosowanie wybranego aptameru w elektrochemicznym czujniku aptasensorycznym.

Wybór aptameru DNA wiążącego estry kwasu ftalowego, charakterystyka i zastosowanie do elektrochemicznego czujnika aptasensora

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to potężne narzędzie do charakterystyki genomu, które jest ograniczone przez wysoki poziom błędów platformy (~0,5–2,0%). Opisujemy nasze metody sekwencjonowania z korekcją błędów, które pozwalają nam wyeliminować wskaźnik błędów NGS i wykryć mutacje przy frakcjach alleli wariantów tak rzadkich, jak 0,0001.

Wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów

Specyficzność sekwencji jest kluczowa dla regulacji genów. Białka regulatorowe, które rozpoznają określone sekwencje, są ważne dla regulacji genów. Zdefiniowanie funkcjonalnych miejsc wiązania dla takich białek jest trudnym problemem biologicznym. Iteracyjne podejście do identyfikacji miejsca wiązania białka wiążącego RNA jest opisane tutaj i ma zastosowanie do wszystkich białek wiążących RNA.

Badanie przestrzeni sekwencji w celu identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących regulatorowe RNA

Eksperymenty z mikromacierzą wiążącą białka (PBM) w połączeniu z testami biochemicznymi łączą właściwości wiązania i katalityczne primazy DNA, enzymu, który syntetyzuje startery RNA na matrycowym DNA. Metoda ta, określana jako wysokoprzepustowe profilowanie prymasowe (HTPP), może być stosowana do ujawniania wzorców wiązania DNA różnych enzymów.

Rozpoznawanie sekwencji DNA za pomocą prymazy DNA przy użyciu wysokoprzepustowego profilowania prymazów

Endonukleazy restrykcyjne o nowej specyficzności sekwencji mogą być rozwijane z enzymów rozpoznających częściowo zdegenerowaną sekwencję. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który z powodzeniem wykorzystaliśmy do zmiany specyficzności sekwencji enzymu NlaIV. Kluczowymi składnikami protokołu są podział in vitro na przedziały reakcji transkrypcji/translacji oraz wybór wariantów o nowej specyficzności sekwencji.

Ukierunkowana ewolucja endonukleazy restrykcyjnej in vitro o bardziej rygorystycznej swoistości

Udostępniamy protokół, który może być ogólnie stosowany do wybranych aptamerów, które wiążą się tylko z wirusami zakaźnymi, a nie z wirusami, które stały się niezakaźne za pomocą metody dezynfekcji lub z innymi podobnymi wirusami. Otwiera to możliwość określenia statusu zakaźności w testach przenośnych i szybkich.

Selekcja aptamerów in vitro w celu odróżnienia wirusów zakaźnych od niezakaźnych

Poznaj metodę selekcji aptamerów bez podkładów wiążących białko S100B z losowej biblioteki DNA. Protokół SELEX eliminuje interferencję sekwencji stałych, zwiększając swoistość.

Selekcja aptamerów bez użycia starterów z wykorzystaniem losowej biblioteki DNA

Przeglądaj więcej filmów