Wybór aptamerów bez podkładów przy użyciu losowej biblioteki DNA

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja aber z losowej biblioteki, które specyficznie wiążą się z białkiem docelowym w tym przypadku, białkiem S 100 B. Osiąga się to poprzez najpierw trawienie biblioteki za pomocą endonukleazy restrykcyjnej w celu uwolnienia losowych sekwencji z flankujących ustalonych sekwencji starterowych. Drugim krokiem procedury jest związanie losowych sekwencji bibliotecznych z oczyszczonym białkiem S 100 B i ich odzyskanie.

Trzecim etapem procedury jest ponowne połączenie związanych sekwencji z ustalonymi sekwencjami starterowymi poprzez hybrydyzację i ligację. Ostatnim etapem procedury jest transkrypcja podwiązanych produktów, aby umożliwić R-T-P-C-R ponowną amplifikację związanej puli kandydatów na abery, po której następują dodatkowe rundy tej procedury selekcyjnej. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują na specyficzne wiązanie wybranych aber z białkiem S 100 B.

Na przykład w tym przypadku testy wiązania warstwowego są wykonywane przy użyciu mikromacierzy, a znakowane fluorescencyjnie testy drugich aber są również wykonywane przy użyciu funkcjonalizowanych nanodrutów i drugich aber sprzężonych z 15-nanometrowymi nanocząstkami złota. Dzisiaj pokażemy procedurę wyboru optymalnych, które wiążą się z białkiem S hundred B z losowej biblioteki sekwencji D. Wykorzystujemy tę procedurę w naszym laboratorium do różnych celów, w tym do opracowania platformy czujników do wczesnego wykrywania raka.

Więc zacznijmy. Aby rozpocząć tę procedurę, wygeneruj bibliotekę DNA wolną od starterów lub PF, jak opisano wcześniej. Rozszczepienie dwuniciowej biblioteki DNA, a następnie oczyszczenie żelu za pomocą 10% denaturującego żelu poliakrylamidowego spowoduje powstanie 32-nukleotydowego fragmentu pięciu pierwszych fosforanów w 30 cm3 i 30-nukleotydowego fragmentu pięciu pierwszych fosforanów w 30, oznaczonych odpowiednio fragmentem 32 plus i 30 plus.

Fragment 32 plus zawiera losową domenę 30 nukleotydów z minimalną sekwencją flankującą CC na trzech głównych końcach, podczas gdy fragment 30 plus składa się tylko z sekwencji 30 nukleotydów o losowej domenie. Aby przygotować fragmenty DNA biblioteki PF do selekcji aptr, należy zawiesić każdy z 32 plus i 30 plus fragmentów w 40 mikrolitrach 20 militris, HCL pH 7,4. Następnie po inkubacji podgrzewać próbki przez trzy minuty w temperaturze 85 stopni Celsjusza.

Schłodzić, próbki przechowywać przez trzy minuty w inkubatorze w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie w selekcyjnej wodzie o pojemności 760 mikrolitrów, buforować i inkubować przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po trzech minutach należy przechowywać próbkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po inkubacji przepuścić roztwór przez kolumnę zawierającą kulki agrowo niklowe NTA, wstępnie przemyte buforem selekcyjnym.

Aby usunąć niespecyficzne DNA, zbierz fragmenty DNA z biblioteki PF, które nie wiążą się z kolumną i odłóż na później. Aby przygotować kulki związane z S 100 B, najpierw odwiruj 400 mikrolitrów kulek NDA niklu przez trzy sekundy w mikrowirówce i wyrzuć supernatant. Następnie przemyj kulki 400 mikrolitrami buforu wiążącego, delikatnie pipetując pięć razy.

Następnie odkręć kulki i wyrzuć supernatant. Powtórz to. Umyć dwukrotnie.

Następnie biedna, wcześniej oczyszczona histydyna znakowała białko na kulkach. Tutaj ludzki S 100 wiąże wapń. Białko B stosuje się delikatnie, pipetując roztwór w górę i w dół pięć razy co trzy minuty, w sumie przez 15 minut.

Po 15 minutach odkręć koraliki i wyrzuć supernatant. Na koniec umyj S 100 B z koralikami 400 mikrolitrów buforu selekcyjnego, delikatnie, trzykrotnie głaszcząc w górę iw dół. Ponownie odkręć koraliki w dół i wyrzuć supernatant.

Powtórz ten krok dwukrotnie, w sumie trzy końcowe prania, aby wybrać dla S 100 B związanych abers. Odzyskaj fragmenty 32 plus i 30 plus, które zostały wcześniej odłożone na bok. Dodać fragmenty do spoingurki S 100 B. Następnie inkubować próbkę przez 15 minut.

Mieszając co trzy minuty, delikatnie pipetując w górę i w dół, po 15 minutach krótko odwirować kulki, wyrzucić supernatant, a następnie przemyć kompleks S 100 BDNA 800 mikrolitrami buforu selekcyjnego, delikatnie pipetując. Następnie odkręć koraliki w dół i wyrzuć supernatant. Powtórz ten krok prania dwa razy.

Aby odzyskać S 100, należy wybrać abers w 200 mikrolitrach 20 milimolowych tris, HCL pH 7,4 do kulek. Następnie podgrzewaj gnojowicę przez trzy minuty w temperaturze 85 stopni Celsjusza. Po inkubacji.

Wiruj koraliki przez minutę i odkręć je w dół. Następnie przenieść supernatant do świeżej probówki. Powtórz ten krok raz i połącz supernatanty.

Na koniec oczyść wybrane fragmenty DNA. Dwukrotnie ekstrahować produkty PCR równoważną objętością chloroformu fenylowego, alkoholu izopropylowego. Wytrącaj je 250 milimolowym chlorkiem sodu i 2,5-krotnością objętości 100% etanolu w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Wiruj w dół z prędkością 21 000 GS w czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Następnie odrzucić supernatant. Skutecznie spłucz granulat 75% etanolem.

Wirować w temperaturze 21 000 GS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Suszyć granulki w próżni przez trzy minuty Po 10 rundach selekcji. Sklonuj powstałe fragmenty DNA amplifikowane metodą PCR do wektora topo PCR 2.1 uzyskanego z rdzenia vitrogen.

Następnie sekwencjonuj od 40 do 50 pojedynczych kolonii dla każdego z wybranych fragmentów N 30 cc i N 30 za pomocą startera M 13 do przodu. Wyrównaj wybrane sekwencje za pomocą oprogramowania infomax vector NTI. Następnie określ sekwencje konsensusu na podstawie wyrównań.

Po zidentyfikowaniu sekwencji konsensusu należy zakupić łączniki konsensusu zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Zawiesić pierwszy aptamer zsyntetyzowany z pięcioma pierwszymi cząstkami Amin C sześcioma w buforze drukarskim do końcowego stężenia 15 mikromolowych. Następnie umieść roztwór aptamerowy na slajdach aktywowanych linkiem kodowym za pomocą macierzy mikrosiatki apogen discoveries.

Następujące zalecane protokoły linku do kodu. Drukuj każdy slajd z 12 tablicami. Użyj formatu dwa na osiem.

Kaseta hybrydyzacyjna mikromacierzy do hybrydyzacji. Rozcieńczyć białko S 100 B do odpowiedniego stężenia w 70 mikrolitrach PBS. Następnie nanieś roztwór do dołków kasety z mikromacierzą.

Uszczelnij kasetę mikromacierzy za pomocą samoprzylepnej folii sufitowej niezawierającej nukleaz, aby zapobiec parowaniu. Pozwól, aby białko związało się z odstawkami wydrukowanymi na łączu kodowym. Przesuwać przez godzinę w temperaturze pokojowej po indywidualnej inkubacji.

Umyj studzienki kasety trzykrotnie pięciomilimolowym chlorkiem magnezu PBS lub PBSM. Następnie rozcieńczyć znakowane fluorescencyjnie drugie abers do 0,125 mikromola w 70 mikrolitrach PBSM. Podgrzewaj mieszaninę przez trzy minuty w temperaturze 85 stopni Celsjusza.

Następnie pozwól oznaczonym ABERS ostygnąć na lodzie. Przez trzy minuty nakładaj abery na dołki kasety z mikromacierzą. Ponownie uszczelnij kasetę folią samoprzylepną i inkubuj je przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Ponownie, indywidualnie. Po umyciu umyj studzienki trzykrotnie PBSM. Zdemontuj kasetę i przepłucz cały szkiełko PBSM.

Następnie dokładnie wysuszyć szkiełko przez odwirowanie. Na koniec zeskanuj slajd za pomocą skanującej tablicy skanowania Packard Biosciences. Wiązanie 4 000 XL określono dla aptamerów znakowanych gamma P 32 A TP na pięciu pierwszych końcach do białka S 100 B i wykreślono w stosunku do stężenia w celu oznaczenia KD.

Reprezentatywne kd po około siedmiu rundach selekcji znajdują się zazwyczaj w zakresie od 10 do minus siedmiu molowych. Pięć pierwszych aptamerów do pierwszego celowania sprzężono z mikromacierzami łącza kodowego, oczyszczone białko S 100 B powiązano z pierwszym optymalizatorem, a LOR 5 46 znakowano drugim. Optimer został związany z pierwszymi kompleksami optimeru S 100 B.

Fluorescencję oznaczono ilościowo za pomocą skanera z matrycą skanującą. Środkowy rząd pokazuje więdnięcie wiązania kanapkowego charakteryzujące się addytywnym wiązaniem w testach KD w wierszach powyżej i poniżej. Nie ma wiązania kanapkowego dla aberów, pięć pierwszych pierwszych aberów derywatyzowanych tiolem sprzężono ze złotymi nanodrutami przy użyciu standardowej chemii tilu.

Drugie abery sprzężono w ten sam sposób z 50 NMO lub złotymi wskaźnikami NPS. Oczyszczone białko S 100 B zostało następnie związane najpierw z pochodnymi nanodrutami, drugie aptamer 50 nano molowe złoto mp zostały następnie związane z pierwszymi kompleksami nanodrutów aptamerowych S 100 B. Związane kompleksy warstwowe zwizualizowano za pomocą F FE SEM. Tu.

Kontrolę ujemną można zaobserwować w przypadku testu wiązania przeprowadzonego z białkiem HTRA one zamiast białka S 100 B. Okej, więc jedną z najważniejszych rzeczy w tej procedurze jest to, że używamy podejścia bez starterów, w którym nie mamy ustalonych sekwencji, które mogą powodować fałszywe alarmy i fałszywie ujemne na podstawie the, sekwencje same w sobie przytłaczają losowy region. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że matryca DNA jest niszczona przed każdą reakcją odwrotnej transkrypcji i należy zachować ostrożność, aby wyizolować określony produkt R-T-P-C-R po każdej ponownej amplifikacji.

Więc to wszystko. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.