Name: Pomiar aktywności kalpainy w komórkach stałych i żywych za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-08T17:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Poznaj metodę pomiaru aktywności kalpainy w komórkach stałych i żywych za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem fluorescencyjnego substratu. Ta technika umożliwia badanie aktywności proteaz w chorobach nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez granty z Canadian Institutes of Health Research, The Leukemia and Lymphoma Society of Canada oraz Lymphoma Foundation of Canada.

Przygotowanie odczynników
Uwaga: Wszystkie roztwory PBS zawierają Ca2+ i Mg2+
<ol>
 <li>Odczyn detekcyjny 
 Do PBS o temperaturze pokojowej dodać 20µM 7-amino-4-chlorometylokumaryny, t-BOC-leucyno-metioniny amidu (BOC-LM-CMAC). Każda zawiesina komórkowa będzie wymagać 2mL odczynu detekcyjnego.</li>
 <li>1% Paraformaldehyd (utrwalone komórki) 
 Rozcieńczyć 4% roztwór zapasowy paraformaldehydu w PBS o temperaturze pokojowej. Do każdej probówki do FACS dodać 1mL 1% paraformaldehydu. Dla każdego warunku eksperymentalnego wymagane są trzy probówki do FACS (np. 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 wymagają 9 probówek do FACS)</li>
 <li>PD150606 (inhibitor kalpainy) 
 Rozpuścić PD150606 w DMSO do stężenia końcowego 100mM. Ten odczyn oraz wszystkie potraktowane nim komórki należy chronić przed światłem przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
 <li>PD98059 (inhibitor MEK1) 
 Rozpuścić PD98059 w DMSO do stężenia końcowego 50mM.</li>
</ol>
Przygotowanie komórek
<ol>
 <li>Hodować komórki 32Dkit w zagęszczeniu 5 x 105 do 1 x 106 komórek na ml w pożywce Opti-MEM uzupełnionej o 5% płodowej surowicy bydlęcej, supernatant z komórek WEHI-3 jako źródło IL-3 (lub dowolne inne źródło IL-3, np. białko rekombinowane), 0,1% 2-merkaptoetanolu oraz antybiotyki.</li>
 <li>Pobrać 12 x 106 komórki 32Dkit do trzech probówek Falcon o pojemności 15 ml (4 x 106 komórek na probówkę).</li>
 <li>Odwirować komórki z prędkością 1000 obr./min przez 5 minut przy 15°C.</li>
 <li>Odssać supernatant. Resuspendować komórki w 2 mL PBS o temperaturze pokojowej.</li>
 <li>poddać zawiesinę pojedynczych komórek działaniu 50μM PD150606. Należy zabezpieczyć próbkę przed światłem, owijając probówkę Falcon folią aluminiową. Krótko wymieszać na wstrząsarce typu vortex, a następnie inkubować przez dwadzieścia do trzydziestu minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
 <li>Poddać drugą zawiesinę komórek działaniu 20μM PD98059. Wysiać komórki do 35-milimetrowej szalki do hodowli tkankowej i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37°C.</li>
</ol>
Oznaczenie kalpainy w utrwalonych komórkach
<ol>
 <li>Podczas inkubacji próbek z PD150606 rozpocząć analizę kalpainy w próbkach niepoddanych działaniu inhibitora. W pierwszej kolejności dodać 2 mL odczynnika detekcyjnego do każdej zawiesiny komórkowej. Natychmiast przenieść 1 mL mieszaniny zawiesiny komórkowej z odczynnikiem detekcyjnym do wcześniej przygotowanych probówek do FACS zawierających 1% paraformaldehydu (punkt czasowy 0 minut).</li>
 <li>Inkubować zawiesiny komórkowe z odczynnikiem detekcyjnym przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieść 1 mL zawiesiny komórkowej do probówki FACS zawierającej 1 mL 1% paraformaldehydu.</li>
 <li>Kontynuować inkubację zawiesin komórkowych z mieszaniną detekcyjną przez kolejne 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieść 1 mL zawiesiny komórkowej do probówki FACS zawierającej 1 mL 1% paraformaldehydu.</li>
 <li>Powtórzyć analizę kalpainy w komórkach 32Dkit poddanych działaniu inhibitorów.</li>
 <li>Utrwalić komórki przez noc w ciemności w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Następnego dnia odwirować komórki przy 1800 RPM przez 5 minut w temperaturze 15°C.</li>
 <li>Odssać supernatant. Resuspendować komórki w 750 µL PBS. Umieścić komórki na lodzie i przechowywać w ciemności.</li>
</ol>
Pozyskiwanie danych dla utrwalonych komórek
<ol>
 <li>Przeanalizuj komórki przy użyciu cytometru LSR II (BD Bioscience). Filtry należy ustawić dla lasera Lightwave Xcyte (UV), linia wzbudzenia 355nm i moc lasera 25mW, emisja odpowiednio 405 i 450 nm dla substratu i produktu. Filtry pasmowe dla substratu i produktu to 405/20 oraz 450/50. Filtry długoprzepustowe dla substratu i produktu to 405 i 450. Napięcie PMT ustawiono na 350-375 dla substratu oraz 325-350 dla produktu.</li>
 <li>Skonfiguruj eksperyment w programie BD FACSDiva z następującymi parametrami: forward scatter; side scatter; Indo-1 Blue (log); Indo-1 Violet (log). W arkuszu roboczym ustaw następujące wykresy: wykres kropkowy forward scatter vs. side scatter z bramkowaniem żywych komórek (Rycina 1a), histogram Indo-1 Blue, histogram Indo-1 Violet oraz wykres kropkowy Indo-1 Blue vs. Indo-1 Violet.</li>
 <li>Zkalibruj urządzenie LSR II za pomocą kuleczek fluorescencyjnych AlignFlow i AlignFlow plus (Invitrogen). Przed każdym eksperymentem należy dostosować napięcie PMT tak, aby szczyt histogramu fluorescencji kuleczek znajdował się w tym samym kanale.</li>
 <li>Rozpocznij akwizycję danych dla komórek 32Dkit w punkcie czasowym 0 min. W razie potrzeby dostosuj napięcia parametrów. Zdobądź i zarejestruj 10 000 zdarzeń na próbkę.</li>
 <li>Powtórz akwizycję dla każdej próbki, płucząc urządzenie buforem FACS pomiędzy każdą probówką.</li>
 <li>Wyeksportuj dane. Upewnij się, że urządzenie LSR II zostało wyczyszczone zgodnie z wytycznymi instytutu.</li>
</ol>
Analiza aktywności kalpain w żywych komórkach
<ol>
 <li>Przygotować zawiesiny komórek jak opisano powyżej, z pominięciem PD150606. Przenieść próbki do urządzenia LSR II i ustawić filtry oraz parametry zgodnie z powyższymi instrukcjami. Przygotować arkusz roboczy jak opisano powyżej. Dołączyć duży wykres kropkowy (dot plot) przedstawiający Indo-1 Blue w funkcji czasu. Ustawić program na zbieranie maksymalnej liczby zdarzeń (bez bramki zatrzymującej).</li>
 <li>Do jednej zawiesiny komórek 32Dkit dodać 50μM PD150606. Próbkę przechowywać w ciemności i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20-30 minut.</li>
 <li>Rozpocząć zbieranie danych z zawiesiny komórek 32Dkit bez PD150606. Zastosować niski przepływ na poziomie 200-300 zdarzeń na sekundę. Po 30 sekundach do 1 minuty wyjąć probówkę z urządzenia. Do komórek dodać 20μM BOC-LM-CMAC. Krótko wymieszać w wirówce Vortex, a następnie kontynuować zbieranie danych.</li>
 <li>Zbierać dane przez 10-20 minut lub do momentu osiągnięcia plateau aktywności kalpain.</li>
 <li>Powtórzyć kroki 3 i 4 dla komórek 32Dkit traktowanych PD150606.</li>
 <li>Wyeksportować dane. Upewnić się, że urządzenie LSR II zostało wyczyszczone zgodnie z wytycznymi instytucji.</li>
</ol>
Analiza aktywności kalpain w złożonych (mieszanych) populacjach komórek
*Niniejszy eksperyment służy do identyfikacji komórek 32Dkit w zawiesinie komórkowej uzyskanej ze śledziony myszy.
<ol>
 <li>Pobierz śledziony od każdej myszy. Przeprowadź lizę erytrocytów za pomocą NH4Cl przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przygotuj zawiesiny pojedynczych komórek w 2mL PBS.</li>
 <li>Podziel każdą zawiesinę komórkową na dwie części. Jedną z zawiesin inkubuj z 50μM PD150606 przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.</li>
 <li>Postępuj zgodnie z powyższym protokołem dla testu aktywności kalpain w komórkach utrwalonych (Kroki 1-6).</li>
 <li>Odsuń nadsącz za pomocą aspiratora. Przemyj komórki w 500μL PBS. Odsuń nadsącz.</li>
 <li>Resuspenduj komórki w 200μL buforu do barwienia z 2% BSA. Inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przygotuj przeciwciało pierwotne (FITC anty-mysi CD117). Przeciwciało należy rozcieńczyć 1:200 w buforze do barwienia. Należy zapewnić przechowywanie przeciwciała w ciemności.</li>
 <li>Dodaj 200μL przeciwciała pierwotnego do komórek. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.</li>
 <li>Dodaj 400μL PBS, aby zwiększyć objętość próbki do cytometrii przepływowej. Umieść komórki na lodzie i przechowuj w ciemności.</li>
 <li>Postępuj zgodnie z opisem w sekcji Pozyskiwanie danych dla komórek utrwalonych. Dodaj FITC do parametrów i uwzględnij histogram dla FITC w arkuszu roboczym.</li>
</ol>
Analiza i reprezentatywne wyniki
<ol>
 <li>Przeanalizuj dane przy użyciu programu FlowJo (Treestar). Wyznacz bramkę dla żywych komórek na podstawie profilu rozproszenia przedniego i bocznego (Rysunek 1a). Określ średnią fluorescencję dla Indo-Blue w bramce komórek żywych (Rysunek 1b).</li>
 <li>a) Dla mieszanej populacji komórek
 <ul>
 <li>wykorzystaj fluorescencję FITC na histogramach i wykresach kropkowych, aby zidentyfikować populację 32Dkit</li>
 <li>Określ średnią fluorescencję dla Indo-Blue w populacji 32Dkit</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Użyj programu Microsoft Excel do przedstawienia średniej fluorescencji na wykresie (Rysunek 2a). Oblicz nachylenie linii między 5 a 10 minutą. Przedstaw nachylenie na wykresie słupkowym, aby określić aktywność kalpainy w komórkach (Rysunek 2b).</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1a.jpg" alt="Schemat cytometrii przepływowej; wykres FSC/SSC przedstawiający analizę rozkładu populacji żywych komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1a"> 
 Rysunek 1a. Wyznaczanie żywych komórek na podstawie profilu rozpraszania przedniego i bocznego.
<img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1b.jpg" alt="Wyniki cytometrii przepływowej, analiza komórek barwionych Indo-1, histogram rozkładu, porównanie danych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1b"> 
 Rysunek 1b. Średnia zmiana fluorescencji w ciągu 10 minut.
<img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2a.jpg" alt="Wykres liniowy przedstawiający odpowiedź biochemiczną w czasie z inhibitorem PD150606 i bez niego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2a"> 
 Rycina 2a. Reprezentatywny wykres średniej fluorescencji.
<img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2b.jpg" alt="Wykres słupkowy aktywności kalpainy, efekty 32Dkit z inhibitorami PD150606 i PD98059, wyniki eksperymentu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2b"> 
 Rysunek 2b. Aktywność kalpainy w komórkach 32Dkit z inhibitorami.

<ol><li>Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).</li>
<li>Niapour, M., Berger, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Measurement+of+Calpain+Activity+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells.</a> Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).</li>
<li>Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+ERK%2FMAP+kinase+signalling+pathway+in+milli-calpain+activation+and+myogenic+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym protokole wideo określono aktywność kalpainy w utrwalonych i żywych komórkach 32Dkit. Leczenie tej linii komórkowej inhibitorem kalpainy PD150606 doprowadziło do całkowitego zahamowania aktywności kalpainy w komórkach. Ponadto zastosowanie inhibitora MEK1 PD98059 również spowodowało całkowite zahamowanie aktywności kalpainy w komórkach. ERK jest głównym aktywatorem kalpainy-2 3. Wyniki te sugerują, że w komórkach 32Dkit dominuje aktywność kalpainy-2. Obecne prace w naszym laboratorium koncentrują ...

<table><tbody><tr><td>PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyd</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Rozpuścić 4 g paraformaldehydu w 100 ml PBS. W dygestorium podgrzewać próbkę podczas mieszania, aż roztwór stanie się klarowny.&lt;br/&gt;Pozostawić do ostygnięcia, a następnie przechowywać w temperaturze 4°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>PD150606</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>W celu maksymalnego zahamowania aktywności kalpain należy użyć świeżo zrekonstytuowanego związku PD150606.</td></tr><tr><td>PD98059</td><td>Cell Signaling Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>probówki FACS AlignFlow, AlignFlow plus z kulkami fluorescencyjnymi</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>&lt;br/&gt;W eksperymentach tych jako źródło IL-3 wykorzystuje się nadsącz z hodowli komórek WEHI-3. Każda partia nadsączu z komórek WEHI-3 jest miareczkowana w celu określenia optymalnego stężenia niezbędnego do wzrostu komórek 32Dkit. </td></tr></tbody></table>

pomiar aktywności kalpain w komórkach utrwalonych i żywych za pomocą cytometrii przepływowej

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Kalpainy są powszechnie występującymi wewnątrzkomórkowymi, wapniozależnymi, neutralnymi cysteinowymi proteazami1Kalpainy odgrywają kluczowe role w wielu procesach fizjologicznych, w tym w sygnalizacji, przebudowie cytoszkieletu, regulacji ekspresji genów, apoptozie oraz progresji cyklu komórkowego1Kalpainy są zaangażowane w wiele patologii, w tym w dystrofie mięśniowe, nowotwory, cukrzycę, chorobę Alzheimera oraz stwardnienie rozsiane1Regulacja kalpain jest złożona i nie do końca poznana. Poziomy mRNA i białek słabo korelują z aktywnością, co ogranicza zastosowanie technik ekspresji genów lub białek do pomiaru aktywności kalpain. Ten protokół wideo szczegółowo opisuje opracowany w naszym laboratorium test cytometrii przepływowej do pomiaru aktywności kalpain w komórkach utrwalonych i żywych. Metoda ta wykorzystuje fluorescencyjny substrat BOC-LM-CMAC, który jest specyficznie rozszczepiany przez kalpainę, w celu pomiaru jej aktywności.2W tym filmie aktywność kalpainy w utrwalonych i żywych mysich komórkach białaczki 32Dkit, samodzielnie lub jako część populacji splenocytów, jest mierzona przy użyciu analizatora LSRII (BD Bioscience). Wykazano, że komórki 32Dkit wykazują podwyższoną aktywność w porównaniu do prawidłowych splenocytów.

W niniejszym artykule szczegółowo opisano protokół pomiaru aktywności kalpainy w komórkach utrwalonych i żywych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.

Pomiar aktywności kalpain w komórkach utrwalonych i żywych za pomocą cytometrii przepływowej

Kalpainy to powszechnie występujące wewnątrzkomórkowe, wrażliwe na wapń, neutralne proteazy cysteinowe 1. Kalpainy odgrywają kluczowe role w wielu procesach fizjologicznych, ...

Kalpainy są powszechnymi, wewnątrzkomórkowymi, wrażliwymi na wapń neutralnymi cysteinowymi proteazami, które odgrywają kluczowe role w wielu procesach fizjologicznych, w tym w sygnalizacji, przebudowie cytoszkieletu, regulacji ekspresji genów, apoptozie oraz progresji cyklu komórkowego. W celu pomiaru aktywności kalpain w komórkach utrwalonych i żywych dodaje się fluorescencyjny substrat BUC, LMC MAC. Buc LMC MAC jest specyficznie rozszczepiany przez kalpainę, co skutkuje wzrostem fluorescencji. Zmianę fluorescencji monitoruje się za pomocą cytometrii przepływowej, która wykazuje zwiększoną aktywność kalpain w komórkach 30 2D kit w porównaniu do prawidłowych cytocytów.Witajcie, jestem Christina Farr z laboratorium dr Stewarta Bergera na Uniwersytecie w Toronto, w Departamencie Immunologii oraz w University Health Network. Dzisiaj pokażę Państwu, jak mierzyć aktywność kalpain w komórkach utrwalonych i żywych przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej. W naszym laboratorium wykorzystujemy ten test do badania aktywności kalpain w komórkach białaczki i chłoniaka.Zacznijmy zatem. Przed rozpoczęciem eksperymentów należy przygotować niezbędne odczynniki, w tym odczynnik detekcyjny 1% paraformaldehydu, inhibitor kalpainy PD 150606 oraz inhibitor MEK1 PD 98059. Szczegóły dotyczące przygotowania tych odczynników znajdują się w dołączonym protokole pisemnym. Do każdej probówki FACS wlej 1 ml 1% paraformaldehydu.Dla utrwalonych komórek przedstawionych w tym filmie wymagane są trzy probówki fax dla każdego stanu doświadczalnego. Testowane są trzy stany, zatem potrzebnych jest dziewięć probówek fax. Należy zacząć od 32 komórek dki o stężeniu od 0,5 do 1 × 10⁶ komórek na mililitr, hodowanych w pożywce optymalnej.Uzupełniono płowskim surowicą bydlęcą, IL-3, tumor capto etanolem oraz antybiotykami. Przenieś 4 × 10⁶ komórek do każdej z trzech probówek Falcon o pojemności 15 ml. Umieść probówki w wirówce i odwirować osad, wirując z prędkością 225 G przez 5 minut w temperaturze 15 °C.Po wirowaniu odessaj nadsącz i resuspenduj komórki w 2 ml PBS w temperaturze pokojowej. Potraktuj jedną zawiesinę komórkową 50 µM inhibitorem kalpainy PD 150606. Upewnij się, że próbka jest chroniona przed światłem, owijając probówkę folią aluminiową. Krótko wymieszaj na wstrząsarce Vortex, a następnie inkubuj od 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.Drugą zawiesinę komórek potraktuj 20 µM inhibitorem MEK PD 9059. Wysiej komórki na 35 mm naczynie hodowli tkankowej i inkubuj je przez dwie godziny w temperaturze 37 °C podczas inkubacji próbek. Rozpocznij analizę kalpainy w próbkach niepoddanych działaniu inhibitora.Zacznij od dodania dwóch mililitrów odczynnika detekcyjnego do zawiesiny komórkowej. Natychmiast przenieś jeden mililitr mieszaniny zawiesiny komórkowej z odczynnikiem detekcyjnym do wcześniej przygotowanych probówek do analizy FACS, aby przygotować próbkę dla czasu T równego zero. Inkubuj zawiesiny komórkowe z odczynnikiem detekcyjnym przez pięć minut.W temperaturze pokojowej dodaj jeden mililitr mieszaniny odczynników detekcyjnych do zawiesiny komórkowej do wcześniej przygotowanej probówki do FACS zawierającej jeden mililitr 1% paraformaldehydu, aby uzyskać próbkę dla T równą pięciu. Pozostałe zawiesiny komórkowe inkubuj dalej z mieszaniną detekcyjną przez dodatkowe pięć minut w temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach przenieś kolejny jeden mililitr zawiesiny komórkowej do przygotowanej probówki do FACS z jednym mililitrem 1% paraformaldehydu.Jest to punkt czasowy T równy 10 minutom. Następnie powtórz analizę kalpainy na 30 komórkach z zestawu 2D, które zostały poddane działaniu inhibitorów. Przykryj statyw folią aluminiową.Utwalaj komórki przez noc w ciemności w temperaturze 4 °C. Następnego dnia odwiruj komórki, wirując je z prędkością 725 Gs przez pięć minut w temperaturze 15 °C. Po wirowaniu odessij naddatek, a następnie resuspenduj komórki w 750 µL PBS.Umieścić komórki w lodzie i przechowywać je w ciemności do momentu przeprowadzenia cytometrii przepływowej. Tutaj zaprezentowano akwizycję danych dla komórek utrwalonych. Przeprowadzić cytometrię przepływową przy użyciu analizatora LSR II.Ustaw filtry dla wzbudzenia falą świetlną lub linią lasera UV na 355 nanometrów, a moc lasera na 25 miliwatów, z emisją odpowiednio 405 i 450 nanometrów dla substratu i produktu. Filtry pasmowe BAM użyte dla substratu i produktu powinny wynosić 405/20 i 450/50. Filtry długoprzepustowe dla substratu i produktu powinny wynosić 405 i 450.Ustaw napięcie PMT w zakresie od 350 do 375 dla substratu oraz od 325 do 350 dla produktu. Skonfiguruj eksperyment w programie BD FACSDiva z następującymi parametrami: rozproszenie przednie (forward scatter), rozproszenie boczne (side scatter), Indo 1 blue w skali logarytmicznej oraz jeden kanał fioletowy (violet).Użyj również skali logarytmicznej w arkuszu kalkulacyjnym. Przygotuj następujące wykresy: wykres rozrzutu forward scatter względem side scatter z bramką (gate) dla żywych komórek.Histogram Indo one blue, histogram Indo one violet oraz wykres kropkowy Indo one blue względem Indo one Violet służą do kalibracji urządzenia LSR two za pomocą kulek line flow oraz line flow plus. Przed każdym eksperymentem należy dostosować napięcie PMT tak, aby szczyt histogramu fluorescencji kulek znajdował się w tym samym kanale. Rozpocząć akwizycję danych dla 30 komórek zestawu 2D w punkcie czasowym zero minut.W razie potrzeby dostosuj napięcia parametrów. Pozyskaj i zarejestruj 10 000 zdarzeń dla każdej próbki. Przepłucz urządzenie buforem fax i powtórz proces pozyskiwania dla każdej próbki.Wyeksportuj dane po ich pozyskaniu. Upewnij się, że urządzenie LSR II zostało wyczyszczone zgodnie z wytycznymi instytucji. Przygotuj zawiesiny komórkowe w ten sam sposób co wcześniej, pomijając dodanie odczynnika detekcyjnego lub inhibitora kalpain.Przenieś próbki do urządzenia LSR 2 i ustaw filtry oraz parametry jak poprzednio. Przygotuj arkusz danych w sposób opisany wcześniej. Uwzględnij duży wykres punktowy przedstawiający zależność sygnału Indo 1 blue od czasu.Ustaw program tak, aby zarejestrować maksymalną liczbę zdarzeń. Nie stosuj bramki stop. Do jednej zawiesiny komórek z zestawu 32 G dodaj 50 µM inhibitora kalpainy.Próbkę należy przechowywać w ciemności i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut podczas inkubacji komórek. Rozpocząć akwizycję danych dla zawiesiny komórek z zestawu 30 2D bez inhibitora cal pain. Należy zastosować niską prędkość przepływu, od 200 do 300 zdarzeń na sekundę.Po 30 sekundach do jednej minuty wyjmij probówkę z urządzenia. Dodaj do komórek 20 µM Bach LMC mac. Jest to odczynnik detekcyjny.Jest on specyficznie rozszczepiany przez kalpainę, a jego rozszczepienie prowadzi do wzrostu fluorescencji substratu w wiru. Następnie krótko kontynuuj pozyskiwanie danych. Pozyskuj dane przez okres od 10 do 20 minut lub do momentu osiągnięcia plateau aktywności kalpainy.Następnie powtórz akwizycję dla 32 komórek gki traktowanych inhibitorem kalpainy. Po zakończeniu wyeksportuj dane do analizy. Rozpocznij analizę mieszanych komórek z zawiesiny komórkowej przygotowanej z śledziony myszy.Każdą zawiesinę komórkową podziel na dwie części. Jedną z zawiesin potraktuj 50 µM inhibitora kalpainy, przykryj folią i inkubuj przez 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Po przeprowadzeniu testu kalpainy zgodnie z wcześniej opisaną procedurą dla komórek utrwalonych, przykryj probówki folią i inkubuj komórki przez noc w temperaturze 4 °C w ciemności.Następnego dnia odwiruj próbkę przy 725 Gs przez pięć minut w temperaturze 15 °C. Odessaj supernatant, przemyj komórki w 500 µL PBS i ponownie odessaj supernatant, a następnie resuspenduj komórki w 200 µL buforu do barwienia z 2%BSA; inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj przeciwciało pierwszorzędowe, w tym przypadku ZI anti-US.Przeciwciało CD17 przygotowuje się w buforze barwiącym w końcowym rozcieńczeniu 1:200. Należy upewnić się, że przeciwciało jest przechowywane w ciemności. Do komórek dodaje się 200 µL przeciwciała pierwszorzędowego, a następnie inkubuje przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.Następnie dodaj 400 µL PBS, aby zwiększyć objętość próbki do cytometrii przepływowej. Komórki należy umieścić na lodzie i przechowywać w ciemności. Dane należy pozyskać, stosując tę samą procedurę cytometrii przepływowej, która została przedstawiona dla komórek utrwalonych.Dodaj ZI do parametrów i zamieść histogram dla ZI w arkuszu po zakończeniu akwizycji danych na analizatorze przepływowym. Analizę przeprowadź w programie FlowJo, bramkując żywe komórki na podstawie profilu rozproszenia światła przedniego (FSC) i bocznego (SSC). Wyznacz średnią fluorescencję dla Indo Blue z bramki żywych komórek.Na tym wykresie czerwona linia wskazuje średnią fluorescencję substratu w zerowej minucie, a linie niebieska i zielona wskazują średnią fluorescencję substratu w piątej i dziesiątej minucie. W przypadku mieszanej populacji komórek należy wykorzystać fluorescencję FXI na histogramach i wykresach kropkowych, aby zidentyfikować populację 30 2D kip. Wyznacz średnią fluorescencję dla endo blue populacji 30 2D kip.Na koniec należy wykorzystać program Microsoft Excel do przedstawienia średniej fluorescencji na wykresie. Oblicz nachylenie linii między piątą a dziesiątą minutą. Przedstaw nachylenie na wykresie słupkowym, aby określić aktywność cal pain w komórkach.Dane przedstawione tutaj wskazują, że 30 komórek 2D wykazuje wysoką aktywność kalpainy oraz że aktywność kalpainy może być hamowana przez inhibitory MEK. Właśnie pokazaliśmy, jak mierzyć aktywność kalpainy w komórkach utrwalonych i żywych. Przy stosowaniu tej techniki ważne jest prawidłowe ustawienie urządzenia LSR II oraz kalibracja maszyny przy użyciu kulek fluorescencyjnych.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

measuring-calpain-activity-in-fixed-and-living-cells-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Pomiar aktywności kalpainy w utrwalonych i żywych komórkach przez cytometrię przepływową

Ten film pokazuje znakowanie komórek neuronalnych przeciwciałami dla mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego, białka związanego z mitochondrialnym DNA i mitochondrialnego białka błony zewnętrznej, a następnie cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia ich poziomów.

Pomiar wielu parametrów mitochondrialnych w neuronach za pomocą cytometrii przepływowej

Wewnątrzkomórkowa dynamika Ca2+ jest bardzo ważna w fizjologii plemników, a barwniki fluorescencyjne wrażliwe na Ca2+ stanowią wszechstronne narzędzie do ich badania. Eksperymenty populacyjne (fluorometria i fluorometria zatrzymanego przepływu) oraz eksperymenty z pojedynczymi komórkami (cytometria przepływowa i obrazowanie pojedynczych komórek) są wykorzystywane do śledzenia zmian czasoprzestrzennych [Ca2+] w plemnikach ludzkich.

Pomiar wewnątrzkomórkowych zmian Ca2+ w ludzkich plemnikach przy użyciu czterech technik: fluorometrii konwencjonalnej, fluorometrii zatrzymanego przepływu, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek

Ten protokół opisuje czuły, komórkowy test cytotoksyczności. Wyliczając spadek częstości żywych docelowych limfocytów T CD4 + w obecności rosnącej liczby efektorowych limfocytów T CD8 +, test ten pozwala na bezpośrednią ocenę aktywności cytolitycznej limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu.

Test cytometrii przepływowej opartej na komórkach do pomiaru aktywności cytotoksycznej

Wapń bierze udział w licznych fizjologicznych i patofizjologicznych szlakach sygnałowych. Obrazowanie żywych komórek wymaga specjalistycznego sprzętu i może być czasochłonne. Zoptymalizowano szybką, prostą metodę wykorzystującą cytometr przepływowy do określenia względnych zmian wapnia cytozolowego w przylegających komórkach nabłonka wprowadzonych do zawiesiny.

Cytozolowe pomiary wapnia w komórkach nabłonka nerek za pomocą cytometrii przepływowej

Dziedziczne zaburzenia rytmu serca są często spowodowane mutacjami, które zmieniają powierzchniowe dostarczanie jednego lub więcej kanałów jonowych. Tutaj dostosowujemy testy cytometrii przepływowej, aby zapewnić ilościowe określenie względnej całkowitej i powierzchniowej ekspresji białek w rekombinowanych kanałach jonowych ulegających ekspresji w komórkach tsA-201.

Wyznaczanie względnej powierzchni komórki i całkowitej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej

Mitofagia, selektywna degradacja mitochondriów, jest związana z homeostazą mitochondriów i jest rozregulowana w różnych chorobach ludzkich. Jednak wygodne metody eksperymentalne do pomiaru aktywności mitofagii są bardzo ograniczone. Tutaj zapewniamy czuły test do pomiaru aktywności mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej.

Czuły pomiar mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu zależnego od pH reportera fluorescencyjnego mt-Keima

Efferocytoza, fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych, jest niezbędna do utrzymania homeostazy i jest ułatwiana przez receptory i szlaki sygnałowe, które pozwalają na rozpoznawanie, wchłanianie i internalizację komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania efferocytozy i aktywności efferocytarnych szlaków sygnałowych.

Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

Zapewniając czułość pojedynczej komórki, cytometria przepływowa w czasie rzeczywistym jest wyjątkowo odpowiednia do ilościowego określania funkcji receptorów multimodalnych w żywych kulturach. Wykorzystując dorosłe nerwowe komórki progenitorowe, funkcję receptora P2X7 oceniano poprzez napływ wapnia wykrywany przez barwnik wskaźnikowy wapnia, tworzenie porów transbłonowych przez wychwyt bromku etydyny i fagocytozę za pomocą fluorescencyjnych kulek lateksowych.

Cytometria przepływowa żywych komórek w czasie rzeczywistym w celu zbadania napływu wapnia, tworzenia porów i fagocytozy przez receptory P2X7 w dorosłych nerwowych komórkach progenitorowych

Tutaj opisujemy zestaw metod charakteryzujących interakcje białek z błonami komórkowymi lub mikropęcherzykami.

Analiza interakcji białek znakowanych fluorescencyjnie ze sztucznymi mikropęcherzykami fosfolipidowymi przy użyciu ilościowej cytometrii przepływowej

Obecny protokół opisuje dwie metody pomiaru aktywności kaspazy za pomocą substratu fluorogenicznego za pomocą cytometrii przepływowej lub spektrofluorometru.

Pomiar aktywności kaspazy za pomocą testu fluorometrycznego lub cytometrii przepływowej

Przedstawiamy tutaj protokół mającycy mierzenie przeżycia po stresie w próbkach drożdży. Test wykorzystuje dwa barwniki fluorescencyjne, SYTO 9 i jodek propidiu (PI), do ilościowego określenia integralności błony plazmatycznej. Wykorzystuje cytometrię przepływową do dostarczania ilościowych i powtarzalnych szacunków ułamków żywych, martwych i uszkodzonych komórek dla próbek po stresie utlencyjnym.

Zoptymalizowany test ŻYWY/MARTWY połączony z cytometrią przepływową do ilościowego przeżycia po stresie w komórkach drożdży

Poznaj metodę pomiaru aktywności kalpainy w komórkach stałych i żywych za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem fluorescencyjnego substratu. Ta technika umożliwia badanie aktywności proteaz w chorobach nowotworowych.

Pomiar aktywności kalpain w komórkach utrwalonych i żywych za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów