Name: Dechorionacja zarodków Medaka i przeszczepianie komórek w celu wytworzenia chimer (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Naucz się dechorionacji zarodków medaki i przeszczepiania komórek w celu wytworzenia chimer. Ta metoda pozwala badać autonomię genów i funkcje komórkowe w biologii rozwojowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca jest wspierana przez grant z MRC dla M. F-S.

1. Rozwój embrionów
<ol>
 <li>Po złożeniu jaja tworzą skupiska ze względu na obecność nici przylepnych na chorionie. Aby umożliwić prawidłowy rozwój embrionów, konieczne jest rozdzielenie jaj. Nici przylepne należy rozplątać i odciąć, chwytając je za pomocą dwóch pincet.</li>
 <li>Po rozdzieleniu skupisk jaja oddziela się od odchodów i alg, a następnie przenosi do świeżego medium dla embrionów, zachowując maksymalną gęstość 40 jaj na płytkę Petriego o średnicy 6cm.</li>
 <li>Embriony medaki rozwijają się nieco wolniej niż danio pręgowany w temperaturze 27°C. Czas wyklucia różni się między tymi dwoma gatunkami; embriony medaki wykluwają się z chorionu w ciągu 7 dni i natychmiast zaczynają pływać oraz żerować, podczas gdy embriony danio pręgowanego wykluwają się w ciągu 2 dni, lecz zaczynają pływać i żerować w 5-6 dniu. Rozwój medaki jest określany zgodnie z systemem stadiów Iwamatsue4.</li>
 <li>Rozwój embrionów medaki można wygodnie dostosować do planów doświadczalnych poprzez dobór odpowiedniej temperatury. Rozwój embrionów medaki można zatrzymać w temperaturze 4°C na wczesnym etapie rozwoju. Po stadium 24, kiedy rozpoczyna się bicie serca, rozwój można spowolnić, stosując temperaturę minimalną 18°C.</li>
 <li>Czas pojawienia się organów/tkanek jest u medaki nieco inny niż u danio pręgowanego, t.j. u medaki somitogeneza następuje po rozpoczęciu rozwoju mózgu, podczas gdy u danio pręgowanego somitogeneza poprzedza rozwój mózgu.</li>
</ol>
2. Usuwanie chorionu
Chorion medaka składa się z dwóch warstw ochronnych: twardej warstwy wewnętrznej i miękkiej powierzchni zewnętrznej. W związku z tym, w celu usunięcia tego chorionu konieczne jest dwuetapowe opracowanie proteazą z użyciem pronazy i enzymu wyklutowego.
Po usunięciu chorionu embriony należy przechowywać w 1X BSS. Warunki półsterylne zwiększą powodzenie hodowli embrionów po dechorionacji, szczególnie w przypadku konieczności prowadzenia dłuższej obserwacji. Obejmuje to stosowanie sterylnych roztworów (np. sterylizowanego 1X BSS z antybiotykami) oraz narzędzi sterylizowanych 70% ethanolem, a następnie płukanych 1X BSS.
Ponieważ zdechorionowane zarodki medaki są bardziej miękkie i delikatne niż zdechorionowane zarodki danio pręgowanego, należy zachować szczególną ostrożność, aby nie miały one kontaktu z powietrzem lub pęcherzykami w pipecie, ponieważ spowoduje to ich natychmiastowe zapadnięcie się. Aby zminimalizować uszkodzenia zarodków, do ich przenoszenia należy używać szerkootworowej, wypalanej szklanej pipety z pompką, a do ich orientacji podczas obserwacji – pętelki z włosa. W celu zapobiegania przywieraniu zarodków do powierzchni należy stosować nieprzylepne szalki Petriego.
<ol>
 <li>Przed dechorionacją należy sprawdzić, czy jaja zostały dostatecznie odseparowane i oczyszczone.</li>
 <li>Ponieważ zarówno pronaza, jak i enzymy wykluwające są proteinazami, należy przechowywać je w lodzie i minimalizować czas ekspozycji embrionów na te enzymy.</li>
 <li>Przenieść jaja na papier ścierny (ziarnistość p2000, wodoodporny) umieszczony w pokrywce szalki Petriego o średnicy 9 cm. Usunąć nadmiar medium, zapewniając jednocześnie pozostawienie objętości wystarczającej do zapobiegania wysychaniu embrionów.</li>
 <li>Delikatnie toczyć embriony przez około 45-60 sekund, aby usunąć część włosków z powierzchni zewnętrznej i lekko naciąć powierzchnię chorionu (Rysunek 1). Przenieść embriony z powrotem do oryginalnej szalki Petriego i zbadać. 
 
 Podczas toczenia embrionów na papierze ściernym należy używać palca wskazującego, wywierając minimalny nacisk i trzymając palec równolegle do powierzchni papieru ściernego. Nie toczyć więcej niż 5-7 embrionów jednocześnie. Środek ostrożności ten zminimalizuje ryzyko zmiażdżenia embrionów pod wpływem siebie nawzajem. 
 
 </li>
 <li>Zastąpić medium do jaj w szalce roztworem pronazy o stężeniu 20 mg/ml i inkubować embriony przez 40-60 minut w temperaturze 27°C. 
 
 Należy upewnić się, że embriony są dostatecznie przykryte pronazą, a szalka jest zamknięta pokrywką. Niewykorzystana pronaza powinna być przechowywana w lodzie podczas tego etapu, aby zminimalizować autolizę; można ją ponownie wykorzystać do czasu utraty aktywności (około 1-2 tygodni). 
 
 </li>
 <li>Odzyskać pronazę do ponownego użycia i przemyć embriony 5 razy w medium do embrionów, aby usunąć ślady pronazy, ponieważ zneutralizowałaby ona dodawany później enzym wykluwający.</li>
 <li>Usunąć medium do embrionów i przykryć embriony enzymem wykluwającym, dbając o to, aby embriony tworzyły w szalce monowarstwę. 
 
 Jeśli jaja będą leżeć jedno na drugim w szalce, te na spodzie zostaną zmiażdżone w miarę rozpuszczania się chorionu. Niewykorzystany enzym wykluwający przechowywać w lodzie. 
 
 </li>
 <li>Inkubować embriony w temperaturze 27°C, a po 15 minutach okresowo sprawdzać postęp wykluwania za pomocą stereomikroskopu. 
 
 Zauważalne będzie pojawienie się licznych otworów przypominających kratery księżycowe w wewnętrznej warstwie chorionu, która wkrótce po tym ulega rozpuszczeniu, pozostawiając miękką warstwę zewnętrzną chorionu, którą można łatwo usunąć ręcznie. Cały proces wykluwania może trwać od 15 do 60 minut. 
 
 </li>
 <li>Gdy tylko embriony wyjdą z chorionu, przenieść je do szalki Petriego zawierającej 1X BSS. 
 
 Należy uważać, aby nie przenieść enzymu wykluwającego do 1X BSS; należy dotknąć końcówką pipety powierzchni BSS, pozwalając embrionom delikatnie się wysunąć. 
 
 </li>
 <li>Po przeniesieniu wszystkich embrionów z enzymu wykluwającego, wykonać końcowe przeniesienie do kolejnej świeżej szalki z 1X BSS. 
 
 Zapewnia to, że embriony nie będą narażone na żadne pozostałości enzymu wykluwającego, który mógłby uszkodzić odsłonięte embriony. W tej końcowej szalce wszystkie embriony, które nadal posiadają zewnętrzną warstwę chorionu, można uwolnić ręcznie za pomocą wysterylizowanej mikropincety pod stereomikroskopem. 
 
 Jeśli po dechorionacji wymagana jest dalsza inkubacja embrionów, do BSS należy dodać penicylinę/streptomycynę, aby zapobiec wzrostowi bakterii. 
 
 </li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig1.jpg" alt="Rozwój zarodka danio pręgowanego, obrazy mikroskopowe A i B pokazujące strukturę komórkową i stadia wzrostu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Porównanie zarodków zwiniętych i rozwiniętych podczas dechorionacji. Zwróć uwagę, że zwinięte zarodki na panelu B nie posiadają włosków widocznych na rozwiniętych zarodkach na panelu A.
3. Montaż zdechorionowanych zarodków
Zatapianie w agarozy jest przydatne podczas dłuższego obrazowania (np. obrazowania poklatkowego) żywych embrionów, a także do szczegółowych obserwacji embrionów utrwalonych. Podczas gastrulacji i wczesnej organogenezy (od stadium 14 do stadium 28), embriony medaki wykazują fale rytmicznych ruchów kurczliwych w obrębie perydermy, warstwy tkanki pokrywającej zarówno rozwijający się embrion, jak i żółtko 5. Embriony są traktowane 3.5mM 1-heptanolem w celu zatrzymania ruchów kurczliwych 6.
Aby zatrzymać ruch zarodków po stadium 28 (64hpf), przed zatopieniem poddaje się je znieczuleniu poprzez dodanie kropel mezylanu trikainy (TMS). TMS dodaje się również do agarozy (należy dodać minimalną ilość, dawkę tę należy zoptymalizować, rozcieńczenie wynosi około 1:25).
<ol>
 <li>Odmrozić niewielką ilość 3% agarozy o niskiej temperaturze żelowania (w 1X BSS) poprzez podgrzanie do 37°C i utrzymać w tej temperaturze.</li>
 <li>Następne kroki należy wykonać szybko, aby zapobiec zastygnięciu agarozy przed zorientowaniem zarodka. Za pomocą szerokopysistej pipety szklanej przenieść taką ilość roztopionej agarozy, aby wypełnić zagłębienie zakrętki probówki typu Eppendorf.</li>
 <li>Przenieść jeden zdechorionowany zarodek do zagłębienia zakrętki, minimalizując ilość przenoszonego BSS wraz z zarodkiem. Natychmiast pobrać agarozę wraz z zarodkiem z zagłębienia zakrętki i przenieść do komory hodowlanej w szalce Petriego. 
 
 Należy użyć szalki Petriego o średnicy 3,5 cm z szklanym okienkiem na dnie. W przypadku obrazowania za pomocą mikroskopu odwróconego, zarodki orientuje się brzuchem do dołu i umieszcza blisko szkiełka nakrywkowe. W przypadku obrazowania za pomocą mikroskopu prostego, minimalizuje się grubość warstwy agarozy. </li>
 <li>Przenieść szalkę Petriego 3,5 cm do szalki Petriego o średnicy 14 cm zawierającej lód i wodę (wodę nalać do około 1/3 całkowitej głębokości dużej szalki). Mocno dociskając komorę do dna szalki Petriego 14 cm, użyć pętelki z włosa, aby delikatnie zorientować zarodek w roztopionej agarozie zgodnie z potrzebami i utrzymać go w tej pozycji do czasu zastygnięcia agarozy, delikatnie podnosząc i opuszczając mniejszą szalkę do jej pierwotnej pozycji w lodowatej wodzie.</li>
</ol>
4. Transplantacja komórek do embrionów ryby medaka
Celem niniejszej procedury jest ustalenie, czy analizowany gen działa w sposób autonomiczny komórkowo (wewnątrz komórki), czy nieautonomiczny komórkowo (między komórkami).
Komórki dawcy mogą zostać oznakowane barwnikiem śledzącym, takim jak rodamina-dekstran, przed transplantacją (zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole JoVE „Microinjection Of Medaka Embryos”) lub można wykorzystać szczep transgeniczny z ekspresją GFP, co umożliwia ocenę transplantacji. Kombinacja obu technik oznakowania jest często przydatna w celu wyeliminowania autofluorescencji, która może wystąpić. W badaniach time-lapse prowadzonych po transplantacji szczególnie przydatna jest ekspresja GFP.
Przez cały czas trwania tej procedury należy używać szklanej pipety o szerokim wylocie z pompką do pipet, a wszystkie narzędzia (w tym szkiełka) należy uprzednio wysterylizować 70% EtOH, a następnie dokładnie wypłukać sterylnym 1X BSS. Zarczepy biorące (recipient embryos) są zazwyczaj rozwinięte do około stadium 12, co umożliwia rozróżnienie bieguna brzusznego i grzbietowego podczas przeprowadzania transplantacji.
<ol>
 <li>Rozpocząć usuwanie chorionu z embrionów na 1,5 godziny przed transplantacją i przygotować aparat do iniekcji podczas inkubacji z enzymami.</li>
 <li>Umieścić szkiełko mikroskopowe z wgłębieniem w czarce Petri o średnicy 9 cm.</li>
 <li>Za pomocą sterylnej końcówki pipety nanieść niewielką ilość 3% metylocelulozy na środek wgłębienia szkiełka i rozprowadzić cienką warstwą.</li>
 <li>Suszyć metylocelulozę przez około 1-2 minuty.</li>
 <li>Dodać 350μl sterylnego 1X BSS, aby wypełnić wgłębienie szkiełka.</li>
 <li>Przenieść jeden embrion donora i do czterech embrionów biorców na szkiełko za pomocą szklanej pipety.</li>
 <li>Zorientować embriony za pomocą pętli z włosa tak, aby blastoderm embrionu był skierowany do góry. 
 
 Embriony można oprzeć o siebie, aby dodatkowo zwiększyć ich stabilność. 
 
 </li>
 <li>Ostrożnie wprowadzić mikroigłę do blastodermy donora i powoli pobrać 10-20 komórek.</li>
 <li>Ostrożnie wprowadzić igłę w wymagany obszar blastodermy embrionu biorcy i powoli wypuścić komórki. Należy zachować szczególną ostrożność podczas wprowadzania komórek do blastodermy biorcy, aby nie naruszyć granicy między komórkami a workiem żółtkowym, ponieważ spowoduje to śmierć embrionu.</li>
 <li>Wlać wysterylizowany 1X BSS do czarki Petri. 
 
 BSS należy wlewać ostrożnie, jak najbliżej ścianki czarki, aby nie poruszyć embrionów. Nigdy nie wlewać BSS bezpośrednio na embriony i dodać wystarczającą ilość BSS, aby szkiełko i embriony były całkowicie zanurzone. 
 
 </li>
 <li>Dodać do czarki 100μl penicyliny/streptomycyny i przykryć. Ostrożnie przenieść czarkę do inkubatora w temperaturze 27°C, aby umożliwić prawidłowy rozwój.</li>
 <li>Embriony można okresowo obserwować w zależności od potrzeb. Podczas stosowania transplantacji w celu przeprowadzenia eksperymentów typu gain-of-function i/lub ratowania fenotypu, niektóre zaobserwowane zmiany morfologiczne mogą wynikać z efektów samej transplantacji. Dlatego konieczne jest przeprowadzenie wielokrotnych transplantacji. Po 2-3 dniach na worku żółtkowym, głowie, oczach i tułowiu powinny pojawić się melanofory. Jeśli są obecne na transplantowanych embrionach, najprawdopodobniej udało się stworzyć udaną chimerę (Rycina 3).</li>
</ol>
W razie potrzeby przeprowadź genotypowanie zarodka/zarodków dawcy, przenosząc je do probówek do PCR zawierających 25μl proteinazy K w stężeniu 20mg/ml. Inkubuj w temperaturze 55°C przez 4 godziny, a następnie przez 10 minut w 94°C i przeprowadź reakcję PCR.
5. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig2.jpg" alt="Wzrost komórek embrionalnych; mikroskopia w świetle przechodzącym i GFP; analiza struktury komórkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Przykładowe ułożenie zarodka zatopionego w agarozie. Strona przednia znajduje się po prawej stronie, widok od strony grzbietowej. Panel B: komórki śródbłonka są widoczne po obu stronach ciała zarodka i są oznakowane za pomocą GFP sterowanego przez promotor fli.
<img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig3.jpg" alt="Etapy podziału komórek; obraz mikroskopowy; etapy 11, 15, 29; czerwone znaczniki wskazują punkty podziału." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
 Rysunek 3. Obrazy embrionów po transplantacji. Obraz A przedstawia embrion dawcy i biorcy bezpośrednio po transplantacji. Embrion dawcy znajduje się po prawej stronie i wykazuje całkowicie czerwony blastoderm (strzałka). Embrion biorcy znajduje się po lewej stronie i jest łatwo identyfikowalny dzięki małej masie czerwonych przeszczepionych komórek widocznych w blastodermie (grot strzałki). Obraz B przedstawia dwa embriony biorców około 7 godzin po transplantacji (inkubowane w 27°C). Zauważ, że przeszczepione komórki zmigrowały z miejsca transplantacji i są teraz rozproszone w blastodermie (strzałki). Obraz C przedstawia embrion biorcy w stadium st.29 (około 74hpf). Zwróć uwagę na pigmentację oka oraz obecność melanoforów w regionie tułowia i mózgu (strzałki). Widać, że komórki znakowane rhodaminą kolonizują wiele struktur embrionalnych, co wskazuje na pomyślne wytworzenie chimery.

<ol><li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li>
<li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medaka+and+zebrafish%2C+an+evolutionary+twin+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech Dev. 121, 629-6237 (2004).</li>
<li>Hirose, Y., Varga, Z. M., Kondoh, H., Furutani-Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+lineage+and+regionalization+of+cell+populations+during+Medaka+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single cell lineage and regionalization of cell populations during Medaka neurulation.</a> Development. 131, 2553-2563 (2004).</li>
<li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Zool+Sci%22%5BJournal%5D)">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Zool Sci. 11, 825-839 (1994).</li>
<li>Cope, J., Fluck, R., Nicklas, L., Plumhoff, L. A., Sincock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stellate+layer+and+rhythmic+contractions+of+the+Oryzias+latipes+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">The stellate layer and rhythmic contractions of the Oryzias latipes embryo.</a> J Exp Zool. 254, 270-275 (1990).</li>
<li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Whole+Mount+High-Resolution+Double+Fluorescent+In+Situ+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W tym filmie demonstrujemy, jak przeprowadzić dechorionację oraz transplantację komórek u embrionów medaka. Jest to potężna technika pozwalająca na wytworzenie embrionów chimerycznych w celu badania funkcji genów/białek podczas rozwoju, a także w celu wyjaśnienia autonomii badanego genu/białka. Medaka stanowią użyteczny kręgosłupowy model badawczy dla tej techniki ze względu na dobrze opracowane mapy losów komórek oraz ich przezroczystość, która sprzyja obrazowaniu in vivo w czasie rzeczywistym. Transplantację można połączyć z mikroiniekcją (zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole JoVE „Microinjection Of Medaka Embryos”), co pozwala na łatwą obserwację zachowania przeszczepionych komórek.

<table><tbody><tr><td>Pożywka dla zarodków</td><td>Odczynnik</td><td>Przygotowano wewnętrznie</td><td>N/A</td><td>200ml 50X roztworu zapasu, 1ml 1% błękitu metylenowego w H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O/10 litrów wody RO (roztwór zapasu 50X: NaCl 14,7g, KCl 0,6g, CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 2,4g, MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 4,0g/1 litr wody RO.)</td></tr><tr><td>Pinceta mikrochirurgiczna</td><td>Narzędzia</td><td>55 INOX A.DUMONT&amp;amp;FILS</td><td>N/A</td><td>Bardzo ostre, cienkie końcówki do usuwania chorionu.</td></tr><tr><td>Drobnoziarnisty wodoodporny papier ścierny – ziarnistość p2000</td><td>Narzędzia</td><td>Hermes Abrasives Ltd.</td><td>N/A</td><td>Bardzo drobna ziarnistość do toczenia/oczyszczania zarodków z chorionami.</td></tr><tr><td>3% metyloceluloza</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma</td><td>M 0512</td><td>Wysoka lepkość w celu unieruchomienia zarodków podczas transplantacji.</td></tr><tr><td>1X BSS</td><td>Odczynnik</td><td>Przygotowano wewnętrznie</td><td>N/A</td><td>20XBSS: 130g NaCl, 8g KCl, 4g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 4g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O oraz 10mg czerwieni fenolowej w 1L wody MilliQ, autoklawowanie; 500mM Hepes w wodzie MilliQ, autoklawowanie. Dodać 25ml 20XBSS i 15ml 500mM Hepes pH 7,0, uzupełnić do 500ml i wysterylizować przez filtrację przed użyciem.</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Odczynnik</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Dodawana do BSS podczas inkubacji zdechorionowanych zarodków.</td></tr><tr><td>Pronaza</td><td>Odczynnik</td><td>Calbiochem</td><td>53702</td><td>Do zdechorionowania.</td></tr><tr><td>Enzym wykluwający</td><td>Odczynnik</td><td>Przygotowano wewnętrznie</td><td>N/A</td><td>Do zdechorionowania.</td></tr><tr><td>Trikainy mezylan (TMS)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td>400mg trikainy w 97,9ml wody destylowanej i 2,1ml 1M Tris, pH dostosowane do 7; 4,2ml tego roztworu w 100ml czystej wody z akwarium.</td></tr><tr><td>3% agaroza o bardzo niskiej temperaturze żelowania</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma</td><td>A-2576</td><td>Typ IX-A. Stosowana podczas zatapiania zarodków do obserwacji.</td></tr><tr><td>Komora hodowlana wypracowana z płytki Petriego</td><td>Narzędzie</td><td>Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.</td><td>11-004-008</td><td>Szklana płytka Iwaki 35mm z okienkiem 12mm. Stosowana podczas zatapiania zarodków do obserwacji.</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sprzęt</td><td>Narishige</td><td>N/A</td><td>Model MN151. Do usuwania i wprowadzania komórek podczas transplantacji.</td></tr><tr><td>Kapilary z borokrzemianowego szkła</td><td>Narzędzie</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC100-10T</td><td>Do tworzenia igieł transplantacyjnych.</td></tr><tr><td>Wypalarka/wyciągacz mikropipet Brown</td><td>Sprzęt</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-97</td><td>Do tworzenia igieł transplantacyjnych.</td></tr></tbody></table>

dechorionizacja zarodków ryby medaka i transplantacja komórek w celu generowania chimer

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka to mała, składająca jaja ryba słodkowodna, która umożliwia przeprowadzanie analiz genetycznych i embriologicznych i jest jednym z trzech kręgowców wykorzystywanych jako organizmy modelowe, w których przeprowadzono genomowe badania przesiewowe mutantów oparte na fenotypie 1. Rozbieżność w funkcjonalnym nakładaniu się pokrewnych genów między medaką a danio przebrzosym pozwala na identyfikację nowych fenotypów, których nie można wykryć u jednego gatunku 2, przez co medaka i danio przebrzosim są komplementarne w kontekście genetycznej analizy funkcji genomu kręgowców. Manipulacje z embrionami medaki, takie jak usuwanie otoczki jajowej (dechorionizacja), montowanie embrionów do obrazowania oraz transplantacja komórek, stanowią kluczowe procedury pracy z medaką i danio przebrzosim w warunkach laboratoryjnych. Transplantacja komórek służy do badania autonomii komórkowej mutacji u medaki. Chimery są generowane poprzez transplantację znakowanych komórek z embrionów dawców do nieznakowanych embrionów biorców. Komórki dawcy mogą być transplantowane do określonych obszarów embrionów biorców w oparciu o mapy losów 3, tak aby klony z transplantowanych komórek mogły zostać zintegrowane z interesującą nas tkanką podczas rozwoju. Ze względu na twardą otoczkę jajową i delikatne embriony, manipulacje z embrionami medaki są bardziej skomplikowane niż w przypadku danio przebrzosima. W niniejszym filmie przedstawiamy szczegółowe procedury manipulacji z embrionami medaki.

Ze względu na twardy chorion i delikatne embriony, manipulacja zarodkami medaki jest bardziej skomplikowana niż w przypadku danio prążkowanego. W tym filmie zaprezentowano krok po kroku procedury manipulacji embrionami medaki, w tym usuwanie chorionu (dechorionację), unieruchamianie w agarozie do obrazowania oraz transplantację komórek w celu wytworzenia chimer. Procedury te są niezbędne do wykorzystania medaki i danio prążkowanego w laboratorium, aby w pełni skorzystać z ich komplementarnych cech w badaniach nad funkcjami genomu kręgowców.

Dechorionizacja zarodków ryby medaka i transplantacja komórek w celu generowania chimer

Medaka to mała, słodkowodna ryba składająca jaja, która umożliwia zarówno analizy genetyczne, jak i embryologiczne, i jest jednym z trzech organizmów modelowych wśród kręgowców w...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie klonów w embrionie w celu zbadania autonomii wybranego genu lub białka. Jest to osiągane poprzez znakowanie embrionów dawcy dekstranem Rod Domine za pomocą mikroiniekcji w stadium jednej komórki, zgodnie z instrukcją przedstawioną w materiale towarzyszącym do tego filmu: mikroiniekcja embrionów Maka. Drugim krokiem procedury jest doprowadzenie embrionów dawcy i biorcy do odpowiedniego stadium rozwoju.Trzecim krokiem procedury jest powlekanie zarodków zarówno dawcy, jak i biorcy. Ostatnim etapem procedury jest transplantacja komórek z oznakowanych zarodków dawcy do zarodków biorcy. Ostatecznie wyniki można uzyskać, analizując dystrybucję, proliferację i różnicowanie klonów komórek transplantowanych poprzez wykrywanie tych komórek za pomocą fluorescencji lub markerów linii komórkowych.Cześć, nazywam się Sean Brazinski i pracuję w laboratorium dr. Makoto Fki na Wydziale Biologii i Biochemii Uniwersytetu w Bath. Jestem również członkiem laboratorium Zeki. Dzisiaj przedstawimy procedurę transplantacji komórek do embrionów ryb w ciemności.W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę, aby zbadać, czy wybrany gen lub mutacja wykazuje funkcję komórkową lub niekomórkową (autonomiczną lub nieautonomiczną). Zacznijmy zatem. Podczas powlekania jaj mącznika używaj sterylnych roztworów i narzędzi, aby zwiększyć szansę na sukces w długoterminowej obserwacji i hodowli.Umieść kawałek wodoodpornego papieru ściernego o ziarnistości P 2000 w pokrywce nieprzywierającej szalki Petriego o średnicy 9 cm. Użyj pipety z polerowanego szkła o szerokim wylocie, aby przenieść do 10 świeżo rozdzielonych, oczyszczonych i oznakowanych jaj z szalki z medium dla jaj na papier ścierny.Usunąć nadmiar pożywki, pozostawiając w naczyniu jedynie taką ilość, która zapobiegnie wysychaniu jaj. Używając opuszka palca w rękawiczce, delikatnie przetaczać po papierze ściernym 10 jaj naraz przez 45 do 60 sekund. Aby usunąć włoski z zewnętrznej powierzchni i naciąć powierzchnię Corian, przyłożyć minimalny nacisk i prowadzić opuszek palca równolegle do papieru ściernego.Przenieść jaja do pierwotnej szalki z pożywką. Usunąć pożywkę, a następnie pokryć jaja roztworem prone o stężeniu 20 mg/mL. Przykryć szalkę i inkubować w temperaturze 27 °C przez 60 minut.Należy upewnić się, że szalka jest ustawiona pod kątem, aby embriony były w dostatecznym stopniu zanurzone w enzymie. W celu zminimalizowania ilości wymaganego enzymu, należy użyć plastikowej pipety transferowej do odzyskania pronazy w celu ponownego wykorzystania i umieścić ją na lodzie. Jaja należy przemyć pięciokrotnie w medium dla embrionów, aby usunąć wszelkie ślady pronazy i zapobiec trawieniu enzymu wykluwającego.Dodać odpowiednią ilość enzymu wylęgowego, aby przykryć wypłukane jaja. Należy upewnić się, że jaja pozostają w jednej warstwie na dnie naczynia, aby uniknąć ich zmiażdżenia podczas rozpuszczania Corianu. Inkubować jaja w temperaturze 27 °C.Należy upewnić się, że szalka jest ustawiona pod kątem, tak aby embriony były wystarczająco zanurzone w enzymie. Aby zminimalizować ilość wymaganego enzymu, należy kontrolować postępy pod stereomikroskopem operacyjnym; w wewnętrznej warstwie chorionu pojawią się podobne otwory przed jego całkowitym rozpuszczeniem. Proces ten może trwać do 60 minut, w zależności od aktywności enzymu.Gdy niewielka część chorionu zostanie rozpuszczona, natychmiast odessać poszczególne jajo pipetą, aby zapobiec trawieniu zarodka przez enzym wylęgowy. Przenieść jajo do czystego naczynia zawierającego 1x BSS, delikatnie dotykając końcówką pipety powierzchni naczynia z 1x BSS i pozwalając jajku się wysunąć, aby zminimalizować przenoszenie enzymu wylęgowego. Po przeniesieniu wszystkich jaj z enzymu wylęgowego, pozostałości chorionu usunąć za pomocą pęsety.Przenieś próbkę ostatecznie do nowej szalki zawierającej 1× BBSS. Dodaj antybiotyki, jeśli embriony mają zostać doprowadzone do późniejszego etapu rozwoju zarodkowego. Po zakończeniu przygotowań do tej procedury, rozpocznij usuwanie otoczki z embrionów w stadium 12 na 1,5 godziny przed transplantacją. Używając końcówki pipety, dodaj niewielką ilość 3% metylocelulozy do centrum komory mikroskopu.Przesuń dziewięciocentymetrową szalkę Petriego. Cienko rozprowadź ciecz po powierzchni wgłębienia. Susz metylocelulozę przez dwie minuty.Pod mikroskopem stereoskopowym wypełnij wgłębienie szkiełka 350 µL sterylnego jednokrotnego roztworu BSS. Za pomocą szklanej pipety o szerokim wylocie, wypolerowanej ogniowo, przenieś na szkiełko jeden embrion donora i do czterech embrionów biorców. Użyj pętelki z włosa, aby ustawić embriony tak, by blastoderm był skierowany ku górze.W razie potrzeby oprzeć zarodki o siebie dla zachowania stabilności. Delikatnie wprowadzić mikroiżkę do donora blastodermu. Powoli pobrać od 10 do 20 komórek.Teraz ostrożnie wprowadź igłę do odpowiedniego obszaru blastodermy embrionu biorcy, a następnie powoli wprowadź komórki dawcy. Nie naruszaj granicy pęcherzyka żółtkowego. Ostrożnie wypełnij szalkę Petriego około 30 ml sterylnego 1× BSS, aby zanurzyć embriony i odseparować je od metylocelulozy.Wlewać po ściance naczynia, aby nie naruszyć embrionów. Dodać do naczynia 100 µL penicyliny i streptomycyny, aby uzyskać przybliżone stężenie 0,3%. Przykryć naczynie. Obserwować embriony okresowo, w razie potrzeby.W przypadku dłuższych badań obrazowych, takich jak time-lapse oraz szczegółowe obserwacje, należy zatopić żywe, pokryte embriony w agarozie. Aby zapobiec ruchom żywych embrionów, do medium zawierającego embriony należy dodać odpowiedni środek znieczulający. Roztopić około 1 ml 3% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 1× BSS i utrzymać ją w temperaturze 37 °C. W razie potrzeby do agarozy należy dodać odpowiednią ilość środka znieczulającego, aby zapobiec drganiom. Pracując szybko, aby zapobiec krzepnięciu, należy użyć pipety Pasteura z szerokim otworem, aby wypełnić wgłębienie zakrętki probówki do mikrocentryfugi agarozą.Za pomocą pipety o szerokim wlocie przenieś jeden pokryty i znieczulony embrion do aros znajdującego się w zakrętce. Przenieś jak najmniejszą ilość medium wraz z embrionem. Natychmiast zaktualizuj aros oraz embrion i przenieś je do szklanej szalki Petriego o średnicy 3,5 centymetra z płaskim dnem.Przenieś naczynie do naczynia o średnicy 14 centymetrów wypełnionego w jednej trzeciej mieszaniną lodu i wody. Mocno dociśnij mniejsze naczynie do dna większego naczynia pod stereomikroskopem sekcyjnym. Użyj pętelki z włosa, aby szybko zorientować embrion w pożądany sposób.Należy utrzymywać zarodek w bezruchu do momentu zastygnięcia agaru. Teraz można przystąpić do obrazowania zarodka. Zdjęcie A przedstawia zarodek dawcy i biorcy bezpośrednio po transplantacji.Po prawej stronie przedstawiono embrion donora z całkowicie czerwono oznakowaną warstwą blastodermy. Po lewej stronie znajduje się embrion biorcy, który można łatwo zidentyfikować po małej masie czerwonych przeszczepionych komórek widocznych w obrazie blastodermy. B pokazuje dwa embriony biorców około siedem godzin po przeszczepieniu. Zauważ, że przeszczepione komórki przemieściły się z miejsca transplantacji i są teraz rozproszone w obrębie blastodermy.Obraz derm C przedstawia embrion biorcy w stadium 29. Zauważ pigmentację oka oraz obecność mefor w regionie tułowia i mózgu. Widoczne jest, że komórki znakowane rod domine kolonizują wiele struktur embrionalnych, co wskazuje na pomyślne wytworzenie chimery.Właśnie pokazaliśmy, jak przygotować embriony ryb medaka i przeprowadzić transplantację komórek na wczesnym etapie embrionalnym. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby transplantować komórki dawcy do odpowiedniego obszaru blastuli biorcy. Pozwoli to komórkom dawcy zróżnicować się w odpowiedni typ komórek.To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.

dechorionation-medaka-embryos-cell-transplantation-for-generation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Dechorionacja zarodków Medaka i przeszczep komórek w celu wygenerowania chimer

Przewodnik krok po kroku po generowaniu ukierunkowanych chimerycznych zarodków danio przewrotnego poprzez transplantację w stadium blastuli lub gastruli.

Generowanie chimerycznych embrionów ryby danio przez transplantację

Transplantacja komórek u rybek zebrafish umożliwia połączenie genetyki i embriologii w celu generowania chimer specyficznych dla danej tkanki. Niniejsze wideo demonstruje transplantacje komórek na etapie gastruli, które pozwoliły naszemu laboratorium zbadać role populacji astroglialnych oraz specyficznych sygnałów prowadzących podczas formowania się spoiw w przedmózgowiu.

Chimery embrionalne z ukierunkowaniem tkankowym: transplantacja komórek gastruli rybki danio-pręgawki

Prezentujemy protokół generowania chimerycznych embrionów rybek danio w celu obrazowania na żywo zachowania komórek podczas embriogenezy.

Transplantacja blastomerów wykazujących ekspresję GFP w celu obrazowania na żywo rozwoju siatkówki i mózgu w chimerycznych embrionach danio pręgowanego

Medaka i zebrafish są komplementarne w kontekście genetycznej analizy funkcji genomu kręgowców. Niniejszy protokół podkreśla kluczowe punkty niezbędne do skutecznego mikroiniekcji do embrionów medaka, co stanowi istotną technikę w analizach embriologicznych i genetycznych z wykorzystaniem medaka i zebrafish w warunkach laboratoryjnych.

Mikroiniekcja embrionów ryby medaka w celu zastosowania jako modelowego organizmu genetycznego

Opisano podejście do analizy migracji i ostatecznego losu ptasich komórek grzebienia neuronalnego w embrionach chimerycznych przepiórnik-kurczak. Metoda ta stanowi prostą i przejrzystą technikę śledzenia komórek grzebienia neuronalnego podczas migracji i różnicowania, których w przeciwnym razie trudno byłoby odróżnić w niezmodyfikowanym embrionie kurczaka.

Analiza migracji i różnicowania grzebienia neuronalnego za pomocą transplantacji międzygatunkowej

Małe ryby laboratoryjne stały się popularnymi modelami do badań nad mechanizmami leżącymi u podstaw zaburzeń kości u ludzi oraz do badań przesiewowych leków modulujących kości. W niniejszym raporcie opisano protokół oceny wpływu alendronianu na komórki kostne larw medaka ze zmianami osteoporotycznymi.

Leczenie farmakologiczne i obrazowanie in vivo interakcji osteoblast-osteoklast w modelu osteoporozy ryb Medaka

Śledzenie na żywo poszczególnych komórek progenitorowych siatkówki WT w różnych tłach genetycznych pozwala na ocenę udziału nieautonomicznej sygnalizacji komórek podczas neurogenezy. W tym celu wykorzystano kombinację knockdownu genów, generowania chimer poprzez przeszczep zarodka i poklatkowego obrazowania konfokalnego in vivo.

In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek

Tutaj prezentujemy protokół zwiększający produkcję chimer bez użycia nowego sprzętu. Prosta zmiana orientacji zarodka do wstrzyknięcia może zwiększyć liczbę produkowanych zarodków i potencjalnie skrócić czas do transmisji w linii zarodkowej.

Wstrzyknięcie masy komórkowej trans-wewnętrznej embrionalnych komórek macierzystych prowadzi do wyższych wskaźników chimeryzmu

Tym celem tego protokołu jest produkcja chimerycznych aksolotli z haploidalnymi kończynami przednimi pochodzącymi z tkanki dawcy zmutowanej, Cas9, przy użyciu technik przeszczepu tkanek embrionalnych.

Pokolenie chimerycznych aksolotli ze zmutowanymi haploidalnymi kończynami poprzez szczepienie embrionalne

Manipulacje embriologiczne, takie jak eksterminacja i przeszczepianie komórek, są ważnymi narzędziami do badania wczesnego rozwoju. Protokół ten opisuje proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania do wykonywania tych manipulacji w zarodkach danio pręgowanego.

Proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania zarodków danio pręgowanego

Naucz się dechorionacji zarodków medaki i przeszczepiania komórek w celu wytworzenia chimer. Ta metoda pozwala badać autonomię genów i funkcje komórkowe w biologii rozwojowej.

Dechorionizacja zarodków ryby medaka i transplantacja komórek w celu generowania chimer

Przeglądaj więcej filmów