Dechorionacja zarodków Medaka i przeszczepianie komórek w celu wytworzenia chimer

Ze względu na twardą kosmówkę i miękkie zarodki, manipulacja embrionami medaka jest bardziej skomplikowana niż u danio pręgowanego. Ten film pokazuje krok po kroku procedury, jak manipulować zarodkami medaka, w tym dechorionację, montaż w agarozie w celu obrazowania i przeszczep komórek w celu produkcji chimer. Procedury te są niezbędne do wykorzystania medaki i danio pręgowanego w laboratorium, aby w pełni wykorzystać ich uzupełniające się cechy do genetycznej analizy funkcji genomu kręgowców.

Ogólnym celem tej procedury jest wyprodukowanie klonów w zarodku w celu zbadania autonomii genu lub białka będącego przedmiotem zainteresowania. Osiąga się to poprzez znakowanie zarodków dawcy dekstranem Rod Domine poprzez mikroiniekcję na jednym etapie komórki, jak pokazano w towarzyszu do tego filmu, mikroiniekcja zarodków Maka. Drugim etapem zabiegu jest doprowadzenie zarodków dawcy i biorcy do właściwego stadium zarodka.

Trzecim etapem zabiegu jest pokrycie zarodków zarówno dawcy, jak i biorcy. Ostatnim etapem zabiegu jest przeszczepienie komórek z oznaczonych zarodków dawcy do zarodków biorcy. Ostatecznie wyniki można uzyskać, analizując dystrybucję, proliferację i różnicowanie klonów przeszczepionych komórek poprzez wykrywanie przeszczepionych komórek za pomocą ich znaczników fluorescencyjnych lub liniowych.

Cześć, nazywam się Sean Brazinski i pracuję w laboratorium dr Makoto Fki na Wydziale Biologii i Biochemii Uniwersytetu w Bath. Ja też jestem z laboratorium Zeki. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę przeszczepu komórek w zarodkach ciemnych ryb.

Używamy tej procedury w naszym laboratorium do badania z genem lub mutacją, która jest przedmiotem zainteresowania, ma autonomiczną funkcję komórkową lub niekomórkową. Więc zacznijmy. Podczas powlekania jaj maka używaj sterylnych roztworów i narzędzi, aby zwiększyć sukces długotrwałej obserwacji i hodowli.

Umieść kawałek wodoodpornego papieru ściernego o ziarnistości P 2000 w pokrywie dziewięciocentymetrowej, nieprzylegającej szalki Petriego. Użyj szerokich otworów, aby wypalić wypolerowaną pipetę do makaronu, aby przenieść do 10 świeżo niezgrupowanych, oczyszczonych i oznaczonych jajek z naczynia z jajkami. Średni do papieru ściernego.

Usuń nadmiar podłoża, pozostawiając w naczyniu tylko tyle, aby jajka nie wyschły. Opuszkiem palca w rękawiczce delikatnie roztaczaj 10 jajek na raz po papierze ściernym przez 45 do 60 sekund. Aby usunąć włoski z zewnętrznej powierzchni i naciąć powierzchnię Corianu, zastosuj minimalny nacisk i trzymaj opuszkę palca równolegle do papieru ściernego.

Przenieś jajka do oryginalnego naczynia na podłożu. Usuń pożywkę, przykryj jajka roztworem 20 miligramów na mililitr leżenia. Przykryj naczynie i inkubuj w temperaturze 27 stopni Celsjusza przez 60 minut.

Pamiętaj, aby ustawić naczynie pod kątem, aby zarodki były wystarczająco zanurzone w enzymie. Aby zminimalizować zapotrzebowanie na enzym, użyj plastikowej pipety transferowej, aby odzyskać pronazę do ponownego użycia i umieść ją na lodzie. Umyj jaja pięć razy na pożywce zarodkowej, aby usunąć wszelkie ślady podatności i zapobiec trawieniu enzymu wylęgowego.

Dodaj tyle enzymu wylęgowego, aby przykryć umyte jaja. Upewnij się, że jajka pozostają w jednej warstwie na dnie naczynia, aby uniknąć zmiażdżenia podczas rozpuszczania się Corianu. Wysiaduj jaja w temperaturze 27 stopni Celsjusza.

Pamiętaj, aby ustawić naczynie pod kątem, aby zarodki były wystarczająco zanurzone w enzymie. Aby zminimalizować wymagany przez enzym postęp kontroli pod mikroskopem stereoskopowym, w wewnętrznej warstwie Corianu pojawią się podobne otwory, zanim całkowicie się rozpuści. Proces ten może potrwać do 60 minut w zależności od aktywności enzymu.

Gdy niewielka część Corianu zostanie rozpuszczona, natychmiast zassaj pojedyncze jajo za pomocą pipety, aby uniknąć trawienia zarodka przez enzym wylęgowywający. Przenieś do czystego naczynia z jednorazowym BSS, delikatnie dotykając końcówką pipety czystego naczynia z jednorazowym BSS i pozwól jaju się roztoczyć, aby zminimalizować przenoszenie enzymu wylęgowego. Użyj kleszczy, aby usunąć resztę Corianu, gdy wszystkie jaja zostaną przeniesione z enzymu wylęgowego.

Wykonaj ostateczny transfer do nowego naczynia jednorazowego BBSS. Dodaj antybiotyki, jeśli zarodki mają zostać doprowadzone do późniejszego etapu rozwoju embrionalnego Po dekoracji do tej procedury, rozpocznij etap powlekania 12 zarodków na 1,5 godziny przed przeszczepem. Użyj końcówki pipety, aby dodać niewielką ilość 3% metylocelulozy do środka mikroskopu wnękowego.

Wsuń dziewięciocentymetrową szalkę Petriego. Rozprowadź cienką ciecz na powierzchni zagłębienia. Suszyć metylocelulozę przez dwie minuty.

Napełnij wgłębienie szkiełka 350 mikrolitrami sterylnego jednorazowego BSS pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj pipety z polerowanego szkła z szerokim otworem, aby przenieść jeden zarodek dawcy i do czterech biorców na szkiełko. Użyj pętli do włosów, aby ustawić zarodki tak, aby skóra właściwa blastera była skierowana do góry.

W razie potrzeby oprzyj zarodki o siebie, aby uzyskać stabilność. Delikatnie włóż mikroigłę do urządzenia do usuwania dawców. Derm. Powoli pobieraj od 10 do 20 komórek.

Teraz delikatnie włóż igłę w odpowiedni obszar skóry biorcy blastera zarodków, powoli wydalaj komórki dawcy. Nie naruszaj granicy worka wiolonczelowego. Ostrożnie napełnij szalkę Petriego około 30 mililitrami sterylnego jednorazowego BSS, aby zanurzyć zarodki i uwolnić zarodki od metylocelulozy.

Wylej na bok naczynia, aby nie zakłócić zarodków. Dodaj 100 mikrolitrów streptomycyny penicyliny do naczynia, aby uzyskać przybliżone stężenie 0,3%Przykryj naczynie. W razie potrzeby należy okresowo obserwować zarodki.

W przypadku dłuższych badań obrazowych, takich jak obserwacje poklatkowe i szczegółowe, należy osadzić żywe zarodki powlekane w znieczuleniu aros, aby zapobiec ruchowi, dodając odpowiedni środek znieczulający do podłoża zawierającego zarodki, topić około jednego mililitra 3%Niska temperatura topnienia powstała w jednym czasie BSS i utrzymuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W razie potrzeby dodaj odpowiednią ilość środka znieczulającego do aros, aby zapobiec drgawkom, działając szybko, aby zapobiec zestaleniu, użyj pipety do makaronu z szerokimi otworami, aby napełnić nakrętkę. Wgłębienie mikroprobówki wirówkowej z aros.

Użyj pipety z szeroką parążką, aby przenieść jeden pokryty i znieczulony zarodek do aros w czapce. Przenieś jak najmniej podłoża z zarodkiem. Natychmiast zaktualizuj aros i zarodek i przenieś je na szalkę Petriego ze szklanym dnem o grubości 3,5 centymetra.

Przenieś naczynie do 14-centymetrowego naczynia wypełnionego w jednej trzeciej mieszanką lodu i wody. Przytrzymaj mniejsze naczynie mocno na dnie większego naczynia pod mikroskopem stereoskopowym do preparowania. Użyj pętli do włosów, aby szybko zorientować zarodek zgodnie z potrzebami.

Trzymaj zarodek nieruchomo, aż agro zastygnie. Zarodek można teraz zobrazować. Zdjęcie A przedstawia zarodek dawcy i biorcy bezpośrednio po przeszczepie.

Zarodek dawcy jest pokazany po prawej stronie z całkowicie czerwono oznaczoną skórą skórną w gipsie. Zarodek biorcy jest pokazany po lewej stronie i można go łatwo zidentyfikować po niewielkiej masie czerwonych przeszczepionych komórek widocznych na zdjęciu B skóry blastera; obraz B przedstawia dwa zarodki biorcy około siedmiu godzin po przeszczepie. Zauważ, że przeszczepione komórki wyemigrowały z miejsca przeszczepu i są teraz rozproszone po blasterze.

Obraz skóry C przedstawia zarodek biorcy w stadium 29. Zwróć uwagę na pigmentację oka i obecność meforu w okolicy tułowia i mózgu. Można zaobserwować, że komórki znakowane dominą pręcików kolonizują wiele struktur embrionalnych, co wskazuje na udaną produkcję chimery.

Właśnie pokazaliśmy, jak jeść zarodki ryb meca i przeprowadzać przeszczep komórek we wczesnym stadium embrionalnym. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o przeszczepieniu komórek dawcy w odpowiednie miejsce biorcy, u którego wykonano zabieg. Umożliwi to komórkom dawcy różnicowanie się w prawidłowy typ komórek.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.