Name: Wytwarzanie rekombinowanego wirusa grypy z plazmidowego DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Naucz się wytwarzać rekombinowany wirus grypy z plazmidowego DNA poprzez transfekcję komórek 293T i MDCK. Ta metoda umożliwia badaczom amplifikację wirusa i jego zastosowanie w rozwoju szczepionek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować byłym i obecnym członkom laboratoriów Adolfo García-Sastre i Petera Palese za opracowanie technik genetyki odwrotnej oraz plazmidów dla wirusa grypy. Badania w laboratoriach AG-S są częściowo finansowane przez CRIP, Centrum Doskonałości w zakresie Badań i Nadzoru nad Grypą finansowane przez NIAID (HHSN266200700010C) oraz granty NIAD R01AI046954, U01AI070469 i P01AI058113. Badania w laboratorium LM-S są częściowo finansowane z grantu NIAID RO1AI077719.

1. Transfekcja w celu odzyskania wirusa grypy
Wirus grypy A należy do rodziny Orthomyxoviridae otoczkowych wirusów RNA o ujemnej polarności nici. Genom wirusa grypy A składa się z ośmiu różnych genów RNA o ujemnej polarności, które kodują co najmniej 11 białek wirusowych (Rycina 1) 4. W niniejszym opracowaniu skupimy się na ratowaniu jednego z najczęstszych szczepów laboratoryjnych, grypy A/PR/8/34, 5 przy użyciu plazmidów ambisensownych (pDZ) zawierających 8 segmentów wirusowych grypy A/PR/8/34 (Rycina 2).
W celu odzyskania rekombinowanych wirusów grypy z plazmidowego DNA zalecamy przeprowadzenie 3 niezależnych transfekcji dla każdego rekombinowanego wirusa. W przypadku próby odzyskania więcej niż jednego rekombinowanego wirusa, należy odpowiednio przeskalować poniższe kroki zgodnie z liczbą wirusów przeznaczonych do odzyskania. Poniższy protokół transfekcji i infekcji opracowano dla płytek 6-dołkowych. Schematyczny przebieg protokołu przedstawiono na Ryc. 3.
<ol>
 <li>Mieszanina OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000): Na jedną transfekcję przygotować 250 μl pożywki OptiMEM oraz 6-8 μl LPF2000. Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej (RT). W tym czasie przygotować mieszaninę do transfekcji plazmidowej.</li>
 <li>Mieszanina do transfekcji plazmidowej: Przygotować koktajl do transfekcji plazmidowej w 50 μl pożywki OptiMEM. Zazwyczaj stosujemy 1 μg każdego plazmidu DNA grypy na jedną próbę ratowania wirusa (rescue). Do probówki zawierającej 50 μl pożywki OptiMEM dodać po 1 μl plazmidów pDZ (w stężeniu 1 μg/μl) PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M oraz NS.</li>
 <li>Mieszanina OptiMEM-LPF2000-plazmid DNA: Dodać 250 μl z kroku 1.1 do mieszaniny do transfekcji plazmidów DNA grypy (krok 1.2). Inkubować tę mieszaninę przez 20-30 minut w RT. W tym czasie przygotować zawiesiny komórek 293T i MDCK do transfekcji.</li>
 <li>Przygotowanie kokultury 293T/MDCK: Przed rozpoczęciem doprowadzić PBS 1X, pożywkę DMEM 10%FBS 1% PS oraz mieszaninę EDTA-trypsyny do temperatury 37°C. W dniu transfekcji gęstość komórek powinna wynosić 80-90% konfluencji. Zazwyczaj jedna konfluentna szalka 100 mm komórek 293T i jedna konfluentna szalka 100 mm komórek MDCK wystarczają na 10-12 prób ratowania wirusa. Stosujemy 250 μl komórek na dołek. Obie linie komórkowe zostaną resuspendowane w łącznej objętości 3 ml DMEM 10%FBS 1%PS.
 <ul>
 <li>Każdą linię komórkową ostrożnie resuspendować w 10 ml DMEM 10%FBS 1%PS w probówce wirówkowej 15 ml. Przygotować oddzielną probówkę dla komórek 293T i oddzielną dla komórek MDCK.</li>
 <li>Komórki 293T resuspendować w 3 ml DMEM 10%FBS 1%PS, a następnie przenieść te 3 ml do komórek MDCK, aby je resuspendować. W ten sposób powstanie mieszanina komórek 293T i MDCK do wykorzystania w kokulturze.</li>
 <li>Dodać 250 μl komórek 293T/MDCK na dołek (10-12 dołków w płytce 6-dołkowej).</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Po 20-30 minutach inkubacji w RT (krok 1.3), dodać 1 ml DMEM 10%FBS 1%PS do mieszaniny OptiMEM-LPF2000-plazmid DNA grypy.</li>
 <li>Dodać 1,3 ml (krok 1.5) do dołków zawierających 250 μl komórek 293T/MDCK (krok 1.4).</li>
 <li>Delikatnie potrząsnąć płytką 6-dołkową i inkubować transfekcję przez noc (ON) w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
 <li>Następnego dnia, około 16-24 godziny po transfekcji, wymienić pożywkę do transfekcji i inkubować transfekowane komórki w DMEM 0,3%BA 1%PS zawierającym 1 μg/ml TPCK-trypsyny przez 48 godzin.</li>
 <li>Po 48 godzinach od wymiany pożywki przenieść nadsącz z transfekowanych komórek do probówki do mikrowirówki.</li>
 <li>Wirować nadsącz z hodowli tkankowej w mikrowirówce przez 1-2 minuty przy 13 000 rpm.</li>
 <li>Zainfekować świeże komórki MDCK w płytkach 6-dołkowych (wysiane dzień wcześniej) lub 10-dniowe zarodki kurzych jaj 200 μl odwirowanego nadsączu z hodowli tkankowej z kroku 1.10. Inkubować komórki i/lub jaja w 37°C przez 2-3 dni.
 <ol>
 <li>Infekcja 10-dniowych zarodków kurzych jaj: Wszystkie procedury infekcji zarodków kurzych jaj wykonuje się w warunkach sterylnych.
 <ol>
 <li>Prześwietlić 10-dniowe jaja za pomocą lampy do prześwietlania, aby zobaczyć granicę między workiem powietrznym a jamą allantoiczną. Zaznaczyć granicę ołówkiem.</li>
 <li>Za pomocą igły strzykawki 5 ml wykonać otwór w skorupce jaja.</li>
 <li>Za pomocą strzykawki 1 ml zainfekować każde jajo 200 μl nadsączu z hodowli tkankowej z kroku 1.10.</li>
 <li>Zakryć otwór w skorupce jaja roztopionym woskiem za pomocą patyczka higienicznego.</li>
 <li>Inkubować zainfekowane jaja w 37οC przez 2-3 dni.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Infekcja świeżych komórek MDCK: Dzień przed pasażowaniem nadsączu z hodowli tkankowej z kokultur 293T/MDCK, przygotować płytki 6-dołkowe z komórkami MDCK tak, aby następnego dnia osiągnęły 80-90% konfluencji. Zazwyczaj konfluentną płytkę tkankową 100 mm można podzielić na 6-8 dołków. Przemyć komórki dwukrotnie PBS 1X, trypsynizować i przygotować płytki 6-dołkowe. Delikatnie potrząsnąć płytkami ręcznie, aby uzyskać jednorodne rozłożenie komórek. Hodować komórki przez noc (ON) w inkubatorze 37°C, 5% CO2. Przed infekcją sprawdzić komórki pod mikroskopem w celu potwierdzenia obecności monowarstwy, a następnie przystąpić do infekcji:
 <ul>
 <li>Przemyć komórki dwukrotnie 1 ml PBS 1X.</li>
 <li>Zainfekować 200 μl odwirowanego nadsączu z hodowli tkankowej przez 1 godzinę w RT. Nie dopuścić do wyschnięcia komórek. Kołysać płytką 6-dołkową co 10 minut.</li>
 <li>Po 1 godzinie adsorpcji wirusa usunąć pożywkę do infekcji z komórek MDCK i dodać 2 ml DMEM 0,3%BA 1%PS zawierającego 1 μg/ml TPCK-trypsyny.</li>
 <li>W czasie 48-72 godzin po pasażu, zależnie od wydajności transfekcji i ładunku wirusowego, w zainfekowanych komórkach MDCK zaobserwowany zostanie efekt cytopatyczny (CPE). CPE sugeruje pomyślne ratowanie wirusa. Należy jednak przeprowadzić test HA (sekcja 2), aby potwierdzić obecność wirusa w nadsączach z hodowli tkankowej.</li>
 </ul>
 </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Zbiór płynu allantoicznego z zainfekowanych zarodków kurzych jaj: Wszystkie procedury zbioru płynu allantoicznego z zainfekowanych jaj wykonuje się w warunkach sterylnych. Z każdego zainfekowanego 10-dniowego jaja można zebrać około 8-12 ml płynu allantoicznego. Przed zbiorem płynu allantoicznego inkubować jaja kurze przez 2 godziny (lub przez noc ON) w 4°C, aby zabić zarodek i spowodować koagulację krwi.
 <ul>
 <li>Przemyć skorupki jaj 70% etanolem w celu zapewnienia sterylności.</li>
 <li>Ostrożnie otworzyć jajo nad jamą powietrzną, uderzając łyżką. Usunąć rozbitą skorupkę za pomocą pęsety.</li>
 <li>Za pomocą igły 1 ml usunąć błonę allantoiczną, nie uszkadzając żółtka.</li>
 <li>Ustabilizować zarodek kurzego jaja szpatułką, wprowadzając pipetę 10 ml do płynu allantoicznego. Zebrać jak najwięcej płynu allantoicznego do probówki wirówkowej 15 ml w pojemniku z lodem, unikając rozbicia lub pobrania żółtka. Użyć oddzielnej probówki 15 ml dla każdego jaja.</li>
 <li>Wirować przez 5 minut w 4°C i przenieść płyn allantoiczny (bez osadu z erytrocytów) do świeżych probówek wirówkowych 15 ml.</li>
 <li>Przechowywać probówki z odwirowanym płynem allantoicznym w 4°C do czasu sprawdzenia obecności uratowanego wirusa za pomocą testu hemaglutynacji (HA).</li>
 </ul>
 </li>
</ol>
2. Test HA w celu potwierdzenia odzyskania rekombinowanych wirusów grypy
Test hemaglutynacji (HA) jest rutynowo stosowany do wykrywania obecności odzyskanego wirusa w supernatantach kultur tkankowych MDCK i/lub w płynie alantoicznym pochodzącym z pobranych jaj. Alternatywnie można przeprowadzić testy immunofluorescencji (IFA). Po zidentyfikowaniu obecności odzyskanego wirusa za pomocą testu, wirusa należy poddać oczyszczaniu metodą plackową, a jego skład genetyczny potwierdzić za pomocą RT-PCR i sekwencjonowania.
Obecność wirusa w nadsączach z hodowli tkankowych komórek MDCK i/lub w płynie alantoicznym z zakażonych jaj można określić makroskopowo za pomocą testu HA z wykorzystaniem czerwonych krwinek (RBC) kurczaka (lub innego źródła). Obecność wirusa indukuje hemaglutynację RBC, podczas gdy brak wirusa pozwala na powstanie czerwonego osadu na dnie dołka (Rysunek 4). W przypadku wirusa grypy uważa się, że do uzyskania pozytywnego sygnału w teście HA wymagane jest około 103-104 jednostek tworzących plaki (PFU); dlatego równolegle z testem HA można przeprowadzić test IFA, aby potwierdzić prawdziwie negatywny wynik. IFA z wykorzystaniem pierwszorzędowych przeciwciał przeciwko wirusowi grypy jest bardziej czuła niż test HA, ponieważ techniką tą można wykryć mniej niż 103-104 wirusów. Możliwe jest, że nadsącze lub płyny alantoiczne negatywne w teście HA okażą się pozytywne w teście IFA. W takim przypadku wirusa należy namnożyć poprzez ponowne pasażowanie w komórkach MDCK lub w jajach. Płyn alantoiczny i/lub nadsącze z hodowli tkankowej z drugiego pasażu powinny być teraz wyraźnie pozytywne w teście HA.
Testy HA przeprowadza się na 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery V. W celu walidacji każdego testu HA należy zawsze uwzględnić próbki kontrolne ujemne (np. PBS 1X) oraz dodatnie (nadnadkresty z kultur tkankowych i/lub płyn alantoiczny z infekcji wirusem grypy).
<ul>
 <li>Do każdego dołka płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V odmież 50 μl PBS 1X.</li>
 <li>Do pierwszego dołka dodaj 50 μl nadnadkładu z hodowli tkankowej MDCK i/lub płynu alantoicznego z zakażonych jaj, a następnie wykonaj 2-krotne rozcieńczenia seryjne w kolejnych dołkach. Nadmiar 50 μl z ostatniego dołka odrzuć.</li>
 <li>Do każdego dołka dodaj 50 μl 0,5%-1,0% zawiesiny erytrocytów kurzych (przygotowanej w PBS 1X).</li>
 <li>Inkubuj płytkę 96-dołkową z dnem w kształcie litery V na lodzie przez 30-45 minut (do czasu pojawienia się czerwonej kropki na dnie próbki PBS z kontroli negatywnej). Odczytaj i zinterpretuj wyniki zgodnie z instrukcjami na Ryc. 4.</li>
</ul>
3. Pasaż supernatantów z kultur tkankowych
Negatywny wynik w teście HA może wynikać z niskiej wydajności transfekcji, co prowadzi do niskiego poziomu wirusa w nadsączach kultur tkankowych i/lub płynie alantois. Pasażowanie tych próbek w świeżych komórkach MDCK i/lub zarodowanych jajach pozwoli na amplifikację wirusa (jak pokazano na Rysunku 3). Infekcje przeprowadza się zgodnie z wcześniejszym opisem w sekcji 1.11.2.
4. Reprezentatywne wyniki
Pomyślne odzyskanie wirusa grypy zostanie potwierdzone pozytywnym wynikiem testu HA (Rysunek 4). Ponadto obecność CPE w komórkach zainfekowanych nadnadłożnymi kulturami tkankowymi lub płynem z jamniówkowym z jaj sugerować będzie pozytywny wynik odzyskiwania wirusa.
<img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig1.jpg" alt="Schemat budowy wirusa grypy ilustrujący komponenty białkowe HA, NA, NP, PB1, PB2, PA." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Budowa wirusa grypy: Wirus grypy jest otoczony lipidową dwuwarstwą zawierającą dwie glikoproteiny wirusowe (HA, NA) oraz białko kanału jonowego M2. HA jest białkiem adhezyjnym wirusa, odpowiedzialnym za wiązanie się z receptorami zawierającymi kwas sjalowy. NA odpowiada za uwalnianie wirusów z komórek gospodarza. Pod dwuwarstwą lipidową znajduje się warstwa białkowa składająca się z białka macierzy wewnętrznej otoczki 1, M1, które odgrywa rolę w składaniu i pączkowaniu wirionów, oraz białka eksportującego z jądra (NEP), niezbędnego do eksportu rybonukleokapsydów wirusowych z jądra komórkowego. Rdzeń wirusa tworzy kompleks rybonukleoproteinowy (RNP), składający się z 8 jednoniciowych negatywnych genów RNA wirusa zamkniętych w kapsydzie z białka nukleoproteinowego NP. Z kompleksem RNP powiązane są podjednostki wirusowej polimerazy RNA zależnej od RNA: PA, PB1 i PB2. Białka niestrukturalne NS1 i PB1-F2, kodowane odpowiednio przez segmenty RNA NS i PB1, nie wchodzą w skład struktury wirionu.
<img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig2.jpg" alt="Schemat konstrukcji plazmidu DNA, segmenty genów w plazmidzie pDZ do analizy ekspresji białek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Plazmidy do ratowania wirusa grypy: Wskazano osiem genów wirusa grypy sklonowanych w plazmidzie ambisense pDZ. Plazmid pDZ 6, pochodny od plazmidu do ekspresji białek pCAGGs 7, jest dwukierunkowym wektorem plazmidowym z ludzkim promotorem polimerazy RNA I oraz mysią sekwencją terminatora, które kodują genomowe RNA o orientacji ujemnej; w orientacji przeciwnej do jednostki polimerazy I, kaseta transkrypcyjna polimerazy II (promotor β-aktyny kurczaka i polyA) koduje białka wirusowe z tego samego genu wirusowego. cDNA z każdego segmentu wirusowego są generowane metodą RT-PCR z wykorzystaniem starterów forward i reverse zawierających miejsce rozpoznawania endonukleazy restrykcyjnej SapI oraz regiony niekodujące każdego segmentu (czarne pola na końcach genów wirusowych). Produkt PCR jest klonowany do plazmidu pDZ trawionego enzymem Sap-I.
<img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig3.jpg" alt="Schemat procesu transfekcji plazmidowej: kokultura 293T/MDCK, pasaż w zarodkach kurzych MDCK, test HA." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. System odzyskiwania wirusa grypy oparty na ośmiu plazmidach: plazmidy pDZ zawierające 8 genów wirusa grypy są współtransfekowane w zawiesinie w kokulturach komórek 293T-MDCK (dzień 1). Dwadzieścia cztery godziny po transfekcji wymieniane jest medium bez FBS, ale zawierające TPCK/trypsynę (dzień 2). Czterdzieści osiem godzin po zmianie medium pobiera się nadsącz z hodowli tkankowej i wykorzystuje go do zakażenia komórek MDCK lub 10-dniowych zarodków kurzych w jajach (dzień 4). Od 48 do 72 godzin po amplifikacji pobiera się nadsącze z hodowli zakażonych komórek MDCK lub płyn alantoiczy z jaj i wykonuje test HA w celu wykrycia obecności wirusa (dzień 6). Jeśli nie wykryto wirusa, te same nadsącze i/lub płyny alantoiczne można poddać ponownemu pasażowi na świeże komórki MDCK i/lub zarodki kurze.
<img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig4.jpg" alt="Schemat procesu odzyskiwania wirusa z wynikami rozcieńczeń; metoda wykazująca wzrost wirusa w testach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
 Rysunek 4. Test hemaglutynacji (HA): Hemaglutynacja krwinek czerwonych (RBC) przez cząsteczki wirusa jest widoczna makroskopowo i stanowi podstawę wykrywania cząsteczek wirusowych w nadsączach kultur tkankowych lub/i w płynach allantoicznych. Chociaż test HA nie rozróżnia cząsteczek wirusowych zakaźnych od cząsteczek zdegradowanych, które nie są już zdolne do infekowania komórek, test ten jest dobrym wskaźnikiem obecności wirusa w próbkach. A) Brak (góra) lub obecność (dół) wirusa w próbkach biologicznych jest określana odpowiednio przez obecność RBC na dnie płytki lub ich brak. B) Przedstawiono reprezentatywny wynik testu HA dla poziomu wirusa niewykrywalnego (góra) lub przy obecności wirusa (dół).

<ol><li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li>
<li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li>
<li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+influenza+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li>
<li>Palese, P., Shaw, M. L. Orthomyxoviridae. The viruses and their replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalese%2C+P+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. H. , 5th Edition, Lippincott Williams & Wilkins. PA, USA. 1647-1689 (2006).</li>
<li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li>
<li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
</ol>

Mount Sinai School of Medicine posiada prawa własności intelektualnej w zakresie rekombinowanych wirusów grypy, a AG-S jest wynalazcą w ramach tej własności intelektualnej.

Odzyskiwanie rekombinowanych wirusów grypy z plazmidowego DNA jest prostym i bezpośrednim procesem, gdy protokół ten jest rutynowo wykonywany w laboratorium, jednak na początku może wystąpić wiele błędów. Niezbędne jest posiadanie wysokiej jakości preparatu plazmidu w celu wytworzenia wirusa. Prawidłowe utrzymanie linii komórkowych (293T i MDCK) ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego odzyskania wirusa. Tradycyjnie, poprzez mutacje ciche, do plazmidu kodującego gen grypy wprowadza się znacznik genetyczny. Wprowadzenie tych ...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td>Przechowywać w temperaturze 4°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Invitrogen</td><td>51985-034</td><td>Przechowywać w temperaturze 4°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 (LPF2000)</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Przechowywać w temperaturze 4°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>trypsyna TPCK</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-8802</td><td>Przechowywać w temperaturze -20°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Albumina bydlęca (BA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7979</td><td>Przechowywać w temperaturze 4°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>trypsyna-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td>Przechowywać w temperaturze -20°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna (PS) 100X</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Przechowywać w temperaturze -20°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FBS) </td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>Przechowywać w temperaturze -20°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe z dnem w kształcie litery V</td><td>Nalge Nunc international</td><td>249570</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Zarodkowe jaja kurze&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;Zarodkowane jaja kurze w 10. dniu inkubacji można nabyć w Charles River Laboratories, Specific Pathogen Free Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services, Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254 USA. Jaja inkubuje się w temperaturze 37&amp;#x00B0;C przed i po infekcji wirusowej. Przed i po infekcji wirusowej jaja poddaje się oględzinom przez światło (kandlowaniu) w celu oceny żywotności embrionów. Bardzo ważne jest wykrywanie martwych zarodków przed i po infekcji wirusowej. Przed infekcją martwe jajo można łatwo zidentyfikować po braku naczyń krwionośnych oraz braku ruchomości embrionu. Podczas kandlowania żywe embriony wykazują ruchy. Po infekcji wirusowej martwe jajo (prawdopodobnie w wyniku zakażenia wirusem grypy) będzie łatwo rozpoznawalne po nieprawidłowym wyglądzie jaja, objawiającym się mniejszą objętością oraz zakrwawieniem płynu allantoicznego. Zakażone jaja utylizuje się w podwójnych workach autoklawowalnych i sterylizuje w autoklawie zgodnie ze standardowymi procedurami.&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Erytrocyty kurczaka (RBC)&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;Erytrocyty kurzaków (cRBC) można nabyć od Truslow Farms, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21620. Przechowywać w temperaturze 4°C.&amp;#x00B0;C. W przypadku testów HA, przemyć 5 ml czerwonych krwinek (RBC) kurczaka za pomocą 45 ml buforu PBS 1X w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Wirować przez 5 minut przy 1000 obr./min w temperaturze pokojowej (RT). Ostrożnie odlać nadsącz i przygotować rozcieńczenie osadu RBC w buforze PBS 1X w stosunku 1:1000 (końcowe stężenie RBC 0,5–1,0%).&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Nadpłyny z kultur tkankowych i płyny allantoiczne&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;Zarówno nadsączki z hodowli tkankowych, jak i płyny alantoiczne mogą być przechowywane w temperaturze 4&amp;#x00B0;C przez krótki czas. Po potwierdzeniu sukcesu rekonstytucji wirusa, wirusy z supernatantów komórkowych lub płynu alantoicznego przechowuje się w temperaturze -80&amp;#x00B0;C.&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Plazmidy&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;Wszystkie plazmidy są przygotowywane przy użyciu zestawu do maksymalnej izolacji plazmidów (plasmid maxi kit) zgodnie z instrukcją producenta&amp;rsquo;zalecenia. Wszystkie plazmidy są rozdzielone na alykwooty o stężeniach 1 &amp;#x03BC;g/ml w ddH2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;i przechowywano w temperaturze -20&amp;#x00B0;C. W przypadku krótkotrwałego przechowywania plazmid można trzymać w temperaturze 4°C&amp;#x00B0;C. Stężenie oczyszczonego plazmidu DNA określa się spektrofotometrycznie przy 260 nm, a czystość szacuje za pomocą stosunku absorbancji 260:280 nm. Preparaty o stosunku 260:280 nm w zakresie 1,8–2,0 uznaje się za odpowiednie do celów rekonstytucji wirusa. Ponadto stężenie i czystość plazmidu należy potwierdzić za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Na rysunku 2 przedstawiono plazmidy Ambisense pDZ (6) zawierające osiem genów wirusa grypy A/PR/8/34 (7).&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Wirusy&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Wysiłki wielu grup badawczych zajmujących się grypą odegrały kluczową rolę w rozwoju i udoskonaleniu genetyki odwrotnej wirusa grypy typu A. Opracowane pierwotnie w 1999 roku techniki genetyki odwrotnej oparte na plazmidach, służące do generowania wirusów rekombinowanych, zrewolucjonizowały dziedzinę badań nad grypą, umożliwiając udzielenie odpowiedzi na konkretne pytania badawcze za pomocą genetycznie zmodyfikowanych, zakaźnych, rekombinowanych wirusów grypy. Badania te obejmują replikację wirusa, funkcje białek wirusowych, wpływ specyficznych mutacji w białkach wirusowych na replikację i/lub patogenezę wirusa, a także wektory wirusowe wykorzystujące rekombinowane wirusy grypy wykazujące ekspresję obcych białek.&quot;&gt;Opisany protokół regeneracji wirusa grypy A/PR/8/34 można przeprowadzić w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL) 2. Materiały zanieczyszczone, w tym nadyżki z kultur tkankowych i jaja kurze z zarodkiem, należy wysterylizować przed utylizacją. Regeneracja innych wirusów grypy może wymagać wyższego poziomu BSL, w związku z czym konieczne będzie przestrzeganie specjalnych warunków/środków bezpieczeństwa.&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. W sekcji „Source text” widnieje jedynie znacznik „jove_content”, który nie zawiera treści merytorycznej. Po przesłaniu właściwego tekstu niezwłocznie przygotuję tłumaczenie zgodnie z wytycznymi.&quot;&gt;Pożywki i roztwory do hodowli tkankowych&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;DMEM 10% FBS 1% PS: 445 ml pożywki Dulbecco&amp;rsquo;zmodyfikowane podłoże Eagle'a&amp;rsquo;pożywkę (DMEM), 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 5 ml 100X penicyliny/streptomycyny (PS). Przechowywać w temperaturze 4&amp;#x00B0;C. Pożywka ta będzie wykorzystywana do hodowli komórek 293T i MDCK, a także do transfekcji. DMEM 0,3% BA 1% PS: 495,7 ml DMEM, 4,3 ml 35% albuminy wołowej (BA). Przechowywać w temperaturze 4°C.&amp;#x00B0;C. Bezpośrednio przed użyciem dodać trypsynę traktowaną TPCK do stężenia końcowego 1 &amp;#x03BC;g/ml. Pożywka zakaźna.&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;10X roztwór soli fizjologicznej fosforanowej (PBS): 80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g Na2HPO4&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 2 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Dodać ddH2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O do 1 litra. Dostosować pH do 7,3. Sterylizować w autoklawie. Przechowywać w temperaturze pokojowej.&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;1X PBS: Rozcieńczyć 10X PBS w stosunku 1:10 przy użyciu ddH2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Sterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

generowanie rekombinowanego wirusa grypy z plazmidowego dna

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

wysiłki wielu grup badawczych zajmujących się grypą odegrały kluczową rolę w rozwoju i udoskonaleniu genetyki odwrotnej wirusa grypy typu A. Opracowane pierwotnie w 19991,2oparte na plazmidach techniki genetyki odwrotnej służące do generowania wirusów rekombinowanych zrewolucjonizowały dziedzinę badań nad grypą, ponieważ dzięki genetycznie zmodyfikowanym, zakaźnym wirusom grypy rekombinowanym możliwe stało się znalezienie odpowiedzi na konkretne pytania badawcze. Takie badania obejmują replikację wirusa, funkcje białek wirusowych, wpływ specyficznych mutacji w białkach wirusowych na replikację i/lub patogenezę wirusa, a także wektory wirusowe wykorzystujące rekombinowane wirusy grypy ekspresujące obce białka3(No source HTML provided for translation)

Odzyskiwanie wirusów grypy typu A z plazmidowego DNA jest podstawową i niezbędną techniką eksperymentalną, która pozwala badaczom grypy na generowanie wirusów rekombinowanych w celu badania wielu aspektów biologii wirusa grypy, a także do wykorzystania ich jako potencjalnych wektorów lub szczepionek.

Generowanie rekombinowanego wirusa grypy z plazmidowego DNA

Starania wielu grup badawczych zajmujących się grypą odegrały kluczową rolę w rozwoju i udoskonaleniu genetyki odwrotnej wirusa grypy typu A. Pierwotnie ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wytworzenie rekombinowanego wirusa grypy z plazmidowego DNA. Osiąga się to poprzez transfekcję ośmiu plazmidów DNA kodujących geny wirusa grypy do kokultury komórek 2 9 3 t i MDCK, wykorzystując w drugim kroku Lipofectamine 2000. Nadpłyn z hodowli tkankowej zostanie użyty do zakażenia świeżych komórek MDCK i/lub 10-dniowych zarodkowców kurzych jaj, co pozwoli na namnożenie wirusa obecnego w nadpłynie z transfektowanych komórek.Następnie pobierzemy nadsączki z kultur tkankowych oraz płyn allantoiczny z zakażonych zarodkowych jaj kurzych. W celu potwierdzenia obecności wirusa za pomocą testu HA, uzyskuje się wyniki wskazujące na obecność wirusa na podstawie wystąpienia aglutynacji. Cześć, jestem Luis Martinez Rito z Katedry Mikrobiologii i Immunologii na Uniwersytecie w Rochester.Dzisiaj pokażę Państwu, jak otrzymywać rekombinowane wirusy grypy z plazmidowego DNA. Technikę tę stosujemy w naszym laboratorium do badania wielu aspektów biologii wirusa grypy oraz do opracowywania potencjalnych wektorów i szczepionek. Zatem przejdźmy do części praktycznej.Przed rozpoczęciem transfekcji należy ogrzać do 37 °C odczynniki do hodowli komórkowej: 1

generation-of-recombinant-influenza-virus-from-plasmid-dna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Generowanie rekombinowanego wirusa grypy z DNA plazmidowego

Źródło: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021)Niniejszy film prezentuje produkcję pseudowirusów grypy w komórkach ludzkich przy użyciu transfekcji plazmidowej za pośrednictwem fosforanu wapnia, co umożliwia bezpieczne generowanie cząstek wirusowych jednego cyklu do dalszych zastosowań, takich jak testy neutralizacji przeciwciał w warunkach 2.

Produkcja pseudowirusa z wykorzystaniem transfekcji plazmidowej w komórkach ludzkich

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

Ten film pokazuje generowanie cząsteczek wirusopodobnych do grypy (VLP) w organizmie ssaków. Po ekspresji trzech eukariotycznych wektorów ekspresyjnych - kodujących różne białka strukturalne wirusa - w odpowiednich komórkach gospodarza ssaków, wyrażone białka wirusowe samoorganizują się w VLP na błonie plazmatycznej gospodarza i uwalniają się poprzez pączkowanie z powierzchni komórki.

Technika wytwarzania cząstek podobnych do wirusa grypy przez system ssaków

Film prezentuje metodę tworzenia rekombinowanych wirusów grypy dostosowanych do zimna. Polega na transfekcji komórek ludzkich dwukierunkowymi plazmidami, a następnie inkubacji w niższej temperaturze w celu uzyskania wirusów odpowiednich do produkcji szczepionek, charakteryzujących się zmniejszoną replikacją w cieplejszych warunkach.

Wytwarzanie rekombinowanych, żywych, atenuowanych wirusów grypy do szczepionek

Szybki i modułowy protokół generowania rekombinowanych wirusów krowianki wyrażających fluorescencyjnie znakowane białka jednocześnie przy użyciu metody przejściowej selekcji dominującej jest opisany tutaj.

Metodologia wydajnego wytwarzania znakowanych fluorescencyjnie białek wirusa krowianki

Istnieje ogólny brak wiedzy na temat działania szczepionek. W tym miejscu proponujemy połączone zastosowanie genetyki odwrotnej i chimerycznych myszy szpiku kostnego w celu uzyskania wglądu we wczesną odpowiedź immunologiczną gospodarza na szczepionki, ze szczególnym uwzględnieniem komórek dendrytycznych i odporności limfocytów T.

Donosowe podawanie rekombinowanych szczepionek przeciw grypie w chimerycznych modelach mysich w celu zbadania odporności błony śluzowej

Tutaj prezentujemy protokół syntezy cząsteczek wirusopodobnych za pomocą systemów ekspresji bakulowirusa lub ssaków oraz oczyszczania przez ultrawirowanie. To wysoce konfigurowalne podejście służy do identyfikacji antygenów wirusowych jako celów szczepionek w bezpieczny i elastyczny sposób.

Ekspresja i oczyszczanie cząstek wirusopodobnych do szczepienia

Opisujemy metodę, za pomocą której identyfikujemy krytyczne pozostałości wymagane do wiązania ludzkich lub mysich przeciwciał monoklonalnych, które celują w wirusową hemaglutyninę wirusów grypy A. Protokół można dostosować do innych glikoprotein powierzchniowych wirusa i odpowiadających im przeciwciał neutralizujących.

Wytwarzanie wariantów ucieczki neutralizujących przeciwciał monoklonalnych wirusa grypy

Ten protokół opisuje eksperymentalny proces wytwarzania zakaźnych cząsteczek pseudotypowych wirusa o wysokim mianie (pp) z glikoproteinami otoczkowymi z dwóch szczepów grypy A i jak określić ich zakaźność. Protokół ten jest wysoce elastyczny do tworzenia pps dowolnego innego typu wirusów otoczkowych z różnymi glikoproteinami otoczki.

Produkcja zakaźnych cząstek pseudotypowanych grypy zakaźnej o wysokim mianie z glikoproteinami otoczkowymi z wysoce zjadliwych wirusów H5N1 i ptasich H7N9

Generowanie rekombinowanych rotawirusów z plazmidowego DNA dostarcza niezbędnego narzędzia do badania replikacji i patogenezy rotawirusów oraz rozwoju wektorów ekspresyjnych rotawirusów i szczepionek. W niniejszym artykule opisano uproszczone podejście genetyki odwrotnej do generowania rekombinowanych rotawirusów, w tym szczepów eksprymujących fluorescencyjne białka reporterowe.

Uproszczona metoda genetyki odwrotnej do odzyskiwania rekombinowanych rotawirusów wykazujących ekspresję białek reporterowych

To jest metoda generowania "bezbliznowatych" rekombinowanych wirusów krowianki przy użyciu wyboru zakresu gospodarzy i wizualnej identyfikacji rekombinowanych wirusów.

Szybkie, bezproblemowe generowanie rekombinowanych pokswirusów przy użyciu zakresu gospodarzy i selekcji wizualnej

Naucz się wytwarzać rekombinowany wirus grypy z plazmidowego DNA poprzez transfekcję komórek 293T i MDCK. Ta metoda umożliwia badaczom amplifikację wirusa i jego zastosowanie w rozwoju szczepionek.

Generowanie rekombinowanego wirusa grypy z plazmidowego DNA

Przeglądaj więcej filmów