Ocena funkcji i energetyki serca w izolowanych sercach myszy za pomocą spektroskopii 31P NMR
August 31st, 2010
Izolowana perfuzja serca w trybie Langendorffa, w połączeniu ze spektroskopią 31P NMR, łączy dziedziny biochemii i fizjologii w jednym eksperymencie. Protokół pozwala na dynamiczny pomiar wysokoenergetycznej zawartości fosforanów i obrotu w sercu przy jednoczesnym monitorowaniu funkcji fizjologicznych. Przy prawidłowym wykonaniu jest to cenna technika w ocenie energetyki serca.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest obserwacja funkcji i energetyki serca w izolowanym perfundowanym sercu myszy. Osiąga się to poprzez perfuzję serca myszy w trybie LOR. W drugim kroku za pomocą buforu Krebsa wzbogaconego o glukozę i pirogronian wprowadza się wypełniony wodą balon wypełniony wodą, co pozwala na stałe monitorowanie czynności serca podczas eksperymentu.
Następnie serce umieszcza się w 10-milimetrowej rurce NMR i wkłada do magnesu w celu oceny energetyki serca poprzez obserwację rezonansów fosforanów foskreatyny TP i uzyskano wyniki fosforanów nieorganicznych, które pokazują czynność i energetykę serca w oparciu o fale ciśnienia LV i P 31 oraz spektroskopię mas p. Cześć, Nazywam się Steve Kitz i pracuję w MIT Cadre Metabolism Center na Wydziale Anestezjologii Uniwersytetu Waszyngtońskiego. Dzisiaj pokażę Wam procedurę izolowanej perfuzji serca połączoną ze spektroskopią 31 PNMR.
Używamy tej procedury w naszym laboratorium do oceny funkcji serca i energetyki w naszych bioinżynieryjnych modelach mysich. Więc zacznijmy. Aby rozpocząć ten protokół, przygotuj jeden litr kres, stąd light lub bufor KH.
Wprowadź do mieszaniny 5% dwutlenku węgla i 95% pęcherzyków tlenu na 10 do 15 minut. Następnie dodaj dwa milimolowe chlorki wapnia, a następnie substraty, 10 milimolowy chlorek glukozy i 0,5 milimolowy pirogronian. W tych eksperymentach wykorzystuje się jednocześnie dwa oddzielne systemy na akwizycję widm P 31.
Magnes BRUER 14 T jest połączony z zaawansowaną konsolą trzech i komputerem wyposażonym w oprogramowanie Top Spin V 2.1 do oceny czynności serca. Specjalnie zbudowany system perfuzji serca jest połączony z laboratorium energetycznym. Cztery 30 zapotrzebowania na dane.
Wyposażony w oprogramowanie lab chart PRO six do analizy danych. Aparat do perfuzji serca zawiera pompę perystaltyczną z trzema impulsami mini sterowaną przez sterownik pompy STH służącą do perfuzji buforu KH do regulacji temperatury serca podczas eksperymentu NMR. Podgrzewane cyrkulatory służą do utrzymywania temperatury w zakresie od 37,0 do 37,5 stopni Celsjusza, podczas gdy serce znajduje się wewnątrz magnesu, a temperatura jest monitorowana przez czas trwania eksperymentu za pomocą światłowodowej sondy temperatury.
Przez cały czas trwania eksperymentu ciśnienie lewej komory i ciśnienie perfuzji są monitorowane za pomocą przetworników ciśnienia, które są podłączone do systemu akwizycji danych i wyświetlane za pomocą dołączonego oprogramowania. Przetwornik fizjologiczny służy do monitorowania ciśnienia lewej komory, a jednorazowy przetwornik ciśnienia krwi służy do monitorowania ciśnienia perfuzyjnego. Wreszcie pępowina służy do dostarczania podgrzanego natlenionego buforu do serca.
Po wejściu do magnesu, przed rozpoczęciem eksperymentu, skalibruj przetworniki ciśnienia za pomocą wzorców manometru momentu figowego na pierwszym miejscu, bez ciśnienia w przetworniku, aby wyzerować kalibrację. Następnie napompuj ten manometr w trybie figowym do wyższego ciśnienia. Wprowadź tę wartość do programu komputerowego.
Następnie upewnij się, że przetworniki ciśnienia zostały odpowiednio skalibrowane, pompując ten manometr momentu figowego do znanych ciśnień i weryfikując je na ekranie komputera. Po skalibrowaniu przetworników ciśnienia skalibruj sondę NMR za pomocą 10-milimetrowej rurki NMR zawierającej standardową próbkę 150-milimolowego fosforanu sodu. Wykonaj kalibrację za pomocą oprogramowania do górnego wirowania.
Najpierw dostrój próbkę, aby ustawić częstotliwość rezonansu fosforu. Następnie podkładkuj próbkę, aby wytworzyć jednorodne pole magnetyczne. Ta wstępna kalibracja ułatwia sygnał i skraca czas niezbędny do rozpoczęcia okresu akwizycji.
Po umieszczeniu serca w sondzie, aby rozpocząć ekstrakcję serca myszy, wstrzyknij myszowi 200 jednostek heparyny dootrzewnowej, aby zmniejszyć krzepliwość. Po pięciu minutach podaj 175 miligramów na kilogram sodu Penta barbital dootrzewnowego. Gdy mysz zostanie znieczulona, połóż ją na plecach i przyklej taśmą ręce i nogi, aby odsłonić obszar klatki piersiowej.
Uszczypnij palce u stóp, aby upewnić się, że mysz jest w pełni znieczulona. Ciąć. Otwórz jamę otrzewną i klatkę piersiową nożyczkami i za pomocą kleszczy odklej klatkę piersiową i odsłoń klatkę piersiową kleszczami. Chwyć tkankę płucną i delikatnie unieś serce zakrzywionymi nożyczkami.
Przetnij wielkie naczynia za sercem i kontynuuj powoli w kierunku głowy myszy, aż serce będzie wolne. Natychmiast zatrzymaj serce w lodowatym buforze KH. Utrzymuj narządy na lodzie i szybko usuń płuca.
Zidentyfikuj płaty grasicy i delikatnie oderwij je z powrotem, aby odsłonić aortę. Następnie usuń grasicę. Na koniec wyizoluj aortę, ostrożnie usuwając otaczającą tkankę.
Używając kleszczyków do szycia mikro, zazwyczaj trzymaj obie ściany aorty, aby odsłonić światło. Następnie ostrożnie umieść aortę na kaniuli. Wykonany z rurki polietylenowej o średnicy zewnętrznej 0,965 milimetra.
Przytrzymaj aortę na miejscu za pomocą zacisku mikronaczyniowego i szybko zawiąż szwy wokół aorty. Po zawiązaniu szwów zdejmij zacisk. Użyj kleszczy, aby dokładnie sprawdzić, czy kaniula znajduje się nad korzeniem aorty.
Dodaj wszelkie dodatkowe krawaty, które są niezbędne do utrzymania serca na miejscu. Usuń wszelkie dodatkowe tkanki za pomocą kleszczy i mikronożyczek. Następnie wykonaj małe nacięcie w lewej wyroczni.
Delikatnie przytrzymaj serce i ostrożnie włóż rurkę polietylenową o średnicy 0,61 milimetra przez lewy przedsionek, lewą jamę komorową i wyjdź przez wierzchołek. Przytnij nadmiar rurek. Następnie włóż opróżniony balon wypełniony wodą przez przedsionek do lewej komory.
Przytrzymaj balon na miejscu za pomocą taśmy klejącej. Następnie stopniowo zwiększaj prędkość pompy perystaltycznej, aby zapewnić wystarczający przepływ do serca. Kontynuuj perfuzję serca za pomocą buforu KH, stosując stały przepływ odpowiadający około dwóm mililitrom na minutę, aż serce zostanie umieszczone w sondzie NMR.
Napompuj balon niskiego napięcia małą objętością za pomocą strzykawki mikrometrycznej, aby sprawdzić, czy przetwornik ciśnienia niskiego napięcia działa do spektroskopii NMR. Najpierw ostrożnie włóż serce do 10-milimetrowej rurki NMR. Wokół rurki NMR umieszczono szeroką błystkę dzika, która pomaga ustawić rurkę we właściwej pozycji.
Wewnątrz sondy mocno przymocuj cały aparat do pępowiny za pomocą taśmy klejącej. Następnie powoli opuść pępowinę do górnego otworu magnesu, aż rurka NMR zawierająca serce znajdzie się w cewce 10-milimetrowej sondy NMR. Gdy serce znajdzie się we właściwej pozycji w sondzie, wyreguluj przepływ pompy pasożytniczej, aby osiągnąć ciśnienie perfuzji 80 milimetrów słupa rtęci.
Utrzymuj ciśnienie perfuzji, włączając mechanizm wstrzymania na sterowniku pompy. Odczekaj od 15 do 20 minut okresu równowagi dla serca. W okresie równowagi dostosuj objętość balonu LV, aby osiągnąć końcowe ciśnienie rozkurczowe od ośmiu do 10 milimetrów słupa rtęci.
Następnie zoptymalizuj parametry spektrometru, aby uzyskać jak najlepszy sygnał fosforowy. Dostrój instrument NMR, ustawiając impuls radiowy, a więc częstotliwość, z jaką rezonuje jądro fosforu. Następnie podkładkować próbkę, aby pole magnetyczne było jednorodne po okresie równowagi.
Rozpocznij wielokrotną akwizycję widm NMR P 31. Okres akwizycji dla każdego widma zależy od natężenia pola magnesu, wielkości próbki i stosunku sygnału do szumu wymaganego dla konkretnego eksperymentu. Tutaj widma uzyskuje się za pomocą magnesu o napięciu 14 Tesli poprzez uśrednienie sygnału uzyskanego z 256 impulsów o częstotliwości radiowej o długości 20 mikrosekund z kątem obrotu 60 stopni i opóźnieniami 2,0 sekundy.
Ten eksperyment będzie trwał około 10 minut. Typową miarą czynności serca, ciśnienie rozwinięte przez LV uzyskuje się przez odjęcie końcowego ciśnienia rozkurczowego lub EDP od ciśnienia skurczowego. U normalnej myszy C 57 Black Six, ciśnienie LV w sercu wynosi zwykle od 100 do 110 milimetrów słupa rtęci przy stałym końcowym ciśnieniu rozkurczowym wynoszącym od ośmiu do 10 milimetrów słupa rtęci.
Reprezentatywne krzywe stylizacji pokazano na przykładzie myszy kontrolnych i z paskiem aortalnym. Funkcja skurczowa jest reprezentowana przez ciśnienie wytworzone przy rosnących objętościach lewej komna, określone przez objętość balonu niskiego napięcia. Funkcja rozkurczowa jest reprezentowana przez EDP przy rosnących objętościach lewej komna.
Widma P 31 NMR izolowanego perfundowanego serca myszy dostarczają sygnałów FOSFOKREATYNY lub PCR, trzech fosforanów z TP i nieorganicznego fosforanu lub pi. Tutaj szczyt PI jest stosunkowo niewielki. Jest to typowe dla serca bogatego tlenowo, zaopatrzonego w pirogronian lub kwasy tłuszczowe.
Oprócz glukozy w okresach niedokrwienia, pik ten wzrasta, podczas gdy pik PCR maleje. Właśnie pokazałem wam, jak przygotować mysie serce do perfuzji, tak aby zarówno funkcja serca, jak i energetyka mogły być mierzone jednocześnie podczas eksperymentu. Ważne jest, aby upewnić się, że serce jest odpowiednio ukrwione.
W przeciwnym razie dane NMR nie będą wiarygodne. Więc to wszystko. Dziękuję i życzę powodzenia w eksperymentach.
Przegląd
Ten artykuł opisuje protokół perfuzji serca izolowanego w trybie Langendorffa łączony ze spektroskopią 31P NMR, umożliwiający dynamiczne pomiary energetyki serca. Metoda ta pozwala na jednoczesne monitorowanie zawartości wysokoenergetycznych fosforanów i funkcji serca w izolowanym sercu myszy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Fizjologia serca
- Biochemia
- Spektroskopia NMR
Tło
- Perfuzja Langendorffa to technika stosowana do badania funkcji serca.
- Spektroskopia 31P NMR zapewnia wgląd w metabolizm energetyczny w tkankach sercowych.
- Ta metoda umożliwia ocenę energetyki serca w czasie rzeczywistym.
- Zrozumienie energetyki serca jest kluczowe dla oceny zdrowia i chorób serca.
Cel badania
- Obserwacja funkcji i energetyki serca w izolowanym sercu myszy.
- Ocenienie wpływu różnych substratów na działanie serca.
- Opracowanie wiarygodnego protokołu dla przyszłych badań nad energetyką serca.
Stosowane metody
- Przygotowanie bufora Krebs-Henseleit z glukozą i pirogroniany.
- Włożenie balonika wypełnionego wodą do lewej komory w celu monitorowania ciśnienia.
- Użycie 10 mm rury NMR do oceny energetyki serca.
- Kalibracja przetworników ciśnienia i sond NMR dla dokładnych pomiarów.
Główne wyniki
- Pomyślne izolacja i perfuzja serca myszy.
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym ciśnienia w lewej komorze i ciśnienia perfuzji.
- Dynamiczne pomiary wysokoenergetycznych fosforanów podczas eksperymentu.
- Wgląd w związek między dostępnością substratów a funkcją serca.
Wnioski
- Protokół skutecznie łączy oceny fizjologiczne i biochemiczne.
- Stanowi cennym narzędziem do badania energetyki serca w warunkach badawczych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodologii, aby zbadać zdrowie serca.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables simultaneous assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts, providing a physiologically relevant system for evaluating molecular modifications in cardiovascular disease models. By integrating Langendorff perfusion with 31P NMR spectroscopy, researchers can obtain real-time, quantitative readouts of high-energy phosphate metabolites alongside hemodynamic parameters, supporting mechanistic de-risking in target validation and preclinical screening workflows. The approach enhances predictive confidence by linking molecular alterations to functional and metabolic phenotypes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring how genetic or pharmacological interventions affect cardiac energetics and function in intact, beating hearts.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous monitoring of LV developed pressure and phosphocreatine/ATP levels under physiological or pathologic stress.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds or genetic modifications that preserve energetic homeostasis during ischemia/reperfusion or high-workload challenges.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline cardiac function and metabolite levels in a reproducible, Langendorff-perfused format.
- Quantitative Outputs: Generates simultaneous, real-time measurements of hemodynamic function (LV pressure) and biochemical energetics (PCr, ATP, Pi) for multi-parametric assay development.
- Scalability & Reuse: The isolated heart platform can be adapted across disease models (e.g., aortic banding, transgenic models) to enable consistent, cross-project evaluation of cardiac safety and efficacy signals.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly assesses the functional and energetic significance of molecular modifications in transgenic models of cardiac pathology, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery-phase target validation with preclinical evaluation by providing a quantitative, physiologically anchored readout of cardiac health.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria by detecting early energetic dysfunction that may predict late-stage clinical failure in cardiovascular programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization to preclinical assessment, offering a reusable platform for evaluating cardiac liability and target engagement in disease-relevant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking genetic or pharmacological perturbations to measurable changes in cardiac energetics and contractile function.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility through controlled perfusion conditions, real-time pressure monitoring, and consistent NMR spectral acquisition.
- Analytics: Delivers quantitative, multi-parametric readouts (LV developed pressure, end-diastolic pressure, PCr/ATP ratios, Pi shifts) that allow objective comparison across experimental conditions and compound treatments.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation by maintaining physiological relevance while enabling biochemical interrogation of metabolic pathways in intact hearts.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable, cross-functional capability applicable to cardiovascular, metabolic, and mitochondrial toxicity programs across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by correlating molecular changes with direct measurements of cardiac function and high-energy phosphate metabolism.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized buffer preparation, temperature control, pressure transducer calibration, and NMR shimming procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by identifying cardiotoxic or metabolically disruptive compounds early, reducing late-stage attrition in cardiovascular drug development.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of targets and leads by providing early insight into energetic reserve and stress resilience in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in isolated heart perfusion, NMR spectroscopy, and pressure transducer calibration.
- Dependent on access to high-field NMR spectrometers (e.g., 14T) and specialized perfusion hardware compatible with magnet bore constraints.
- Necessitates cross-team standardization between physiology, pharmacology, and NMR analytics teams for consistent data acquisition and interpretation.
- Adaptation considerations include model-specific adjustments to perfusion pressure, balloon volume, and substrate composition based on disease phenotype or genetic background.
- Practical limitations include signal-to-noise constraints in low-abundance metabolite detection and the need for rigorous exclusion of ischemic artifacts during setup.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:59
Introduction
1:25
Experimental Set-up
4:33
Isolated Heart Preparation
9:43
Representative Results of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy
7:41
Assessment of Cardiac Function and Energetics Using 31P NMR Spectroscopy
11:09
Conclusion
![Badanie metabolizmu serca w izolowanym perfundowanym sercu myszy za pomocą hiperspolaryzowanej [1-13C] pirogronianu i spektroskopii 13C/31P NMR](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F63188.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A46%253A50.867Z&w=384&q=75)
