Ocena funkcji i energetyki serca w izolowanych sercach myszy z wykorzystaniem spektroskopii ³¹P NMR

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest obserwacja funkcji i energetyki serca w izolowanym, perfundowanym sercu myszy. Osiąga się to poprzez perfuzję serca myszy w trybie LOR. W drugim kroku, z zastosowaniem buforu Krebsa wzbogaconego glukozą i pirogronianem, do lewej komory (lv) wprowadza się wypełniony wodą balon, co pozwala na stałe monitorowanie funkcji serca podczas eksperymentu.

Następnie serce umieszcza się w probówce NMR o średnicy 10 milimetrów i wkłada do magnesu w celu oceny energetyki serca poprzez obserwację rezonansów fosfokreatyny oraz fosforanów nieorganicznych; uzyskane wyniki pozwalają ocenić funkcję i energetykę serca na podstawie fal ciśnienia w LV oraz spektroskopii 31P NMR i spektrometrii masowej. Cześć, jestem Steve Kitz z MIT Cadre Metabolism Center w Departamencie Anestezjologii Uniwersytetu Waszyngtońskiego. Dzisiaj zaprezentuję procedurę izolowanej perfuzji serca w połączeniu ze spektroskopią 31P NMR.

W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do oceny funkcji i energetyki serca w bioinżynieryjnych modelach mysich. Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć ten protokół, należy przygotować jeden litr buforu Krebsa-Henseleha lub KH.

Przez 10 do 15 minut wprowadzaj do mieszaniny pęcherzyki zawierające 5% carbon dioxide i 95% oxygen. Następnie dodaj dwa milimolar calcium chloride, a potem substraty: 10 milimolar glucose oraz 0,5 milimolar pyruvate. W tych doświadczeniach podczas każdego pozyskiwania widm P 31 jednocześnie wykorzystuje się dwa oddzielne układy.

Magnes BRUER 14 T jest połączony z zaawansowaną konsolą trzechkanałową oraz komputerem z oprogramowaniem top spin V 2.1 w celu oceny funkcji serca. Specjalistyczny system perfuzji serca jest połączony z systemem power lab. Cztery 30 zapytania o dane.

Wyposażony w oprogramowanie LabChart PRO 6 do analizy danych. Aparatura do perfuzji serca obejmuje perystaltyczną pompę Mini Pulse 3 sterowaną kontrolerem pompy STH, służącą do perfuzji buforu KH do serca. Regulacja temperatury podczas eksperymentu NMR jest krytyczna. Do utrzymania temperatury w zakresie od 37,0 do 37,5 stopni Celsjusza podczas przebywania serca wewnątrz magnesu wykorzystuje się cyrkulatory grzewcze, a temperaturę monitoruje się przez cały czas trwania eksperymentu za pomocą światłowodowej sondy temperaturowej.

W trakcie całego eksperymentu ciśnienie w LV oraz ciśnienie perfuzyjne są monitorowane za pomocą przetworników ciśnienia podłączonych do systemu akwizycji danych i wyświetlane przy użyciu dołączonego oprogramowania. Do monitorowania ciśnienia w LV wykorzystuje się przetwornik fizjologiczny, natomiast do monitorowania ciśnienia perfuzyjnego stosuje się jednorazowy przetwornik ciśnienia krwi. Na koniec, do dostarczania podgrzanego, natlenionego buforu do serca używa się przewodu pępowinowego.

Po wprowadzeniu do magnesu, przed rozpoczęciem eksperymentu, należy skalibrować przetworniki ciśnienia za pomocą manometru wzorcowego. W pierwszej kolejności nie podaje się ciśnienia do przetwornika, aby wyzerować kalibrację. Następnie należy napompować ten manometr do wyższego ciśnienia. Wartość tę należy wprowadzić do programu komputerowego.

Następnie należy potwierdzić, że przetworniki ciśnienia zostały odpowiednio skalibrowane, pompując manometr momentowy do znanych ciśnień i weryfikując je na ekranie komputera. Po skalibrowaniu przetworników ciśnienia należy skalibrować sondę NMR, używając 10 milimetrowej probówki NMR zawierającej standardową próbkę 150 milimolarnego fosforanu sodu. Kalibrację należy przeprowadzić przy użyciu programu TopSpin.

W pierwszej kolejności należy nastroić próbkę, aby ustawić częstotliwość rezonansu fosforu. Następnie należy przeprowadzić shimowanie próbki w celu wytworzenia jednorodnego pola magnetycznego. Ta wstępna kalibracja usprawnia sygnał i skraca czas niezbędny do rozpoczęcia okresu akwizycji.

Gdy serce znajdzie się w pozycji odpowiedniej do rozpoczęcia ekstrakcji serca myszy, wstrzyknij myszy 200 jednostek heparyny dojszylowo w celu zmniejszenia krzepliwości. Po pięciu minutach podaj 175 miligramów na kilogram pentobarbitalu sodu drogą dostępu doprzewną. Po znieczuleniu myszy ułóż ją na plecach i przyklej kończyny taśmą, aby odsłonić obszar klatki piersiowej.

Wykonaj test odruchu na ściśnięcie palca u myszy, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni znieczulone. Rozetnij i otwórz jamę otrzewną oraz klatkę piersiową za pomocą nożyczek, a następnie użyj pęsety, aby odsunąć żebra i odsłonić jamę klatki piersiowej. Przytrzymaj tkankę płuc i delikatnie unieś serce za pomocą zakrzywionych nożyczek.

Przetnij duże naczynia krwionośne za sercem i powoli przesuwaj się w stronę głowy myszy, aż serce zostanie uwolnione. Natychmiast zatrzymaj akcję serca w lodowatym buforze KH. Przechowuj organy na lodzie i szybko usuń płuca.

Zidentyfikuj płaty grasicy i delikatnie odchyl je, aby odsłonić aortę. Następnie usuń grasicę. Na koniec wyizoluj aortę, ostrożnie usuwając wszelkie otaczające ją tkanki.

Używając mikropincety naczyniowej, należy objąć obie ściany aorty, aby odsłonić jej światło. Następnie ostrożnie nałożyć aortę na kaniulę. Kaniula została wykonana z rurki polietylenowej o średnicy zewnętrznej 0,965 mm.

Unieruchom aortę za pomocą mikroklamry naczyniowej i szybko zawiąż szwy wokół aorty. Po zawiązaniu szwów usuń klamrę. Użyj pęsety, aby dokładnie sprawdzić, czy kaniula znajduje się powyżej pierścienia aorty.

Dodaj wszelkie dodatkowe podwiązki niezbędne do unieruchomienia serca. Usuń nadmiar tkanki za pomocą pęsety i mikronożyczek. Następnie wykonaj niewielkie nacięcie w lewym przedsionku.

Delikatnie przytrzymaj serce i ostrożnie wprowadź rurkę polietylenową o średnicy 0,61 mm przez lewy przedsionek, jamę lewej komory i na zewnątrz przez wierzchołek. Odetnij nadmiar rurki. Następnie wprowadź niepompowany balon wypełniony wodą przez przedsionek do lewej komory.

Przymocuj balon za pomocą taśmy klejącej. Następnie stopniowo zwiększaj prędkość pompy perystaltycznej, aby zapewnić odpowiedni przepływ do serca. Kontynuuj perfuzję serca buforem KH ze stałym przepływem wynoszącym około 2 ml/min, aż do momentu umieszczenia serca w sondzie NMR.

Napompuj balon LV niewielką objętością za pomocą mikrosyringi, aby zweryfikować działanie przetwornika ciśnienia LV dla spektroskopii NMR. Najpierw ostrożnie umieść serce w 10 milimetrowej probówce NMR. Wokół probówki NMR umieszcza się szeroki spinner (wirnik), który pomaga wprowadzić probówkę w odpowiednią pozycję.

Wewnątrz sondy mocno przymocuj cały aparat do przewodu pępowinowego za pomocą taśmy klejącej. Następnie powoli opuść przewód pępowinowy do górnego otworu magnesu, aż probówka NMR zawierająca serce znajdzie się wewnątrz cewki 10 milimetrowej sondy NMR. Gdy serce znajdzie się w odpowiedniej pozycji wewnątrz sondy, dostosuj przepływ pompy pasożytniczej, aby uzyskać ciśnienie perfuzyjne wynoszące 80 milimetrów słupa rtęci.

Utrzymaj ciśnienie perfuzyjne, aktywując mechanizm podtrzymania (hold) w sterowniku pompy. Pozostaw serce na 15 do 20 minut w celu wyrównania parametrów (ekwilibracji). W czasie ekwilibracji dostosuj objętość balonika w LV, aby uzyskać ciśnienie końcoworozkurczowe wynoszące od ośmiu do 10 mmHg.

Następnie zoptymalizuj parametry spektrometru, aby uzyskać jak najlepszy sygnał fosforu. Dostrój instrument NMR, ustawiając impuls radiowy tak, aby odpowiadał częstotliwości rezonansu jądra fosforu. Następnie wykonaj shimowanie próbki, aby ujednorodnić pole magnetyczne po okresie równoważenia.

Rozpocznij akwizycję wielu widm NMR 31P. Okres akwizycji dla każdego widma zależy od natężenia pola magnesu, wielkości próbki oraz stosunku sygnału do szumu wymaganego dla konkretnego eksperymentu. W tym przypadku widma uzyskano przy użyciu magnesu 14 Tesla poprzez uśrednianie sygnału otrzymanego z 256 impulsów częstotliwości radiowej o czasie trwania 20 µs, kącie odchylenia 60 stopni i opóźnieniach wynoszących 2,0 s.

Ten eksperyment zajmie około 10 minut. Typowy parametr funkcji serca, czyli ciśnienie rozwinięte lewej komory (LV), uzyskuje się poprzez odjęcie ciśnienia końcoworozkurczowego (EDP) od ciśnienia skurczowego. U zdrowej myszy szczepu C 57 black six ciśnienie rozwinięte LV serca wynosi zazwyczaj od 100 do 110 mmHg przy stałym ciśnieniu końcoworozkurczowym wynoszącym od 8 do 10 mmHg.

Przedstawiono reprezentatywne krzywe stylizacji dla myszy kontrolnych oraz myszy z przebindingowaną aortą. Funkcję skurczową reprezentuje ciśnienie rozwinięte LV w funkcji zwiększających się objętości LV, wyznaczone na podstawie objętości balonu w LV. Funkcję rozkurczową reprezentuje EDP w funkcji zwiększających się objętości LV.

Widma 31P NMR wyizolowanego, perfundowanego serca myszy wykazują sygnały fosfokreatyny (PHOSPHOCREATINE) lub PCR, trzech grup fosforanowych z TP oraz fosforanu nieorganicznego lub pi. W tym przypadku pik PI jest stosunkowo mały. Jest to typowe dla tlenowo perfundowanego serca dostarczanego z pirogronianem lub kwasami tłuszczowymi.

Oprócz glukozy w okresach niedokrwienia, ten pik wzrasta, podczas gdy pik PCR maleje. Właśnie pokazałem Państwu, jak przygotować serce myszy do perfuzji, aby podczas eksperymentu można było jednocześnie mierzyć funkcję serca i energetykę. Ważne jest, aby upewnić się, że serce jest odpowiednio perfundowane.

W przeciwnym razie dane NMR nie będą wiarygodne. To wszystko. Dziękujemy i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.