Reakcja żywych komórek na stymulację mechaniczną badana za pomocą zintegrowanej mikroskopii sił optycznych i atomowych
4 października 2010
Ten artykuł ma na celu zapoznanie czytelnika z działaniem zintegrowanego mikroskopu do obrazowania optycznego siły atomowej do mechanicznej stymulacji żywych komórek w hodowli. Przedstawiono protokół krok po kroku. Przedstawiono reprezentatywny zestaw danych, który pokazuje odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.
Badanie reakcji komórek w czasie rzeczywistym na stymulację mechaniczną odbywa się poprzez hodowlę pierwszych komórek eksprymujących białka fuzyjne GFP na szklanych naczyniach przez 24 godziny. Drugim krokiem jest pokrycie końcówki A FM biotynylowaną fibronektyną. Następnie funkcjonalizowana końcówka FM styka się z powierzchnią komórki, aby umożliwić utworzenie silnej adhezji ogniskowej wokół końcówki A FM, umożliwiając bezpośrednią manipulację cytoszkieletem działania poprzez połączenie aktynowe integryny macierzy między końcówką pokrytą fibronektyną a komórką.
Ostatnim krokiem jest mechaniczna stymulacja żywej komórki poprzez kontrolowany ruch końcówki A FM w górę, tak aby siła pionowa była przykładana w miejscu kontaktu komórki bez przerywania silnej przyczepności ogniskowej. Ostatecznie wyniki pokazują, że komórki reagują na stymulację mechaniczną, wzmacniając swoje przywiązanie do podłoża i indukując reorganizację cytoszkieletu aktynowego, co zarejestrowano za pomocą fluorescencyjnego obrazowania optycznego w czasie rzeczywistym. Cześć, nazywam się Andrea Trake, jestem adiunktem na Wydziale Biologii Systemów i Medycyny Translacyjnej w Centrum Nauk o Zdrowiu w Teksasie.
Cześć, jestem Sum Lim. Jestem adiunktem na Wydziale Biologii Systemów i Medycyny Translacyjnej w Centrum Nauk o Zdrowiu w Teksasie. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę badania adaptacyjnej przebudowy komórkowej do stymulacji mechanicznej.
Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania przebudowy cytoszkieletu w czasie rzeczywistym w żywych komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Więc zacznijmy. Do tych badań używany jest odwrócony mikroskop Olympus IX 81 z nasadką do fluorescencji lub darni z całkowitym wewnętrznym odbiciem w połączeniu z głowicą skanującą CSU 22 Yokogawa.
Mikroskop sił atomowych SZ do biologii jest zamontowany na górze odwróconego mikroskopu optycznego. Cały system jest zamontowany na stole optycznym klasy badawczej i został wcześniej szczegółowo opisany. Ten zintegrowany mikroskop wykorzystuje dwa urządzenia sprzężone z ładunkiem kwantowym EM lub kamery E-M-C-C-D.
Jeden służy do obrazowania murawy, a drugi do obrazowania konfokalnego. Zespół konfokalny, który składa się z zewnętrznego koła filtrów skanera z obracającym się dyskiem i kamery E-M-C-C-D, jest zamontowany na aluminiowej płycie podstawy umieszczonej na silikonowej podkładce niezbędnej do tłumienia drgań. Cały zespół konfokalny łączy się z mikroskopem poprzez kołnierz z gwintowanym kołnierzem.
W ten sposób zespół można odłączyć od mikroskopu podczas mikroskopii sił atomowych lub pomiarów FM, aby uniknąć wibracji ze skanera z obracającym się dyskiem. Laser argonowo-kryptonowy jest używany jako źródło wzbudzenia zarówno w trybach obrazowania darniowego, jak i konfokalnego. Laser może być sprzężony z jednym z dwóch światłowodów, które dostarczają laser do mocowania murawy lub konfokalnej głowicy skanującej.
Po drugie, komputery kontrolują system. Jeden wykorzystuje oprogramowanie do tworzenia slajdów, które steruje obrazowaniem optycznym, a drugi oprogramowanie do nanoskopu, które kontroluje A FM na 24 godziny przed eksperymentem stymulacji mechanicznej, umieszczając żywe komórki wyrażające konstrukty GFP skierowane przeciwko określonym białkom w naczyniu do hodowli komórek ze szklanym dnem. W dniu eksperymentu należy zastąpić pożywkę do hodowli komórkowej pożywką wolną od czerwieni fenolowej.
Ponieważ eksperyment FM jest bardzo wrażliwy na szumy, unikaj mówienia lub dotykania stołu optycznego lub mikroskopu podczas eksperymentu, aby zminimalizować hałas. W pomiarach FM odłącz konfokalny krążek wirujący od mikroskopu. Eksperyment rozpoczyna się od zamontowania szalki do hodowli komórkowej na stoliku FM z kołnierzem magnetycznym w celu zamocowania szalki do stolika mikroskopu magnetycznego.
Wspornik w kształcie litery V na sondzie A FM jest dostosowany za pomocą dwumikronowego biotynylowanego szklanego koralika. Wspornik można łatwo zobaczyć za pomocą mikroskopu. Koralik jest przyklejony na samym końcu wspornika i w tym miejscu roztwór powlekający należy nakładać kroplami.
Aby przygotować sondę FM do eksperymentu, najpierw zamontuj końcówkę w uchwycie na szklankę, a następnie umieść uchwyt na szklance na uchwycie stołowym, aby pokryć końcówkę. Umyj końcówkę, ostrożnie wlewając 10 mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanem docos lub DPBS na samym końcu końcówki, a następnie użyj chusteczki do wysuszenia końcówki. Powtórz tę procedurę pięć razy po umyciu DPBS w ilości jednego miligrama na mililitr.
Zapalony w roztworze. Kroplą nad końcówką. Pozostaw końcówkę do inkubacji przez pięć minut po pokryciu avadonem.
Umyj końcówkę jeszcze pięć razy za pomocą DPBS. Następnie usieciuj biotynylowaną fibronektynę na avadonie, dodając jeden miligram na mililitr roztworu. Kroplą na końcówkę i inkubować przez pięć minut.
Na koniec ponownie umyj końcówkę pięć razy za pomocą DPBS, pozostawiając ostatnią kroplę na końcówce. Po przygotowaniu końcówki zamontuj ją na skanerze FM. Po zamontowaniu końcówki FM umieść ochronną silikonową osłonę wokół uchwytu.
Następnie ustaw mikroskop oglądania wideo. Następnie wyrównaj końcówkę FM na środku pola view. Ustaw dźwignię optyczną, umieszczając wiązkę laserową na samym końcu wspornika.
Następnie zmień obiektyw na odpowiedni obiektyw o dużym powiększeniu do obrazowania pojedynczych komórek. Następnie umieść w polu widzenia ogniwo, które będzie stymulowane mechanicznie i wybierz miejsce, w którym końcówka A FM powinna wylądować na powierzchni komórki. Na koniec opuść końcówkę FM, aż dotknie tej konkretnej komórki.
Po zetknięciu końcówki z ogniwem odczekaj około 20 minut. Pozwala to na wytworzenie silnej adhezji ogniskowej w punkcie styku FM na powierzchni ogniwa. Po okresie oczekiwania procedura stymulacji mechanicznej może rozpocząć przygotowanie do eksperymentu ze stymulacją mechaniczną.
Przełącz się z kamery wideo na kamerę E-M-C-C-D, aby umożliwić oglądanie komórek fluorescencyjnych w celu obrazowania. Następnie uzyskaj początkowy obraz komórki w spoczynku. Użyj wirującego dysku i mikroskopii głosowej do wizualizacji aktu w cytoszkielecie w całym ciele komórki.
I odwrotnie, użyj murawy, aby uwidocznić zrosty ogniskowe, aby stymulować komórkę. Użyj wspornika, aby wykonać kontrolowany ruch w górę dyskretnymi krokami co trzy do pięciu minut. Podczas pozyskiwania danych A FM ważne jest, aby operator stale monitorował napięcie pozycji Z piso, aby określić właściwy czas dla słupa pionowego.
Równolegle z akwizycją danych FM rejestruj obraz konfokalny lub darniowy komórki po każdym pionowym pociągnięciu za pomocą oprogramowania do tworzenia slajdów. Na koniec wyjmij końcówkę FM z komórki po zakończeniu eksperymentu stymulacji. Transfekcja komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych aktyną MRFP i vcul.
GFP zobrazowano za pomocą FM na wierzchołkowej powierzchni komórki. Ta sama komórka została zobrazowana za pomocą darni na powierzchni komórki podstawnej. Tutaj te dwa obrazy nakładają się na siebie.
Obraz tej samej komórki został również uzyskany za pomocą wirującego dysku konfokalnego w całym ciele komórki i jest pokazany jako maksymalna projekcja stosu 3D. Pokazane są dobre nakładanie się obrazów konfokalnych A FM i wirującego dysku. Jej komórka mięśni gładkich naczyń krwionośnych transfekowana aktyną MRFP była mechanicznie stymulowana przez A FM i obrazowana za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.
Błędy wskazują na działające włókna, które wykazują niezwykłą restrukturyzację po stymulacji FM. Niektóre działające włókna polimeryzują, podczas gdy inne depolimeryzują w wyniku stymulacji mechanicznej, inne działające włókna łączą się ze sobą. Ze względu na restrukturyzację ustawy, właśnie pokazaliśmy, jak mechanicznie stymulować kulturę sprzedaży życia za pomocą EFM, jednocześnie rejestrując rearanżację CY za pomocą metod obrazowania optycznego.
Wykonując tę procedurę, należy pamiętać, że eksperyment FM jest niezwykle głośny i wrażliwy. Więc to wszystko. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w wygłaszaniu oświadczeń.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół wykorzystania zintegrowanego mikroskopu sił atomowych z obrazowaniem optycznym do mechanicznej stymulacji żywych komórek w hodowli. Metodologia obejmuje instrukcję krok po kroku oraz prezentuje reprezentatywne dane dotyczące odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Stymulacja mechaniczna
- Obrazowanie żywych komórek
Wprowadzenie
- Zrozumienie odpowiedzi komórek na bodźce mechaniczne jest kluczowe w biologii komórki.
- Mikroskopia sił atomowych umożliwia precyzyjną manipulację komórkami.
- Obrazowanie żywych komórek dostarcza informacji w czasie rzeczywistym na temat procesów komórkowych.
- Adhezja ogniskowa odgrywa kluczową rolę w przytwierdzaniu się komórek i ich odpowiedzi.
Cel badania
- Przeszkolić w zakresie obsługi specjalistycznego mikroskopu do badań żywych komórek.
- Zademonstrować efekty stymulacji mechanicznej na żywe komórki.
- Przedstawić szczegółowy protokół, umożliwiający badaczom replikację badania.
Zastosowane metody
- Komórki wykazujące ekspresję białek fuzyjnych z GFP są hodowane na szalkach szklanych.
- Sonda AFM jest powlekana biotynylanowaną fibronektyną.
- Funkcjonalizowana sonda AFM jest wykorzystywana do tworzenia adhezji ogniskowych z powierzchnią komórki.
- Stymulacja mechaniczna jest realizowana poprzez kontrolowany ruch sondy AFM w górę.
Główne wyniki
- Komórki wzmocniły swoje przytwierdzenie do podłoża po stymulacji.
- Zaobserwowano reorganizację cytoszkieletu aktynowego w odpowiedzi na siły mechaniczne.
- Obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym pozwoliło uchwycić dynamiczne odpowiedzi komórkowe.
- Protokół skutecznie wykazał efektywność zastosowanej techniki.
Wnioski
- Zintegrowany mikroskop pozwala na skuteczne badanie reakcji żywych komórek na bodźce mechaniczne.
- Metoda ta może przyczynić się do lepszego zrozumienia mechaniki i adhezji komórkowej.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować badanie różnych typów komórek oraz zróżnicowanych warunków.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie sposobu, w jaki żywe komórki wyczuwają siły mechaniczne i adaptują się do nich, ma kluczowe znaczenie dla minimalizacji ryzyka podczas walidacji celów w szlakach mechanotransdukcji. To zintegrowane podejście, łączące AFM z obrazowaniem optycznym, umożliwia w czasie rzeczywistym uzyskanie rozdzielczości podkomórkowej w badaniu dynamiki cytoszkieletu i adhezji, zapewniając pewność prognostyczną na wczesnym etapie odkryć poprzez powiązanie bodźców mechanicznych z reorganizacją strukturalną. Metoda ta wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez bezpośrednią wizualizację indukowanego siłą remodelingu aktyny oraz wzmacniania adhezji ogniskowej, co dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań (go/no-go) podczas przedklinicznego wyboru celu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne, wykazując, w jaki sposób stymulacja mechaniczna wywołuje reorganizację cytoszkieletu aktynowego i wzmacnianie adhezji ogniskowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośrednią obserwację zależnej od siły dynamiki cytoszkieletu w żywych komórkach adherentnych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez powiązanie sygnałów mechanicznych z efektami strukturalnymi, co zmniejsza niejednoznaczność w ocenie zaangażowania celów mechanosensytywnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez ustanowienie powtarzalnych protokołów stymulacji mechanicznej i obrazowania w czasie rzeczywistym.
- Wartość operacyjna: Odnosi się do standaryzacji testów i wyników ilościowych poprzez kontrolowany ruch końcówki AFM oraz zsynchronizowane odczyty fluorescencyjne.
- Skalowalność: Podkreśla możliwość ponownego wykorzystania platformy w różnych typach komórek przylegających, co umożliwia rzetelną ocenę związków w kampaniach przesiewowych z zakresu mechanobiologii.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Omówienie związku z chorobą poprzez wykazanie strukturalnego sprzężenia od strony apikalnej do bazalnej, w którym stymulacja apikalna indukuje reorganizację w obrębie całego ciała komórki.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Opis ciągłości od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez rejestrację dynamicznych odpowiedzi, które pozwalają na dopasowanie biomarkerów w szlakach mechanotransdukcji.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Koncentracja na wartości predykcyjnej redukcji ryzyka poprzez wykazanie, w jaki sposób przyłożenie siły prowadzi do polimeryzacji, depolimeryzacji i wiązkowania aktyny, co wyjaśnia mechanizm działania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od testowania hipotez po identyfikację związków wiodących, zapewniając wgląd w mechanizmy działania przed etapem przesiewowym związków.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, w jaki sposób metoda ta wspiera testowanie hipotez poprzez zastosowanie kontrolowanej stymulacji mechanicznej i obserwację przebudowy cytoszkieletu w czasie rzeczywistym.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość testu poprzez odtwarzalne tworzenie adhezji ogniskowych oraz ilościowe obrazowanie dynamiki aktyny z wykorzystaniem modalności TIRF i konfokalnej.
- Analityka: Podkreśla pomiary, takie jak zdarzenia polimeryzacji/depolimeryzacji aktyny i zmiany intensywności adhezji ogniskowych, które umożliwiają porównanie stanów stymulowanych i spoczynkowych.
- Badania translacyjne: Łączy tę metodę z ciągłością przedkliniczną, pokazując, jak apikalna stymulacja mechaniczna propaguje zmiany strukturalne przez ciało komórki, co jest istotne dla przenoszenia sił na poziomie tkanki.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako możliwość ponownego wykorzystania w badaniu celów mechanosensytywnych w modelach komórek naczyniowych, nabłonkowych i mezenchymalnych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celów, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach mechanotransdukcji.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność stymulacji mechanicznej oraz obrazowania multimodalnego.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zredukowane biologiczne ryzyko na późnych etapach w programach z zakresu mechanobiologii.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje o rozwoju oparte na bezpośredniej obserwacji indukowanej siłą adaptacji komórkowej.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana wiedza naukowa w zakresie obsługi AFM, obrazowania żywych komórek oraz dynamiki cytoszkieletu.
- Wymagane instrumentarium obejmuje zintegrowany system AFM-TIRF-konfokalny z tłumieniem wibracji i podwójnymi kamerami EM-CCD.
- Standaryzacja międzyzespołowa wymaga przestrzegania protokołów funkcjonalizacji końcówki, tworzenia adhezji ogniskowych oraz czasu stymulacji.
- Kwestie adaptacyjne obejmują różnorodną sztywność podłoża, białka powlekające i typy komórek przy zachowaniu specyficzności stymulacji apikalnej.
- Ograniczenia praktyczne obejmują czułość na szumy podczas pomiarów AFM oraz konieczność kontrolowania warunków środowiskowych w celu zminimalizowania dryfu.
