Name: Reakcja żywych komórek na stymulację mechaniczną badana za pomocą zintegrowanej mikroskopii sił optycznych i atomowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj metodę stymulacji mechanicznej żywych komórek za pomocą zintegrowanej mikroskopii sił atomowych i optycznej. Technika ta pozwala obserwować w czasie rzeczywistym reorganizację cytoszkieletu aktynowego i wzmocnienie przyczepności komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Plazmid Vinculin-GFP był darem od Kennetha Yamady z National Institutes of Health, National Institute of Dental and Craniofacial Research w Bethesda, Maryland, a plazmid actin-mRFP był darem od Michaela Davidsona z Florida State University w Tallahassee, Florida.
Praca ta była finansowana z grantu NSF Career nr 0747334 oraz AHA-National SDG nr 0835205N przyznanego Andreei Trache.

1. Przegląd zintegrowanego systemu mikroskopowego
System mikroskopowy wykorzystany w tych badaniach został opisany szczegółowo 1. W skrócie, odwrócony mikroskop Olympus IX-81 z przystawką TIRF (Olympus, Center Valley, PA) został połączony z głowicą skanującą CSU-22 Yokogawa (Yokogawa Electric Inc, Japan). Mikroskop sił atomowych Bioscope SZ (Veeco Instruments Inc, Santa Barbara, CA) jest zamontowany na górze optycznego mikroskopu odwróconego, a cały układ został umieszczony na stole optycznym klasy badawczej (Newport, irvine, CA).
Układ konfokalny składający się ze skanera z dyskiem obrotowym, zewnętrznego koła filtrów i kamery EMCCD (Roper Scientific-Photometrics, Tucson, AZ) jest sztywno połączony z aluminiową płytą podstawową umieszczoną na silikonowej podkładce niezbędnej do tłumienia drgań. Skaner konfokalny łączy się z mikroskopem za pomocą kołnierza z gwintowaną obręczą, która może zostać odłączona od mikroskopu podczas pomiarów AFM, tak aby drgania pochodzące ze skanera z dyskiem obrotowym nie wpływały na pomiary AFM. Laser argonowo-kryptonowy (Spectra Physics, Mountain View, CA) służy jako źródło wzbudzenia zarówno dla trybu obrazowania TIRF, jak i konfokalnego, i może być alternatywnie sprzężony z dwoma światłowodami, które dostarczają wiązkę lasera odpowiednio do przystawki TIRF lub głowicy skanującej. Systemem sterują dwa komputery: oprogramowanie Slidebook kontroluje obrazowanie optyczne, a oprogramowanie Nanoscope steruje AFM.
2. Hodowla komórkowa
Żywe komórki wykazujące ekspresję konstruktów GFP nakierowanych na specyficzne białka należy umieścić w szalku hodowlanym z szklanym dnem na 24 godziny przed eksperymentem zycie stymulacji mechanicznej. W dniu eksperymentu należy wymienić pożywkę hodowlaną na pożywkę bez czerwieni fenolowej. Szalkę hodowlaną montuje się na stoliku AFM za pomocą magnetycznego pierścienia mocującego.
3. Przygotowanie sondy AFM i konfiguracja mikroskopu
Końcówkę AFM zmodyfikowaną 2 micron biotynilowaną kuleczką szklaną należy przemyć pięciokrotnie DPBS, a następnie inkubować przez 5 min z awidyną (1 mg/ml), ponownie przemyć pięciokrotnie DPBS i inkubować przez 5 min z 1 mg/mL biotynilowaną fibronektyną. Na koniec końcówkę należy przemyć jeszcze pięć razy 2, zamontować na skanerze AFM, a następnie wokół uchwytu umieścić ochronną silikonową osłonę. Należy ustawić mikroskop w trybie podglądu wideo, aby wycentrować końcówkę AFM w polu widzenia. Należy skalibrować dźwignię optyczną, kierując wiązkę lasera na sam koniec wspornika, a następnie zmienić obiektyw na obiektyw o dużym powiększeniu odpowiedni do obrazowania pojedynczych komórek. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy wyznaczyć stałą sprężystości końcówki. Parametr ten zostanie zmierzony metodą szumu termicznego (thermal tune) dostępną w oprogramowaniu Nanoscope. Należy przełączyć kamerę z trybu wideo na kamerę EMCCD, aby umożliwić obrazowanie fluorescencyjne. Następnie należy wybrać komórkę i doprowadzić końcówkę AFM do kontaktu z tą konkretną komórką. Po 20 min oczekiwania, niezbędnym do uformowania się silnej adhezji ogniskowej w punkcie kontaktu końcówki AFM z powierzchnią komórki, rozpocznie się procedura stymulacji mechanicznej.
4. Stymulacja mechaniczna żywej komórki
Obrazowanie TIRF 3-4 będzie preferowaną metodą wizualizacji i kwantyfikacji adhezji ogniskowych, natomiast obrazowanie konfokalne z dyskiem obrotowym (spinning-disk) 5 zostanie wykorzystane do wizualizacji cytoszkieletu aktynowego w całym ciele komórki. AFM 6 zostanie użyty w trybie obrazowania kontaktowego w cieczy.
Przed rozpoczęciem procedury stymulacji mechanicznej zostanie wykonany obraz komórki przy użyciu mikroskopii TIRF lub konfokalnej. Stymulację mechaniczną wywoła funkcjonalizowana sonda AFM, która będzie przemieszczać się w górę w dyskretnych krokach co 3-5 min przez określony czas (1-1,5 godziny). Reakcja komórki będzie rejestrowana w sposób ciągły w oprogramowaniu Nanoscope jako seria obrazów wysokości, gdzie każda linia na obrazie reprezentuje jednostkę czasu wynoszącą 1 sec. Podczas pozyskiwania danych AFM operator stale monitoruje pozycję z końcówki AFM, aby określić właściwy moment kolejnego pociągnięcia.
Po każdej stymulacji mechanicznej możliwe jest wykonanie obrazu TIRF lub konfokalnego komórki w oprogramowaniu Slidebook, przy jednoczesnym ciągłym pozyskiwaniu danych AFM. Obrazy optyczne mogą być przetwarzane w trybie off-line w celu stworzenia filmów pokazujących reorganizację cytoszkieletu aktynowego i adhezji ogniskowych. Ponadto każdy obraz może zostać poddany analizie ilościowej w celu określenia powierzchni komórki, powierzchni konkretnych białek oraz analizy ogólnej morfologii komórki.
Po zakończeniu eksperymentu końcówka AFM zostaje wycofana z komory, a następnie w oprogramowaniu Nanoscope dokonuje się pomiaru czułości końcówki AFM.
Eksperyment jest bardzo wrażliwy na zakłócenia! Należy unikać rozmów oraz dotykania mikroskopu w trakcie jego przeprowadzania. Aby zminimalizować poziom szumów w pomiarach AFM, konfokalny mikroskop z dyskiem obrotowym powinien zostać odseparowany od mikroskopu. Czas oczekiwania na utworzenie silnej adhezji ogniskowej między powierzchnią komórki a końcówką AFM może się różnić w zależności od zastosowanego typu komórek oraz macierzy naniesionej na końcówkę.
5. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2072/2072fig1.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii komórkowej przedstawiające strukturę cytoszkieletu z barwieniem fluorescencyjnym, z uwydatnieniem białek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Ta sama komórka mięśni gładkich naczyń (VSMC) przetransfekowana actin-mRFP i vinculin-GFP została zobrazowana za pomocą: (A) AFM na apikalnej powierzchni komórki; (B) TIRF na bazalnej powierzchni komórki; oraz (C) konfokalnej mikroskopii z dyskiem obrotowym w całej objętości komórki. Obraz konfokalny przedstawiono jako projekcję maksymalną stosu 3-D. Dobre nakładanie się obrazów AFM i TIRF lub obrazów konfokalnych z dyskiem obrotowym pokazano odpowiednio w (D) i (E). Rozmiar obrazu wynosi 64 x 50 micron.
<img src="/files/ftp_upload/2072/2072fig2.jpg" alt="Time-lapse dynamiki filamentów aktynowych w komórce, mikroskopia fluorescencyjna, analiza w czasie 0-66 min." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Komórka VSMC przetransfekowana aktyną-mRFP została poddana stymulacji mechanicznej za pomocą AFM i obrazowaniu za pomocą konfokalnej mikroskopii z dyskiem obrotowym. Strzałki wskazują włókna aktynowe, które: (a) polimeryzują/pogrubiają się, (b) depolimeryzują/zanikają lub (c) łączą się w pęczki w wyniku przebudowy aktyny. Białe przerywane linie reprezentują końcówkę AFM nad komórką. Rozmiar obrazu 91 x 91 micron.

<ol><li>Trache, A., Lim, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+microscopy+for+real-time+imaging+of+mechanotransduction+studies+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells.</a> J Biomed Opt. 14, 034024-03 (2009).</li>
<li>Trache, A., Meininger, G. A. Atomic Force Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrache%2C+A+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22">Current Protocols in Microbiology</a>. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. Volume 2C 2.1-2.17 (2008).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J Biomed Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Trache, A., Meininger, G. A. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrache%2C+A+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22">Current Protocols in Microbiology</a>. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. 2B 2.1-2.22 (2008).</li>
<li>Inoue, S., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-view+high-speed+confocal+scanner%3A+the+CSU-10%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct-view high-speed confocal scanner: the CSU-10.</a> Methods Cell Biol. 70, 87-127 (2002).</li>
<li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscope.</a> Phys Rev Lett. 56, 930-933 (1986).</li>
<li>Stamenović, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+mechanics+in+airway+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal mechanics in airway smooth muscle cells.</a> Respir Physiol Neurobiol. 163, 25-32 (2008).</li>
<li>Gunst, S. J., Tang, D. D., Opazo Saez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+remodeling+of+the+airway+smooth+muscle+cell%3A+a+mechanism+for+adaptation+to+mechanical+forces+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal remodeling of the airway smooth muscle cell: a mechanism for adaptation to mechanical forces in the lung.</a> Respir Physiol Neurobiol. 137, 151-168 (2003).</li>
<li>Worth, N. F., Rolfe, B. E., Song, J., Campbell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation+in+culture+is+associated+with+reorganization+of+contractile+and+cytoskeletal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganization of contractile and cytoskeletal proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 49, 130-145 (2001).</li>
<li>Romer, H. R., Birukov, K. G., Garcia, J. G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+Adhesions%3A+paradigm+for+a+signaling+nexus%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Focal Adhesions: paradigm for a signaling nexus.</a> Circulation Research. 98, 606-616 (2006).</li>
<li>Opazo Saez, A., Zhang, W., Wu, Y., Turner, C. E., Tang, D. D., Gunst, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+development+during+contractile+stimulation+of+smooth+muscle+requires+recruitment+of+paxillin+and+vinculin+to+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tension development during contractile stimulation of smooth muscle requires recruitment of paxillin and vinculin to the membrane.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 286, C433-C447 (2004).</li>
<li>Alenghat, F. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction%3A+all+signals+point+to+cytoskeleton%2C+matrix+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Sciences+STKE%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix and integrins.</a> Sciences STKE. 119, pe6-pe6 (2002).</li>
<li>Zamir, E., Geiger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+complexity+and+dynamics+of+cell-matrix+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular complexity and dynamics of cell-matrix adhesions.</a> J Cell Sci. 114, 3583-3590 (2001).</li>
<li>Geiger, B., Bershdsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+mechanosensory+function+of+focal+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly and mechanosensory function of focal contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 13, 584-592 (2001).</li>
<li>Sastry, S. K., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+Adhesions%3A+a+nexus+for+intracellular+signaling+and+cytoskeletal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Focal Adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics.</a> Exp Cell Res. 261, 25-36 (2000).</li>
<li>Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mechanotransduction.</a> Dev Cell. 10, 11-20 (2006).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Cytoszkielet 7-10 oraz adhezje ogniskowe 11-16 to dynamiczne struktury, które montują się, rozpraszają i ulegają wymianie w miarę jak komórki migrują lub reagują na siły mechaniczne 17. Pełnią one istotne funkcje w regulacji wzrostu, przeżywalności i ekspresji genów komórek. Znajomość ich specyficznego rozmieszczenia i dynamiki pozwala na lepsze zrozumienie sposobu, w jaki komórki komunikują się z macierzą oraz między sobą.
Ten nowy system mikroskopowy znajduj...

<table><tbody><tr><td>igła AFM</td><td>Novascan Technologies, Inc.</td><td></td><td>Kulek borokrzemianowy 2 micron, 0,01N/m, powierzchnia z biotyną</td></tr><tr><td>awidyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9275</td><td>1mg/mL w DPBS</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4759</td><td>1 mg/mL</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>21600-051</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do transfekcji Amaxa dla komórek mięśni gładkich</td><td>Lonza Inc.</td><td>VPI-1004</td><td></td></tr><tr><td>Szybka Mattek z dnem szklanym</td><td>MatTek Corp.</td><td>P60G-1.5-30-F</td><td>Sterylne naczynia Falcon 60mm ze szkiełkiem podstawowym nr 1,5</td></tr></tbody></table>

badanie odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i sił atomowych

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

Aby zrozumieć mechanizm, dzięki któremu żywe komórki wyczuwają siły mechaniczne oraz sposób, w jaki reagują i adaptują się do swojego środowiska, opracowano nową technologię umożliwiającą badanie zachowania komórek na poziomie subkomórkowym z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. W tym celu mikroskop sił atomowych (AFM) zintegrowano z mikroskopią fluorescencyjną z całkownym wewnętrznym odbiciem (TIRF) oraz konfokalną mikroskopią z szybkoobrotowym dyskiem (FSD). Zintegrowany system znajduje szerokie zastosowanie w szerokim zakresie badań dynamiki molekularnej w dowolnych przylegających żywych komórkach, umożliwiając bezpośrednie obrazowanie optyczne reakcji komórek na stymulację mechaniczną w czasie rzeczywistym. Wykazano znaczną reorganizację filamentów aktynowych i adhezji ogniskowych w wyniku lokalnej stymulacji mechanicznej na apikalnej powierzchni komórki, co wywołało zmiany w strukturze komórkowej w całym ciele komórki. Te innowacyjne techniki dostarczą nowych informacji służących zrozumieniu restrukturyzacji i dynamiki żywych komórek w odpowiedzi na siłę mechaniczną. Przedstawiono szczegółowy protokół oraz reprezentatywny zestaw danych wykazujący odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.

Celem niniejszej pracy jest przeszkolenie czytelnika w obsłudze zintegrowanego mikroskopu sił atomowych i obrazowania optycznego do stymulacji mechanicznej żywych komórek w hodowli. Przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku. Zaprezentowano reprezentatywny zestaw danych obrazujący odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.

Badanie odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i sił atomowych

Aby zrozumieć mechanizm, za pomocą którego żywe komórki wyczuwają siły mechaniczne oraz sposób, w jaki reagują i adaptują się do swojego środowiska, opracowano nową technologię zdolną do ...

Badanie odpowiedzi komórkowej w czasie rzeczywistym na stymulację mechaniczną przeprowadza się poprzez uprzednią hodowlę komórek wykazujących ekspresję białek fuzyjnych GFP na szalkach z dnem szklanym przez 24 godziny. Drugim krokiem jest pokrycie końcówki AFM biotynilowaną fibronektyną. Następnie funkcjonalizowana końcówka AFM jest doprowadzana do kontaktu z powierzchnią komórki, aby umożliwić utworzenie silnej adhezji ogniskowej wokół końcówki AFM, co pozwala na bezpośrednią manipulację cytoszkieletem aktynowym poprzez połączenie macierz-integryna-aktyna pomiędzy pokrytą fibronektyną końcówką a komórką.Ostatnim krokiem jest mechaniczna stymulacja żywej komórki poprzez kontrolowany ruch w górę końcówki AFM, tak aby siła w pionie była przyłożona w punkcie kontaktu z komórką bez zrywania silnej adhezji ogniskowej. Ostatecznie wyniki pokazują, że komórki reagują na stymulację mechaniczną poprzez wzmocnienie przytwierdzenia do podłoża oraz indukowanie reorganizacji cytoszkieletu aktynowego, co zarejestrowano za pomocą fluorescencyjnego obrazowania optycznego w czasie rzeczywistym. Dzień dobry, nazywam się Andrea Trake, jestem adiunktem w Katedrze Biologii Systemów i Medycyny Translacyjnej w Texas A&amp;M Health Science Center.Witajcie, jestem Sum Lim. Jestem pracownikiem podoktorskim w Katedrze Biologii Systemów i Medycyny Translacyjnej w Texas A&amp;M Health Science Center. Dzisiaj przedstawimy procedurę badania adaptacyjnego przebudowywania komórkowego w odpowiedzi na stymulację mechaniczną.W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania przebudowy cytoszkieletu w czasie rzeczywistym w żywych komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Przejdźmy zatem do części praktycznej. Do tych badań wykorzystywana jest odwrócona mikroskopia Olympus IX 81 z modułem fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) połączonym z głowicą skanującą CSU 22 Yokogawa.Mikroskop sił atomowych Bio Scope SZ jest zamontowany na odwróconym mikroskopie optycznym. Cały system został umieszczony na stole optycznym klasy badawczej i został wcześniej szczegółowo opisany. Ten zintegrowany mikroskop wykorzystuje dwie kamery Quant EM z urządzeniem sprzężonym ładunkowo z mnożeniem elektronów (E-M-C-C-D).Jeden służy do obrazowania powierzchniowego, a drugi do obrazowania konfokalnego. Układ konfokalny, składający się ze skanera z dyskiem obrotowym, zewnętrznego koła filtrów oraz kamery E-M-C-C-D, jest zamontowany na aluminiowej płycie bazowej umieszczonej na podkładce silikonowej, niezbędnej do tłumienia drgań. Cały układ konfokalny jest połączony z mikroskopem za pomocą kołnierza z gwintowaną tuleją.Dzięki temu zespół ten może zostać odłączony od mikroskopu podczas pomiarów za pomocą mikroskopii sił atomowych lub pomiarów FM, aby uniknąć wibracji pochodzących ze skanera z wirującym dyskiem. Jako źródło wzbudzenia dla trybów obrazowania turf i konfokalnego wykorzystuje się laser argonowo-kryptonowy. Laser może być sprzężony z jednym z dwóch światłowodów, które doprowadzają wiązkę do przystawki turf lub do konfokalnej głowicy skanującej.Systemem sterują dwa komputery. Jeden wykorzystuje oprogramowanie slide book do sterowania obrazowaniem optycznym, a drugi oprogramowanie nano scope do sterowania AFM. Na 24 godziny przed eksperymentem ze stymulacją mechaniczną umieść żywe komórki wykazujące ekspresję konstruktów GFP skierowanych przeciwko konkretnym białkom w naczyniu hodowlanym z dna szklanego. W dniu eksperymentu zastąp pożywkę hodowlaną pożywką wolną od czerwieni fenolowej.Ponieważ eksperyment a FM jest bardzo wrażliwy na zakłócenia, należy unikać rozmów oraz dotykania stołu optycznego lub mikroskopu podczas pomiarów w celu zminimalizowania szumów. W pomiarach a FM należy odsprzęgać konfokalny skaner z dyskiem obrotowym od mikroskopu. Eksperyment rozpoczyna się od zamontowania naczynia z hodowlą komórkową na stoliku a FM, używając kołnierza magnetycznego do przymocowania naczynia do magnetycznego stolika mikroskopu.W kształcie litery V ramionko sondy A FM zostało zmodyfikowane poprzez przymocowanie dwumikronowej biotynilowanej kuleczki szklanej. Ramionko jest łatwo widoczne pod mikroskopem. Kuleczka jest przyklejona na samym końcu ramionka; w tym miejscu należy kroplowo nanosić roztwór powlekający.Aby przygotować sondę FM do eksperymentu, należy najpierw zamocować końcówkę w uchwycie szklanym, a następnie umieścić uchwyt szklany na podstawie stołu w celu powleczenia końcówki. Przemyj końcówkę, ostrożnie nakrapiając 10 µL soli fosforanowej w docosanie lub DPBS na sam koniec końcówki, a następnie osusz ją za pomocą chusteczki Kimwipe. Powtórz tę procedurę pięciokrotnie po przemyciu DPBS o stężeniu 1 mg/mL.Avid w roztworze. Dodawać kroplami na końcówkę. Po powleczeniu końcówki avidonem inkubować przez pięć minut.Przemyj końcówkę jeszcze pięć razy za pomocą DPBS. Następnie przeprowadź sieciowanie biotynilowanej fibronektyny na avadonie, dodając roztwór o stężeniu 1 mg/mL. Naniesienie powinno odbywać się kroplowo na końcówkę, a następnie należy inkubować przez 5 minut.Na koniec ponownie przemyj końcówkę pięć razy przy użyciu DPBS, pozostawiając ostatnią kroplę na końcówce. Po przygotowaniu końcówki zamocuj ją w skanerze AFM. Po zamontowaniu końcówki AFM umieść ochronną silikonową osłonę wokół uchwytu.Następnie przygotuj mikroskop do podglądu wideo. Potem ustaw końcówkę FM w centrum pola widzenia. Ustaw dźwignię optyczną, kierując wiązkę lasera na sam koniec wspornika.Następnie zmień obiektyw na odpowiedni obiektyw o dużym powiększeniu do obrazowania pojedynczych komórek. Następnie wprowadź w pole widzenia komórkę, która zostanie poddana stymulacji mechanicznej, i wybierz miejsce na powierzchni komórki, w którym powinna spocząć końcówka AFM. Na koniec opuszczaj końcówkę AFM, aż zetknie się ona z wybraną komórką.Po zetknięciu końcówki z komórką należy odczekać około 20 minut. Pozwala to na utworzenie silnej adhezji ogniskowej w punkcie styku AFM na powierzchni komórki. Po upływie czasu oczekiwania można rozpocząć procedurę stymulacji mechanicznej w ramach przygotowań do eksperymentu.Przełącz z kamery wideo na kamerę E-M-C-C-D, aby umożliwić obrazowanie fluorescencyjnych komórek. Następnie wykonaj obraz początkowy komórki w stanie spoczynku. Wykorzystaj mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do wizualizacji aktynowego cytoszkieletu w obrębie całego ciała komórki.W przeciwnym razie należy użyć końcówki do wizualizacji adhezji ogniskowych w celu stymulacji komórki. Wykorzystaj dźwignię, aby zastosować kontrolowany ruch w górę w odstępach czasowych co trzy do pięciu minut. Podczas pozyskiwania danych A FM operator musi stale monitorować napięcie pozycji Z piso, aby określić właściwy moment dla bieguna pionowego.Równolegle z akwizycją danych FM, po każdym pionowym pociągnięciu, zarejestruj obraz konfokalny lub obraz typu turf komórki, korzystając z oprogramowania slide book. Na koniec, po zakończeniu eksperymentu stymulacyjnego, wycofaj końcówkę AFM z komórki. Komórka mięśni gładkich naczyń krwionośnych przetransfekowana mRFP aktyny i vcul.Obrazowanie GFP przeprowadzono przy użyciu FM na powierzchni apikalnej komórki. Tę samą komórkę obrazowano przy użyciu turf na powierzchni bazalnej komórki. Tutaj oba obrazy są nałożone na siebie.Obraz tej samej komórki został również zarejestrowany przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym w obrębie całego ciała komórki i przedstawiono go jako projekcję maksymalną stosu 3D. Widoczne są dobre nakładanie się obrazów z A FM i konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym. Komórka mięśni gładkich naczyń krwionośnych, przetransfekowana aktyną MRFP, była stymulowana mechanicznie za pomocą A FM i obrazowana za pomocą konfokalnej mikroskopii z dyskiem wirującym.Błędy wskazują na włókna aktynowe, które wykazują znaczną przebudowę po stymulacji FM. Niektóre włókna aktynowe polimeryzują, podczas gdy inne depolimeryzują w wyniku stymulacji mechanicznej, a pozostałe włókna aktynowe łączą się w pęczki. Ze względu na przebudowę aktyny, zaprezentowaliśmy sposób mechanicznej stymulacji żywej hodowli komórkowej przy użyciu EFM przy jednoczesnym rejestrowaniu reorganizacji CY za pomocą metod obrazowania optycznego.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że eksperyment FM jest niezwykle szumiący i czuły. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w badaniach.

live-cell-response-to-mechanical-stimulation-studied-integrated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Reakcja żywych komórek na stymulację mechaniczną badana za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i mikroskopii sił atomowych

Międzykomórkowe fale Ca2+ są napędzane przez kanały połączeń szczelinowych i półkanały. W tym miejscu opisujemy metodę pomiaru międzykomórkowych fal Ca2 + w monowarstwach komórkowych w odpowiedzi na lokalny bodziec mechaniczny pojedynczej komórki oraz jej zastosowanie do badania właściwości i regulacji kanałów połączeń szczelinowych i półkanałów.

Propagacja fal wapniowych indukowana stymulacją mechaniczną w monowarstwach komórkowych: przykład komórek śródbłonka rogówki bydła

Ten artykuł demonstruje protokół charakteryzujący właściwości mechaniczne żywych komórek za pomocą mikrowgłębienia za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM).

Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Nowatorski protokół obrazowania został opracowany przy użyciu niestandardowego mechanicznego siłownika napędzanego silnikiem, aby umożliwić pomiar reakcji w czasie rzeczywistym na mechaniczne naprężenia w żywych komórkach. Istotny z punktu widzenia mechanobiologii system może nanosić szczepy do 20%, umożliwiając jednocześnie obrazowanie w czasie zbliżonym do rzeczywistego za pomocą mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii sił atomowych.

Obrazowanie żywych komórek podczas rozciągania mechanicznego

Tutaj opisujemy metody oceny odpowiedzi komórkowej na ostrą stymulację mechaniczną. W teście opartym na mikroskopii badamy lokalizację biosensorów znakowanych fluorescencyjnie po krótkiej stymulacji przepływem ścinającym. Badamy również biochemicznie aktywację różnych interesujących nas białek w odpowiedzi na ostrą stymulację mechaniczną.

Ocena odpowiedzi Dictyostelium discoideum na ostrą stymulację mechaniczną

Nowe narzędzia do badań mechanobiologii są potrzebne, aby zrozumieć, jak stres mechaniczny aktywuje szlaki biochemiczne i wywołuje reakcje biologiczne. W tym artykule prezentujemy nową metodę selektywnej stymulacji mechanicznej unieruchomionych zwierząt za pomocą pułapki mikroprzepływowej, umożliwiającej obrazowanie odpowiedzi komórkowych w wysokiej rozdzielczości.

Wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego do stymulacji mechanicznej i obrazowania C. elegans w wysokiej rozdzielczości

Korzystając z wcześniej zaprojektowanego urządzenia do mechanicznego obciążania przylegających komórek, ten artykuł opisuje przeprojektowaną geometrię podłoża i dostosowane urządzenie do obrazowania pojedynczych komórek w wysokiej rozdzielczości z obiektywem 100x zanurzenia w olejku.

Obrazowanie dynamiki jądrowej w wysokiej rozdzielczości w żywych komórkach pod wpływem jednoosiowego odkształcenia rozciągającego

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji wsporników mikroskopu sił atomowych (AFM) z pojedynczym limfocytem T i cząstką kulki do badań immunologicznych. Przedstawiono procedury badania wiązania jednoparowych komórek T z komórkami dendrytycznymi przez AFM oraz monitorowania odpowiedzi komórkowej makrofagów w czasie rzeczywistym na pojedynczą cząstkę stałą za pomocą AFM z obrazowaniem fluorescencyjnym.

Funkcjonalizacja wsporników mikroskopu sił atomowych z pojedynczymi limfocytami T lub pojedynczą cząstką do immunologicznej spektroskopii sił pojedynczych komórek

Siły mechaniczne są ważne dla kontrolowania migracji komórek. Protokół ten demonstruje użycie elastycznych hydrożeli, które można odkształcić za pomocą szklanej mikropipety i mikromanipulatora w celu stymulacji komórek za pomocą lokalnego gradientu sztywności w celu wywołania zmian w strukturze komórki i migracji.

Test durotaksji pojedynczej komórki do oceny mechanicznej kontroli ruchu komórkowego i powiązanych zdarzeń sygnalizacyjnych

Prezentowany jest tutaj protokół techniki Conpokal, która łączy mikroskopię konfokalną i mikroskopię sił atomowych w jedną platformę instrumentów. Conpokal zapewnia tę samą komórkę, ten sam region, prawie równoczesne obrazowanie konfokalne i mechaniczną charakterystykę żywych próbek biologicznych.

Niemal równoczesna skaning laserowy Mikroskopia konfokalna i mikroskopia sił atomowych (Conpokal) na żywych komórkach

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Niniejszy artykuł opisuje protokół mechanicznej charakterystyki żywych sferoidów w macierzy 3D za pomocą mikrospektroskopii Brillouina. Ta całkowicie optyczna metoda umożliwia wizualizację sferoidów o rozdzielczości mikroskalowej oraz ilościowych właściwościach mechanicznych. To podejście ma znaczenie dla fenotypowania mechanicznego; na przykład określanie stanów patologicznych kulistych nowotworów w mikrośrodowisku 3D.

Mechaniczne mapowanie sferoidów za pomocą spektroskopii Brillouina

Poznaj metodę stymulacji mechanicznej żywych komórek za pomocą zintegrowanej mikroskopii sił atomowych i optycznej. Technika ta pozwala obserwować w czasie rzeczywistym reorganizację cytoszkieletu aktynowego i wzmocnienie przyczepności komórek.

Badanie odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i sił atomowych

Przeglądaj więcej filmów