Celowanie w głębokie struktury mózgu za pomocą mikroiniekcji w celu dostarczania leków, wektorów wirusowych lub przeszczepów komórek
December 1st, 2010
W tym artykule pokazujemy metodę wytwarzania szklanych igieł kapilarnych o świetle 50 μm. Technika ta znacznie zmniejsza uszkodzenia mózgu, minimalizuje bierną dyfuzję leków i umożliwia precyzyjne celowanie w mózg gryzonia.
Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie bardzo precyzyjnych mikroiniekcji do głębokich struktur mózgu w celu dostarczenia leków, wektorów wirusowych lub przeszczepów komórek. Osiąga się to poprzez wyprodukowanie najpierw szklanych igieł kapilarnych o świetle 50 mikrometrów. Drugim krokiem procedury jest napełnienie 50% igły olejem mineralnym za pomocą kapilary i włożenie tłoka najszerszym końcem rurki.
Trzecim krokiem procedury jest nałożenie na igłę substancji lub zawiesiny komórek, którą chcesz wstrzyknąć. Ostatnim krokiem procedury jest wprowadzenie końcówki igły i wstrzyknięcie substancji z bardzo małą szybkością przepływu do głębokiej struktury mózgu. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują bardzo precyzyjne kierowanie substancji do mózgu poprzez mikroiniekcje za pomocą szklanej rurki kapilarnej.
Cześć, nazywam się Oscar Gonzalez i pracuję w Laboratorium Neuronauki w Szkole Psychologii na Uniwersytecie Colima w Meksyku. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę wykonywania mikroiniekcji za pomocą szklanej rurki kapilarnej w celu dostarczenia leków do mózgu myszy. Stosujemy tę procedurę w wystarczającej ilości laboratorium, aby badać dorosłe nerwowe komórki macierzyste.
Więc zacznijmy. Stosowanie szklanych igieł kapilarnych o świetle 50 mikrometrów do mikroiniekcji do mózgu znacznie zmniejsza uszkodzenia mózgu, minimalizuje bierną dyfuzję leków i pozwala na precyzyjne celowanie w mózg gryzonia. Zanim będzie można wykonać mikroiniekcje, muszą być skonstruowane szklane igły.
Zacznij od umieszczenia szklanej rurki kapilarnej w elektrodzie ciągnącej o wysokiej rezystancji ściągacza do mikropipet. Następnie włącz elektrodę ściągacza do mikropipet. Aby podgrzać środek szklanej rurki, aby miejscowo zmiękczyć szklaną rurkę, rozciągnij szklaną rurkę wzdłuż jej osi podłużnej na początkową odległość od trzech do pięciu milimetrów, wystarczająco, aby spowodować zmniejszenie średnicy szklanej rurki w zlokalizowanym obszarze.
Kontynuuj rozciąganie szklanej rurki, aż pęknie. Powtórz te kroki, aby utworzyć dwie identyczne igły z pojedynczą lufą. Teraz umieść szklane igły w mikro kuźni.
Do ukosowania końcówki wystarczy kąt 30 stopni. Na koniec umieść igły pod mikroskopem i sprawdź, czy obie mają odpowiednią średnicę wewnętrzną. W przypadku większości leków hydrofilowych średnica wewnętrzna od 30 do 50 mikrometrów jest idealna przy skonstruowanych igłach.
Zobaczmy, jak używać ich do mikro zastrzyków. Na początek napełnij skonstruowaną igłę olejem mineralnym od najszerszego końca. Pozwól, aby olej mineralny dostał się kapilarnie, aż osiągnie około 50% długości rurki kapilarnej.
Umieścić smar wysokopróżniowy wokół najszerszego końca igły i włożyć przez niego tłok. Delikatnie wepchnij olej mineralny, aż mała kropla sceny wypłynie z końcówki szklanej igły. Teraz zabezpiecz igłę w uchwycie mikrowstrzykiwacza i zacznij przygotowywać zwierzę do wstrzyknięcia.
Najpierw umieść poduszkę grzewczą na stereotaktycznym uchwycie zwierzęcia, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia. W temperaturze 37 stopni Celsjusza ogol głowę znieczulonej myszy, a następnie umieść ją i zabezpiecz w urządzeniu stereotaktycznym. Używając pasków do uszu i uchwytu na zęby, użyj ostrza chirurgicznego, aby naciąć skórę od uszu do linii czaszki Lambda.
Wypoleruj czaszkę bawełnianym wacikiem, aby ją wysuszyć i wyciągnąć skórę z pola operacyjnego. Następnie za pomocą końcówki szklanej igły skieruj na wierzchołek szwu bgma i ustaw tam początkową pozycję wstrzyknięcia. Teraz ustaw punkt na czaszce, który ma zostać wywiercony, przesuwając osie x i y urządzenia stereotaktycznego nad czaszką.
Za pomocą mikrowiertła badawczego ostrożnie wywierć otwory w wybranych współrzędnych za pomocą drobnych kleszczyków. Ostrożnie usuń najgłębszą warstwę kości i rozbij nowoczesną błonę opony twardej. Zobaczysz, jak wycieka płyn mózgowo-rdzeniowy.
Aby potwierdzić, że igła może przejść przez wywiercone otwory, powoli opuść szklaną igłę za pomocą osi Z urządzenia stereotaktycznego. Teraz odpipetuj jeden mikrolitr leku do wstrzyknięcia i umieść go na małym kawałku perfum. Umieść perfumy na czaszce.
Zassaj lek, obracając kołem mikrowtryskiwacza, sprawdzając przez mikroskop, czy płyn dostaje się do szklanej igły. Usuń folię para, a następnie zresetuj współrzędną zerową. Teraz przesuń igłę do wybranych współrzędnych i opuść uchwyt, aż końcówka szklanej igły delikatnie dotknie powierzchni mózgu i ustaw współrzędną Z na zero.
Wprowadzić szklaną igłę do miąższu mózgu na żądanej głębokości. Lek należy wstrzykiwać powoli w tempie około jednego nanolitra na sekundę. Po wstrzyknięciu żądanej objętości pozwól lekowi dyfundować do miąższu przez dwie minuty, a następnie przystąp do płynnego i powolnego usuwania igły.
Na koniec przyklej ranę pooperacyjną i wyjmij zwierzę z urządzenia stereotaktycznego. Umieść zwierzę w przedwojennej klatce w celu odzyskania znieczulenia. Teraz pokażemy kilka wyników mikroiniekcji.
Lizofosfatydylocholina lub liina została wstrzyknięta do ciała kossum, które powoduje demielinizację dróg istoty białej, aby zminimalizować uszkodzenie mózgu spowodowane szklaną igłą. Wstrzyknięto tylko 20 litrów lyiny. Demielinizacja jest reprezentowana przez brak ekspresji podstawowego białka mieliny w drogach istoty białej, uzyskuje się bardzo precyzyjne wstrzyknięcie, a bardzo wąska droga igłowa minimalizuje uszkodzenie mózgu.
Właśnie pokazaliśmy, jak konstruować szklane igły do wykonywania mikroiniekcji w głębokie struktury mózgu. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o tym, aby wszystkie sprzęty i materiały były gotowe do użycia na sali operacyjnej. Więc to wszystko.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę tworzenia igieł kapilarnych ze szkła o świetle 50-μm, umożliwiającą precyzyjne mikro iniekcje do głębokich struktur mózgu. Ta technika minimalizuje uszkodzenia mózgu i zmniejsza pasywną dyfuzję leków, umożliwiając ukierunkowane podawanie w modelach na gryzoniach.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Techniki mikroiniekcji
- Systemy dostarczania leków
Tło
- Mikro iniekcje są niezbędne do bezpośredniego wprowadzania substancji do mózgu.
- Tradycyjne metody mogą powodować znaczne uszkodzenia mózgu i nieefektywne podawanie leków.
- Igły kapilarne ze szkła oferują rozwiązanie dla precyzyjnego ukierunkowania.
- To badanie koncentruje się na ulepszaniu procesu mikroiniekcji.
Cel badania
- Opracowanie metody tworzenia igieł kapilarnych ze szkła o świetle 50-μm.
- Poprawa precyzji podawania leków do głębokich struktur mózgu.
- Minimalizowanie uszkodzeń mózgu podczas procesu wstrzykiwania.
Stosowane metody
- Produkcja igieł kapilarnych ze szkła o świetle 50 μm.
- Wypełnienie igły olejem mineralnym, aby ułatwić wstrzyknięcie.
- Zalanie igły pożądaną substancją lub zawiesiną komórek.
- Podawanie substancji z bardzo niskim przepływem do docelowych obszarów mózgu.
Główne wyniki
- Metoda umożliwia precyzyjne ukierunkowanie substancji w mózgu.
- Znaczna redukcja uszkodzeń mózgu w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Efektywne podawanie leków, wektorów wirusowych lub transplantatów komórek.
- Wykazana skuteczność w modelach na gryzoniach.
Wnioski
- Opracowany technika poprawia precyzję mikroiniekcji.
- Przedstawia niezawodną metodę dostarczania leków w badaniach neuronaukowych.
- To podejście może być zastosowane do różnych substancji, poprawiając wyniki eksperymentalne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Precise delivery of therapeutic agents to deep brain structures remains a critical challenge in neuroscience drug development, particularly in small animal models where procedural trauma can confound results. This microinjection method enhances target engagement fidelity by minimizing injection-induced tissue damage and passive diffusion, thereby improving the reliability of pharmacological and genetic intervention studies. The approach supports mechanistic de-risking in early discovery by enabling reproducible, low-volume delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants with reduced biological variability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables accurate interrogation of therapeutic hypotheses in deep brain nuclei by reducing off-target effects from injection trauma.
- Operational Value: Supports consistent delivery of compounds or genetic tools across studies, improving reproducibility in target validation workflows.
- Predictive Confidence: Minimizes procedural variability that could obscure true pharmacological or biological responses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with minimal lesion burden for downstream compound screening in CNS pathways.
- Operational Value: Enables standardized, low-volume (20–100 nl) injections suitable for high-precision assay formats requiring tight pharmacokinetic control.
- Platform Reuse: Adaptable to various substances (drugs, viral vectors, cells) by adjusting needle lumen size, supporting multi-modal screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enhances disease model fidelity by reducing confounding injury from injection procedures, improving translational relevance.
- Operational Value: Facilitates repeatable interventions in longitudinal studies, supporting chronic dosing or cell transplant regimens.
- Risk-Adjusted Advancement: Improves confidence in target engagement data, aiding go/no-go decisions in preclinical programs.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, where precise CNS delivery is essential for assessing target modulation and pathway engagement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing in deep brain structures by enabling accurate delivery of pharmacological or genetic probes.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible dosing for compound evaluation in vivo, critical for dose-response and target occupancy studies.
- Analytics: Generates clean readouts by minimizing procedure-induced noise, improving signal detection in biomarker or efficacy measurements.
- Translational Research: Promotes continuity from discovery to preclinical by ensuring consistent, low-trauma delivery across study phases.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized, adaptable capability for CNS delivery applicable across multiple projects and modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity from injection artifacts.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories and studies through defined needle preparation and injection parameters.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing failed studies due to procedural variability or off-target effects.
- Portfolio Impact: Enables more reliable prioritization of CNS targets based on cleaner pharmacological and genetic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, stereotactic coordination, and needle fabrication using a pipette puller and micro forge.
- Depends on access to specialized instrumentation including a stereotactic frame, microinjector, and microscope for needle visualization.
- Necessitates standardization of needle lumen size (50 µm) and filling protocol (50% mineral oil) for consistent performance across users.
- Adaptation to different model systems may require coordinate adjustment and validation of needle penetration depth.
- Practical limitations include the technical skill needed for needle pulling and beveling, and the low throughput inherent to manual microinjection.
