Celowanie w głębokie struktury mózgu za pomocą mikroiniekcji w celu dostarczania leków, wektorów wirusowych lub przeszczepów komórkowych
1 grudnia 2010
W niniejszym artykule przedstawiamy metodę wykonywania szklanych igieł kapilarnych o świetle 50-μm. Technika ta znacząco ogranicza uszkodzenia mózgu, minimalizuje pasywną dyfuzję leków i pozwala na precyzyjne celowanie w mózg gryzonia.
Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie wysoce precyzyjnych mikroiniekcji do głębokich struktur mózgu w celu podania leków, wektorów wirusowych lub przeszczepów komórkowych. Osiąga się to najpierw poprzez wykonanie szklanych igieł kapilarnych o świetle 50 µm. Drugim krokiem procedury jest wypełnienie 50% igły olejem mineralnym drogą kapilarną i wprowadzenie tłoka od szerszego końca rurki.
Trzecim krokiem procedury jest napełnienie igły substancją lub zawiesiną komórkową, którą należy wstrzyknąć. Ostatnim krokiem procedury jest wprowadzenie końcówki igły i wstrzyknięcie substancji z bardzo niską prędkością przepływu do głębokiej struktury mózgu. W rezultacie można uzyskać bardzo precyzyjne dostarczanie substancji do mózgu za pomocą mikroiniekcji z wykorzystaniem szklanej kapilary.
Witajcie, jestem Oscar Gonzalez z Laboratorium Neuronauki na Wydziale Psychologii Uniwersytetu w Colima w Meksyku. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wykonywania mikroińekcji za pomocą szklanej kapilary w celu podania leków do mózgu myszy. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego.
Zacznijmy zatem. Stosowanie szklanych igieł kapilarnych o świetle 50 µm do mikroiniekcji do mózgu znacznie ogranicza uszkodzenia tkanki mózgowej, minimalizuje pasywną dyfuzję leków i pozwala na precyzyjne celowanie w mózgu gryzoni. Przed przystąpieniem do mikroiniekcji należy przygotować szklane igły.
Zacznij od umieszczenia szklanej rurki kapilarnej w wyciągarzu wysokoodpornych elektrod mikropipet. Następnie włącz elektrodę wyciągacza mikropipet. Aby podgrzać środkową część szklanej rurki i doprowadzić do jej lokalnego zmiękczenia, rozciągnij rurkę wzdłuż jej osi podłużnej o początkową odległość od 3 do 5 mm, co powinno spowodować zmniejszenie średnicy rurki w obszarze lokalnym.
Kontynuuj rozciąganie rurki szklanej, aż pęknie. Powtórz te kroki, aby przygotować dwie identyczne igły jednokanałowe. Następnie umieść igły szklane w mikrokuźni.
Kąt 30 stopni jest wystarczający do sfazowania końcówki. Na koniec należy umieścić igły pod mikroskopem i sprawdzić, czy obie mają prawidłową średnicę wewnętrzną. W przypadku większości leków hydrofilowych, dla tak wykonanych igieł, idealna średnica wewnętrzna wynosi od 30 do 50 mikrometrów.
Przeanalizujmy, jak wykorzystać je do mikroiniekcji. Na początek należy napełnić wykonaną igłę olejem mineralnym od szerszego końca. Pozostaw olej mineralny, aby wniknął siłami kapilarnymi, aż osiągnie około 50% długości rurki kapilarnej.
Nanieść smar próżniowy na najszerszy koniec igły i wsunąć przez niego tłok. Delikatnie wypychać olej mineralny, aż z końcówki szklanej igły pojawi się mała kropla. Następnie zamocować igłę w uchwycie mikroinjektora i przystąpić do przygotowania zwierzęcia do iniekcji.
W pierwszej kolejności umieść matę grzewczą w stereotaktycznym uchwycie dla zwierząt, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia. Przy temperaturze 37 °C ogol głowę znieczyszonej myszy, a następnie umieść ją w urządzeniu stereotaktycznym i odpowiednio zabezpiecz. Przy użyciu prętów usznych i uchwytu do zębów, wykonaj skalpelem nacięcie skóry od uszu do linii Lambda czaszki.
Osusz czaszkę za pomocą patyczka higienicznego i odsunie skórę z pola operacyjnego. Następnie, za pomocą końcówki szklanej igły, wskaż wierzchołek szwu bgma i wyznacz w tym miejscu początkową pozycję wstrzyknięcia. Teraz określ punkt na czaszce, który ma zostać wywiercony, przesuwając osie X i Y urządzenia stereotaktycznego nad czaszką.
Używając laboratoryjnej mikrowiertarki, ostrożnie wywiercić otwory w wybranych współrzędnych, posiłkując się precyzyjną pęsetą. Ostrożnie usunąć najgłębszą warstwę kości i przerwać błonę twardą. Pojawi się wyciek płynu mózgowo-rdzeniowego.
Aby potwierdzić, że igła może przejść przez wywiercone otwory, powoli opuść szklaną igłę, korzystając z osi Z urządzenia stereotaktycznego. Następnie pobierz pipetą 1 µL leku do wstrzyknięcia i nanieś go na mały kawałek parafiny. Umieść parafinię na czaszce.
Naciągnij lek, obracając pokrętło mikroinjektora i kontrolując pod mikroskopem, czy ciecz przemieszcza się w górę szklanej igły. Usuń folię Parafilm i zresetuj współrzędną zero. Następnie przesuń igłę do wybranych współrzędnych i obniż uchwyt, aż końcówka szklanej igły delikatnie dotknie powierzchni mózgu, a następnie ustaw współrzędną Z na zero.
Wprowadź szklaną igłę do miąższu mózgu na pożądaną głębokość. Wstrzyknij lek powoli, z prędkością około jednego nanolitra na sekundę. Po wstrzyknięciu pożądanej objętości pozwól lekowi dyfundować do miąższu przez dwie minuty, a następnie płynnym i powolnym ruchem wyjmij igłę.
Na koniec zaklej ranę chirurgiczną i wyjmij zwierzę z urządzenia stereotaktycznego. Umieść zwierzę w klatce z podgrzewaczem w celu wybudzenia z narkozy. Teraz zaprezentujemy wyniki mikrowstrzyknięć.
Lizofosfatydylocholinę (lyin) wstrzyknięto do ciałamózgowia, co wywołuje demielinizację szlaków istoty białej, aby zminimalizować uraz mózgu spowodowany igłą szklaną. Wstrzyknięto jedynie 20 litrów lyin. Demielinizacja objawia się brakiem ekspresji podstawowego białka mieliny w szlakach istoty białej; dzięki bardzo precyzyjnemu wstrzyknięciu i zastosowaniu bardzo cienkiej igły zminimalizowano uraz mózgu.
Właśnie pokazaliśmy, jak wykonać szklane igły do mikroiniekcji w głębokie struktury mózgu. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o przygotowaniu całego sprzętu i materiałów do użycia w sali operacyjnej. To wszystko.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę wytwarzania szklanych igieł kapilarnych o świetle 50-µm, co umożliwia precyzyjne mikroiniekcje do głębokich struktur mózgu. Technika ta minimalizuje uszkodzenia tkanki mózgowej i ogranicza dyfuzję pasywną leków, pozwalając na celowane dostarczanie substancji w modelach gryzoni.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Techniki mikroiniekcji
- Systemy dostarczania leków
Wstęp
- Mikroiniekcje są niezbędne do dostarczania substancji bezpośrednio do mózgu.
- Tradycyjne metody mogą powodować znaczne uszkodzenia mózgu i nieefektywne dostarczanie leków.
- Szklane igły kapilarne stanowią rozwiązanie umożliwiające precyzyjne celowanie.
- Niniejsze badanie koncentruje się na udoskonaleniu procesu mikroiniekcji.
Cel badania
- Opracowanie metody tworzenia szklanych igieł kapilarnych o świetle 50-µm.
- Zwiększenie precyzji podawania leków do głębokich struktur mózgu.
- Zminimalizowanie uszkodzeń mózgu podczas procesu iniekcji.
Zastosowane metody
- Wytwarzanie szklanych igieł kapilarnych o świetle 50 µm.
- Napełnianie igły olejem mineralnym w celu ułatwienia iniekcji.
- Napełnianie igły pożądaną substancją lub zawiesiną komórkową.
- Wstrzykiwanie substancji z niską prędkością przepływu do wybranych obszarów mózgu.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia precyzyjne celowanie w substancje w mózgu.
- Znaczna redukcja uszkodzeń mózgu w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Efektywne dostarczanie leków, wektorów wirusowych lub przeszczepów komórkowych.
- Wykazana skuteczność w modelach gryzoni.
Wnioski
- Opracowana technika zwiększa precyzję mikroiniekcji.
- Zapewnia ona niezawodną metodę dostarczania leków w badaniach z zakresu neuronauki.
- Podejście to można zastosować do różnych substancji, co poprawia wyniki eksperymentalne.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Precyzyjne dostarczanie środków terapeutycznych do głębokich struktur mózgu pozostaje krytycznym wyzwaniem w rozwoju leków w neuronauce, szczególnie w modelach małych zwierząt, gdzie urazy proceduralne mogą zafałszować wyniki. Ta metoda mikroiniekcji zwiększa wierność dotarcia do celu poprzez minimalizację uszkodzeń tkanek wywołanych wstrzykiwaniem oraz ograniczenie dyfuzji pasywnej, co poprawia niezawodność badań nad interwencjami farmakologicznymi i genetycznymi. Podejście to wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków, umożliwiając powtarzalne dostarczanie małych objętości leków, wektorów wirusowych lub transplantatów komórkowych przy zredukowanej zmienności biologicznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia dokładną weryfikację hipotez terapeutycznych w głębokich jądrach mózgu poprzez ograniczenie efektów pozacelowych wynikających z urazu podczas iniekcji.
- Wartość operacyjna: Wspiera spójne dostarczanie związków lub narzędzi genetycznych w różnych badaniach, co poprawia powtarzalność w procesach walidacji celów.
- Pewność prognostyczna: Minimalizuje zmienność proceduralną, która mogłaby zamaskować rzeczywiste odpowiedzi farmakologiczne lub biologiczne.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne z minimalnym stopniem uszkodzeń do dalszego screeningu związków w szlakach OUN.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzowane iniekcje małych objętości (20–100 nl), odpowiednie dla wysokoprecyzyjnych formatów testów wymagających ścisłej kontroli farmakokinetycznej.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Możliwość adaptacji do różnych substancji (leków, wektorów wirusowych, komórek) poprzez dostosowanie średnicy światła igły, co wspiera wielomodalne kampanie screeningowe.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zwiększa wierność modelu choroby poprzez ograniczenie zakłócających urazów wynikających z procedur wstrzykiwania, co poprawia istotność translacyjną.
- Wartość operacyjna: Umożliwia powtarzalne interwencje w badaniach podłużnych, wspierając schematy przewlekłego dawkowania lub transplantacji komórek.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Zwiększa pewność danych dotyczących zaangażowania celu, pomagając w podejmowaniu decyzji go/no-go w programach przedklinicznych.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu po optymalizację związku wiodącego, gdzie precyzyjne dostarczenie substancji do OUN jest niezbędne do oceny modulacji celu i zaangażowania szlaku sygnałowego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez w głębokich strukturach mózgu, umożliwiając precyzyjne dostarczanie sond farmakologicznych lub genetycznych.
- Screening: Zapewnia ilościowe, powtarzalne dawkowanie do oceny związków in vivo, co jest kluczowe dla badań zależności dawka-odpowiedź oraz stopnia zajętości celu.
- Analityka: Generuje przejrzyste wyniki poprzez minimalizację szumów indukowanych procedurą, co poprawia detekcję sygnału w pomiarach biomarkerów lub skuteczności.
- Badania translacyjne: Sprzyja ciągłości od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, zapewniając spójne, małoinwazyjne dostarczanie substancji we wszystkich fazach badania.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi zstandaryzowaną, adaptowalną metodę dostarczania do ośrodkowego układu nerwowego, którą można zastosować w wielu projektach i modalnościach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej wynikającej z artefaktów wstrzykiwania.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację w różnych laboratoriach i badaniach dzięki zdefiniowanym parametrom przygotowania igły i wstrzykiwania.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez redukcję liczby nieudanych badań wynikających ze zmienności proceduralnej lub efektów pozacelowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia bardziej niezawodną priorytetyzację celów w OUN w oparciu o czystsze dane farmakologiczne i genetyczne.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrochirurgii, koordynacji stereotaktycznej oraz wytwarzania igieł przy użyciu wyciągacza do pipet i mikrokuźni.
- Zależne od dostępu do specjalistycznej aparatury, w tym ramy stereotaktycznej, mikroinjektora oraz mikroskopu do wizualizacji igły.
- Wymaga standaryzacji średnicy światła igły (50 µm) oraz protokołu napełniania (50% oleju mineralnego) w celu zapewnienia powtarzalności wyników u różnych użytkowników.
- Adaptacja do różnych systemów modelowych może wymagać korekty współrzędnych oraz walidacji głębokości penetracji igły.
- Ograniczenia praktyczne obejmują umiejętności techniczne niezbędne do wyciągania i szlifowania igieł oraz niską przepustowość charakterystyczną dla ręcznej mikroiniekcji.
