Name: Mechaniczne obciążenie ścięgna ex vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Poznaj metodę mechanicznego obciążania ścięgien ex vivo w układzie in vitro umożliwiającym jednoczesne testowanie czterech próbek. Technika ta pozwala badać mechanizmy chorób ścięgien nadgarstka i łokcia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol>
<li>Uzupełnić &nbsp;pożywkę niezależną od CO2 płtką bydlęcą (FBS), l-glutaminą, antybiotykami i kwasem askorbinowym</li>
<li>Odmiarzyć 40 ml do probówek wiriówek 50 ml (jedna dla każdego ścięgna)</li>
<li>Odmiarzyć 10 ml do probówek wiriówek 15 ml (jedna dla każdego ścięgna)</li>
<li>Sterylizować narzędzia chirurgiczne, prześcieradła autoklawowe, pęsety i klucz dynamometryczny w autoklawie</li>
<li>Sterylizować zaciski i końcówki mikrometru siłowego poprzez moczenie w 70% etanolu przez noc</li>
<li>Pobrać ścięgna z tylnych łap królika. Królik powinien zostać uśpiony nie więcej niż 2 godziny wcześniej.</li>
<li>Umieścić ścięgna w probówce wirówkowej 15 ml wypełnionej pożywką</li>
<li>Rozłożyć sterylną tkaninę autoklawową w celu utworzenia pola sterylnego</li>
<li>Zmierzyć pole przekroju poprzecznego ścięgna <ol style="margin-top: 0in">
<li>Zamocować końcówki mikrometru w mikrometrze, odpowiednio je wyrównując</li>
<li>Chwycić ścięgno za końce</li>
<li>Umieścić najcieńszą sekcję ścięgna w rowku</li>
<li>Poprosić asystenta o położenie obciążnika 50g</li>
<li>Odczekać 30 sekund i odczytać grubość (CSA = grubość x 1,3)</li>
</ol></li>
<li>Umieścić ścięgno z powrotem w probówce wirówkowej 15 ml</li>
<li>Powtórzyć czynność dla każdego ścięgna przeznaczonego do załadowania</li>
<li>Zdjąć siłownik z podstawy</li>
<li>Wyciąć dwa paski gazy sterylnej o wymiarach 15mm na 40mm oraz jeden kawałek 3mm na 5mm dla każdego ścięgna</li>
<li>Mocno zwinąć każdy pasek i umieścić go pomiędzy rowkami dystalnego zacisku</li>
<li>Wyjąć ścięgno z probówki wirówkowej i umieścić na zaciskach: koniec dystalny ścięgna w zacisku dystalnym, a region włóknistochrząstkowy ścięgna w zacisku proksymalnym</li>
<li>Położyć kawałek gazy 3x5 na górnej części końca dystalnego ścięgna i zabezpieczyć zacisk</li>
<li>Zabezpieczyć zacisk proksymalny, upewniając się, że ścięgno pozostaje wyrównane pomiędzy zaciskami i posiada wystarczający luz, aby nie było pod napięciem podczas dokręcania zacisków. Dokręcić zaciski do 1N-m</li>
<li>Umieścić probówkę wirówkową 50ml z pożywką w podstawie</li>
<li>Zamontować siłownik w podstawie</li>
<li>Powtórzyć czynność dla każdego ścięgna przeznaczonego do załadowania</li>
<li>Umieścić podstawę nad kąpielą wodną</li>
<li>Protokół obciążania <ol style="margin-top: 0in">
<li>Wykonać kondycjonowanie wstępne ścięgien</li>
<li>Przyłożyć obciążenie 0,5N, zmierzyć długość ścięgna (jest to długość pomiarowa)</li>
<li>Przyłożyć obciążenie cykliczne</li>
</ol></li>
<li>Zdjąć siłownik z podstawy</li>
<li>Zwolnić ścięgno z zacisków</li>
<li>Przetworzyć ścięgno</li>
</ol>

<ol><li>Asundi, K., Kursa, K., Lotz, J. C., Rempel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+system+for+applying+cyclic+loads+to+connective+tissues+under+displacement+or+force+control%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">In vitro system for applying cyclic loads to connective tissues under displacement or force control.</a> Ann Biomed Eng. 35, 1188-1195 (2007).</li>
<li>Asundi, K. R., Rempel, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+loading+inhibits+expression+of+MMP-3+but+not+MMP-1+in+an+in+vitro+rabbit+flexor+tendon+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biomech%22%5BJournal%5D)">Cyclic loading inhibits expression of MMP-3 but not MMP-1 in an in vitro rabbit flexor tendon model.</a> Clin Biomech. , In Press Forthcoming.</li>
<li>Asundi, K. R., Rempel, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP-1%2C+IL-1%CE%B2+and+COX-2+mRNA+Expression+is+Modulated+by+Static+Load+in+Rabbit+Flexor+Tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">MMP-1, IL-1β and COX-2 mRNA Expression is Modulated by Static Load in Rabbit Flexor Tendon.</a> Ann Biomed Eng. , In Press Forthcoming.</li>
</ol>

Film prezentuje nowy system do jednoczesnego obciążania do czterech żywych ścięgien w hodowli tkankowej. Typowy czas obciążania wynosi od 2 do 48 godzin. Po obciążeniu ścięgna są usuwane i poddawane analizie ekspresji genów. System ten umożliwia badanie wpływu wzorca obciążenia na zmiany w genach związanych z procesami degeneracyjnymi w ścięgnie. Eksperymenty te mogą dostarczyć wiedzy na temat mechanizmów urazów związanych z powtarzalnym obciążeniem. Pozwalają one również zidentyfikować obciążenia mogące powodować uszkod...

mechaniczne obciążanie ścięgna ex vivo

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

Urazy ścięgien (np. zapalenie ścięgna nadgarstka, zapalenie nadkłykcia) wynikające z przeciążenia są powszechne w działalności sportowej oraz w środowisku pracy. Większość z nich wiąże się z powtarzalnymi czynnościami rąk wymagającymi użycia dużej siły. Mechanizmy uszkodzeń komórkowych i strukturalnych wywołanych cyklicznym obciążaniem nie są dobrze znane. Celem niniejszego filmu jest prezentacja nowego systemu, który umożliwia jednoczesne obciążanie czterech ścięgien w hodowli tkankowej. W filmie opisano metody sterylnego pobierania tkanek oraz sposób mocowania ścięgien w systemie zaciskowym, który następnie jest zanurzony w pożywce i utrzymywany w temperaturze 37°C. Jeden zacisk pozostaje nieruchomy, podczas gdy drugi jest przemieszczany za pomocą siłownika liniowego. Siła rozciągająca ścięgna jest monitorowana za pomocą ogniwa pomiarowego połączonego szeregowo z ruchomym zaciskiem. Siłowniki są sterowane za pomocą programu LabView. Cztery ścięgna mogą być poddawane powtarzalnemu obciążaniu z różnymi wzorcami obciążenia, częstotliwością powtórzeń, szybkością nakładania obciążenia oraz czasem trwania. Obciążanie może trwać od kilku minut do 48 godzin. Po zakończeniu procesu obciążania ścięgna są usuwane, a fragmenty ich części środkowej pobierane do analiz biochemicznych. System ten pozwala na badanie wpływu wzorców obciążania na ekspresję genów oraz zmiany strukturalne w ścięgnach. W ostateczności pozwala to na badanie mechanizmów urazów spowodowanych przeciążeniem, z zastosowaniem uzyskanych wyników w leczeniu i profilaktyce.

Opisano nowy system in vitro do jednoczesnego obciążania czterech ścięgien w hodowli.

Mechaniczne obciążanie ścięgna ex vivo

Urazy ścięgien (np. zapalenie ścięgien nadgarstka, epicondylitis) wynikające z nadmiernego obciążenia są częste podczas aktywności sportowej oraz w miejscu pracy. Większość z nich wiąże się z...

Nazywam się David Rempel. Jestem wykładowcą w Departamencie Bioinżynierii na Uniwersytecie Kalifornijskim w Berkeley. Eksperyment, który Państwo zobaczą, polega na rozciąganiu ścięgien, a jego celem jest próba wyjaśnienia i zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw zaburzeń ścięgien w obrębie nadgarstka i łokcia.Zaburzenia ścięgien są powszechne wśród sportowców oraz pracowników wykonujących powtarzalne czynności manualne. Krish Sundi, jeden z doktorantów w naszym laboratorium, zaprezentuje kilka funkcji systemu, a konkretnie pomiar pola przekroju poprzecznego ścięgna. Następnie umieści ścięgna w siłownikach.Zaprezentuje on system cyklicznego obciążania ścięgna w okresie 24 godzin, a następnie usunie ścięgno z systemu. Dobrze, oto zaprojektowany i zbudowany przez nas system obciążania. Jak widać, składa się on z sześciu siłowników.Są to siłowniki o wysokiej precyzji, zdolne do wywierania przemieszczenia rzędu jednego mikrometra; szeregowo z siłownikiem połączona jest ogniwo tensometryczne służące do rejestrowania obciążeń przyłożonych do ścięgien. Szeregowo z ogniwem tensometrycznym znajdują się zaciski, które są wystarczająco długie, aby można było je zanurzyć w medium w celu utrzymania żywotności ścięgien. Cały system ten należy następnie umieścić w kąpieli wodnej, aby utrzymać temperaturę medium na poziomie 37 °C.Teraz pokażę Państwu, w jaki sposób zamocowałbym ścięgno w tym systemie. Pierwszym krokiem, który musimy wykonać, jest pomiar powierzchni przekroju poprzecznego ścięgna, abyśmy mogli zastosować odpowiednie naprężenia. Czy możesz podać mi probówkę ze ścięgnem?Niniejsze ścięgna zostały pobrane od nowozelandzkiego królika białego. Zostały one dostarczone przed chwilą, zatem są wciąż świeże, a od eutanazji królika minęło mniej niż dwie godziny. Odcinek ścięgna, którego pole przekroju mierzę, znajduje się w jego najcieńszej części.Dzieje się tak, ponieważ w tym miejscu wystąpią największe naprężenia, wynikające z najmniejszego pola przekroju poprzecznego. Czy możesz teraz położyć ciężarek na tłoku? Teraz odczekujemy 30 sekund, aby odczytać grubość 1.3.Czy możesz podnieść tłok i umieścić ścięgno z powrotem w medium? Teraz zdemontuję siłownik, w którym zamocuję ścięgno. Następnie zamocuję ścięgno w zaciskach.Tutaj możemy zobaczyć zbliżenie siłownika. Widoczny jest sam siłownik, przetwornik siły oraz zaciski, które rozszerzają się na zewnątrz. Podkładki te powinny mieć szerokość około 0,5 do 0,75 cala i długość około 1,5 cala.Następnie należy wziąć gaziki i zanurzyć je w pożywce, aby je nawilżyć. Ułatwi to proces rolowania. Tak zwinięte paski gazy należy umieścić w rowkach zacisków serpentynowych. Teraz wyjmę ścięgno z pożywki.Ten koniec stanowi miejsce przyczepu ścięgna mięśnia zginacza do końca palca królika. Ten obszar tutaj to region chrząstki włóknistej. Ścięgno jest umieszczone w taki sposób, aby region chrząstki włóknistej został zaciśnięty w zacisku proksymalnym.Następnie zaciskany jest ścięgno, a śruby ponownie dokręcane są z siłą 1 N·m. Potem odcinany jest nadmiar ścięgna, dzięki czemu siłownik zostaje unieruchomiony w uchwycie, a całe ścięgno wraz z zaciskami zostają zanurzone w zmodyfikowanym medium. Tę samą procedurę należy zastosować w celu zamocowania ścięgien w kolejnych siłownikach.Jak widać, mamy łącznie sześć sztuk, więc możemy przeprowadzić to badanie na sześciu oddzielnych ścięgnach. Cały układ zostaje następnie podniesiony i umieszczony w kąpieli wodnej, aby utrzymać temperaturę medium na poziomie 37°C. Teraz zastosujemy do ścięgna obciążenie cykliczne w zakresie od 0.5 do 5 MPa.Używane przez nas oprogramowanie to LabVIEW, napisane na specjalne zamówienie. W pierwszej kolejności przeprowadzamy kondycjonowanie ścięgna. Przykładamy 20 cykli obciążenia cyklicznego w zakresie od 0,5 megapascals do dwóch megapascals.Zmierzoną grubość wprowadź za pomocą czterech dostarczonych mikrometrów. Program automatycznie obliczy pole przekroju poprzecznego, a następnie wyda polecenie do siłownika, aby zwiększał przemieszczenie, aż do momentu przyłożenia do ścięgna obciążenia wynoszącego 2 MPa.W tym przypadku śledzimy fioletową linię. Po przyłożeniu do ścięgna obciążenia wynoszącego 2 megapascal, program przyłoży do ścięgna obciążenie 0,5 megapascal. Gdy oba te obciążenia zostaną osiągnięte, program będzie cyklicznie przełączać się między nimi, stale aktualizując pozycję pomiędzy tymi dwoma żądanymi wartościami obciążenia.Obciążanie to jest przeprowadzane z prędkością 10 megapascals na sekundę przy częstotliwości 0,5 hertz. Po wstępnym warunkowaniu ścięgna dążymy do uzyskania obciążenia rzędu 0,5 newton. Długość ścięgna pod obciążeniem 0,5 Newton definiujemy jako długość pomiarową ścięgna.Gdy program wykryje to obciążenie, odczytujemy pozycję siłownika; aktualna wartość, wynosząca sześć osiemset dwadzieścia pięć, stanowi długość pomiarową ścięgna. Po zarejestrowaniu długości pomiarowej ścięgna wracamy do programu obciążeń cyklicznych, wprowadzamy pożądane wartości 5 MPa oraz 0,5 MPa, podajemy całkowitą liczbę cykli, do której chcemy poddać próbkę obciążeniu, a następnie ponownie uruchamiamy ten sam program, aby cyklicznie obciążać ścięgno w zakresie od 0,5 do 5 MPa. Obciążanie to odbywa się z prędkością 10 MPa/s przy częstotliwości 0,5 Hz.Po poddaniu cyklicznemu obciążeniu, zazwyczaj przez 24 godziny, siłownik zostaje usunięty z systemu, po czym ścięgno można odciąć i przetworzyć w pożądany sposób. Właśnie zaprezentowaliśmy nasze ścięgna, które zostały pobrane sterylnie od królików. Przedstawiony proces był procesem półsterylnym, jednak doprowadził on do cyklicznego obciążania ścięgien w okresie 24 godzin.Następnie ścięgna są analizowane za pomocą R-T-P-C-R w celu oceny ekspresji genów. Analizujemy również ścięgna pod kątem innych zmian, w tym zmian strukturalnych oraz innych markerów histologicznych. Ostatecznym celem tego eksperymentu jest ustalenie, jaki wpływ mają różne wzorce obciążenia na podstawowe mechanizmy urazów ścięgien, które mogą być powiązane z tendinopatiami i zapaleniem ścięgien.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Eks vivo obciążenie mechaniczne ścięgna

Niniejszy artykuł opisuje procedury eksperymentalne stosowane w celu przygotowania ścięgien z ogonów szczurów do badań biomechanicznych i mechanobiologicznych. Przedstawiono kluczowe etapy przygotowania, zaczynając od ekstrakcji, pomiaru powierzchni przekroju poprzecznego, płukania, aż po umieszczenie próbek w komorze bioreaktora.

Przygotowanie ścięgien ogonowych szczura do badań biomechanicznych i mechanobiologicznych

Opisano model zwierzęcy urazu in vivo. Metoda wykorzystuje podskórne położenie nerwu strzałkowego. Prędkość, czas aktywacji mięśni oraz łuk ruchu są wcześniej określone i zsynchronizowane przy użyciu komercyjnego oprogramowania. Zmiany po urazie są monitorowane in vivo za pomocą obrazowania/spektroskopii MR.

Model gryzoni in vivo w urazie wywołanym przykurczem i nieinwazyjne monitorowanie powrotu do sprawności

Zaprojektowaliśmy nowatorski bioreaktor obciążenia mechanicznego, który może zastosować jednoosiowe lub dwuosiowe naprężenie mechaniczne do biokompozytu chrząstki przed przeszczepem do ubytku chrząstki stawowej.

Projekt dwuosiowego bioreaktora obciążenia mechanicznego dla inżynierii tkankowej

Nowatorski protokół obrazowania został opracowany przy użyciu niestandardowego mechanicznego siłownika napędzanego silnikiem, aby umożliwić pomiar reakcji w czasie rzeczywistym na mechaniczne naprężenia w żywych komórkach. Istotny z punktu widzenia mechanobiologii system może nanosić szczepy do 20%, umożliwiając jednocześnie obrazowanie w czasie zbliżonym do rzeczywistego za pomocą mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii sił atomowych.

Obrazowanie żywych komórek podczas rozciągania mechanicznego

Opisujemy protokół in vivo do pomiaru zgięcia grzbietowego stopy po stymulacji nerwu strzałkowego i skurczu przedniego przedziału podudniowego kończyny tylnej szczura. Takie pomiary są niezastąpionym narzędziem translacyjnym do oceny patologii mięśni szkieletowych i podejść inżynierii tkankowej do naprawy i regeneracji mięśni.

Zastosowania testów funkcjonalnych in vivo kości piszczelowej szczura przedniego do oceny naprawy mięśni szkieletowych za pomocą inżynierii tkankowej

Protokół opisuje skuteczne i powtarzalne metody testowania biomechanicznego rozciągania ścięgien mysich za pomocą specjalnie dopasowanych uchwytów drukowanych w 3D.

Badania biomechaniczne ścięgien myszy

Trójwymiarowy jednoosiowy system bioreaktora do stymulacji mechanicznej jest idealnym bioreaktorem do specyficznego dla tenogenicznego różnicowania komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien i tworzenia neościęgien.

Zastosowanie trójwymiarowego, jednoosiowego bioreaktora do stymulacji mechanicznej w celu indukowania różnicowania tenogennego komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien

Ten artykuł opisuje algorytm korelacji obrazów cyfrowych o otwartym kodzie źródłowym do pomiaru lokalnych szczepów tkanek 2D w eksplantatach ścięgien. Dokładność tej techniki została zweryfikowana przy użyciu wielu technik i jest ona dostępna do użytku publicznego.

Pomiar lokalnych naprężeń tkanek w ścięgnach za pomocą cyfrowej korelacji obrazu o otwartym kodzie źródłowym

Prezentujemy niestandardową platformę eksperymentalną i protokół hodowli tkankowej, który odtwarza zmiany włóknisto-chrzęstne wywołane uderzeniem przyczepu ścięgna Achillesa w eksplantatach mysich kończyn tylnych o trwałej żywotności komórek, dostarczając model odpowiedni do badania mechanobiologii uderzeń ścięgien.

Mysi model eksplantatu kończyn tylnych do badania mechanobiologii uderzenia ścięgna Achillesa

Ten protokół przedstawia system testowy używany do wywoływania mierzalnych i kontrolowanych urazów zmęczeniowych u ścięgna Achillesa u szczura dla modelu in vivo tendinopatii wywołanej nadużywaniem. Procedura polega na przymocowaniu kostki szczura do siłownika stawu, który wykonuje pasywne zgięcie grzbietowe kostki za pomocą specjalnie napisanego skryptu MATLAB.

Pasywny system do testowania zgięcia grzbietowego stawu skokowego dla modelu in vivo tendinopatii wywołanej przeciążeniem

Tutaj prezentujemy system modeli assembloid, który naśladuje przesłuch komórkowy ścięgien między tkanką rdzenia ścięgna nośnego a zewnętrznym przedziałem zawierającym populacje komórek aktywowane przez chorobę i uraz. Jako ważny przypadek użycia pokazujemy, w jaki sposób system może zostać wykorzystany do badania istotnej z chorobą aktywacji zewnętrznych komórek śródbłonka.

Inżynieria asembloidów ścięgien do badania przesłuchów komórkowych w chorobach i naprawach

Poznaj metodę mechanicznego obciążania ścięgien ex vivo w układzie in vitro umożliwiającym jednoczesne testowanie czterech próbek. Technika ta pozwala badać mechanizmy chorób ścięgien nadgarstka i łokcia.

Mechaniczne obciążanie ścięgna ex vivo

Przeglądaj więcej filmów