Mechaniczne obciążanie ścięgna ex vivo

Nazywam się David Rempel. Jestem wykładowcą w Departamencie Bioinżynierii na Uniwersytecie Kalifornijskim w Berkeley. Eksperyment, który Państwo zobaczą, polega na rozciąganiu ścięgien, a jego celem jest próba wyjaśnienia i zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw zaburzeń ścięgien w obrębie nadgarstka i łokcia.

Zaburzenia ścięgien są powszechne wśród sportowców oraz pracowników wykonujących powtarzalne czynności manualne. Krish Sundi, jeden z doktorantów w naszym laboratorium, zaprezentuje kilka funkcji systemu, a konkretnie pomiar pola przekroju poprzecznego ścięgna. Następnie umieści ścięgna w siłownikach.

Zaprezentuje on system cyklicznego obciążania ścięgna w okresie 24 godzin, a następnie usunie ścięgno z systemu. Dobrze, oto zaprojektowany i zbudowany przez nas system obciążania. Jak widać, składa się on z sześciu siłowników.

Są to siłowniki o wysokiej precyzji, zdolne do wywierania przemieszczenia rzędu jednego mikrometra; szeregowo z siłownikiem połączona jest ogniwo tensometryczne służące do rejestrowania obciążeń przyłożonych do ścięgien. Szeregowo z ogniwem tensometrycznym znajdują się zaciski, które są wystarczająco długie, aby można było je zanurzyć w medium w celu utrzymania żywotności ścięgien. Cały system ten należy następnie umieścić w kąpieli wodnej, aby utrzymać temperaturę medium na poziomie 37 °C.

Teraz pokażę Państwu, w jaki sposób zamocowałbym ścięgno w tym systemie. Pierwszym krokiem, który musimy wykonać, jest pomiar powierzchni przekroju poprzecznego ścięgna, abyśmy mogli zastosować odpowiednie naprężenia. Czy możesz podać mi probówkę ze ścięgnem?

Niniejsze ścięgna zostały pobrane od nowozelandzkiego królika białego. Zostały one dostarczone przed chwilą, zatem są wciąż świeże, a od eutanazji królika minęło mniej niż dwie godziny. Odcinek ścięgna, którego pole przekroju mierzę, znajduje się w jego najcieńszej części.

Dzieje się tak, ponieważ w tym miejscu wystąpią największe naprężenia, wynikające z najmniejszego pola przekroju poprzecznego. Czy możesz teraz położyć ciężarek na tłoku? Teraz odczekujemy 30 sekund, aby odczytać grubość 1.3.

Czy możesz podnieść tłok i umieścić ścięgno z powrotem w medium? Teraz zdemontuję siłownik, w którym zamocuję ścięgno. Następnie zamocuję ścięgno w zaciskach.

Tutaj możemy zobaczyć zbliżenie siłownika. Widoczny jest sam siłownik, przetwornik siły oraz zaciski, które rozszerzają się na zewnątrz. Podkładki te powinny mieć szerokość około 0,5 do 0,75 cala i długość około 1,5 cala.

Następnie należy wziąć gaziki i zanurzyć je w pożywce, aby je nawilżyć. Ułatwi to proces rolowania. Tak zwinięte paski gazy należy umieścić w rowkach zacisków serpentynowych. Teraz wyjmę ścięgno z pożywki.

Ten koniec stanowi miejsce przyczepu ścięgna mięśnia zginacza do końca palca królika. Ten obszar tutaj to region chrząstki włóknistej. Ścięgno jest umieszczone w taki sposób, aby region chrząstki włóknistej został zaciśnięty w zacisku proksymalnym.

Następnie zaciskany jest ścięgno, a śruby ponownie dokręcane są z siłą 1 N·m. Potem odcinany jest nadmiar ścięgna, dzięki czemu siłownik zostaje unieruchomiony w uchwycie, a całe ścięgno wraz z zaciskami zostają zanurzone w zmodyfikowanym medium. Tę samą procedurę należy zastosować w celu zamocowania ścięgien w kolejnych siłownikach.

Jak widać, mamy łącznie sześć sztuk, więc możemy przeprowadzić to badanie na sześciu oddzielnych ścięgnach. Cały układ zostaje następnie podniesiony i umieszczony w kąpieli wodnej, aby utrzymać temperaturę medium na poziomie 37°C. Teraz zastosujemy do ścięgna obciążenie cykliczne w zakresie od 0.5 do 5 MPa.

Używane przez nas oprogramowanie to LabVIEW, napisane na specjalne zamówienie. W pierwszej kolejności przeprowadzamy kondycjonowanie ścięgna. Przykładamy 20 cykli obciążenia cyklicznego w zakresie od 0,5 megapascals do dwóch megapascals.

Zmierzoną grubość wprowadź za pomocą czterech dostarczonych mikrometrów. Program automatycznie obliczy pole przekroju poprzecznego, a następnie wyda polecenie do siłownika, aby zwiększał przemieszczenie, aż do momentu przyłożenia do ścięgna obciążenia wynoszącego 2 MPa.

W tym przypadku śledzimy fioletową linię. Po przyłożeniu do ścięgna obciążenia wynoszącego 2 megapascal, program przyłoży do ścięgna obciążenie 0,5 megapascal. Gdy oba te obciążenia zostaną osiągnięte, program będzie cyklicznie przełączać się między nimi, stale aktualizując pozycję pomiędzy tymi dwoma żądanymi wartościami obciążenia.

Obciążanie to jest przeprowadzane z prędkością 10 megapascals na sekundę przy częstotliwości 0,5 hertz. Po wstępnym warunkowaniu ścięgna dążymy do uzyskania obciążenia rzędu 0,5 newton. Długość ścięgna pod obciążeniem 0,5 Newton definiujemy jako długość pomiarową ścięgna.

Gdy program wykryje to obciążenie, odczytujemy pozycję siłownika; aktualna wartość, wynosząca sześć osiemset dwadzieścia pięć, stanowi długość pomiarową ścięgna. Po zarejestrowaniu długości pomiarowej ścięgna wracamy do programu obciążeń cyklicznych, wprowadzamy pożądane wartości 5 MPa oraz 0,5 MPa, podajemy całkowitą liczbę cykli, do której chcemy poddać próbkę obciążeniu, a następnie ponownie uruchamiamy ten sam program, aby cyklicznie obciążać ścięgno w zakresie od 0,5 do 5 MPa. Obciążanie to odbywa się z prędkością 10 MPa/s przy częstotliwości 0,5 Hz.

Po poddaniu cyklicznemu obciążeniu, zazwyczaj przez 24 godziny, siłownik zostaje usunięty z systemu, po czym ścięgno można odciąć i przetworzyć w pożądany sposób. Właśnie zaprezentowaliśmy nasze ścięgna, które zostały pobrane sterylnie od królików. Przedstawiony proces był procesem półsterylnym, jednak doprowadził on do cyklicznego obciążania ścięgien w okresie 24 godzin.

Następnie ścięgna są analizowane za pomocą R-T-P-C-R w celu oceny ekspresji genów. Analizujemy również ścięgna pod kątem innych zmian, w tym zmian strukturalnych oraz innych markerów histologicznych. Ostatecznym celem tego eksperymentu jest ustalenie, jaki wpływ mają różne wzorce obciążenia na podstawowe mechanizmy urazów ścięgien, które mogą być powiązane z tendinopatiami i zapaleniem ścięgien.