Name: Podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w świeżych skrawkach mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Poznaj podwójną fluorescencyjną hybrydyzację in situ w świeżych skrawkach mózgu do jednoczesnej detekcji dwóch transkryptów mRNA w rozdzielczości pojedynczych komórek. Ta metoda pozwala badać ekspresję genów w neuronach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca finansowana z grantów NIH/NIDCD oraz Fundacji Schmitt dla RP.

Niniejszy protokół został opracowany i dopracowany na podstawie standardowych radiacyjnych i nieradiacyjnych metod hybrydyzacji in-situ, wcześniej opracowanych przez nas oraz innych autorów w celu wykrywania jednego lub dwóch gatunków transkryptów w tkance mózgowej 1-7. Opisany poniżej protokół trwa łącznie 2 lub 3 dni, w zależności od liczby przerw proceduralnych wybranych przez użytkownika końcowego. Wszystkie szczegółowo opisane poniżej etapy należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej, z wyjątkiem etapu hybrydyzacji sondy ryboprobowej oraz przemywań po hybrydyzacji. Roztwory i bufory wymagane do wszystkich etapów tej metody znajdują się na końcu niniejszego protokołu.
1. Przygotowanie i krojenie tkanek
<ol>
 <li>Należy szybko przeprowadzić dekapitację i wyekstrahować mózg obiektu, a następnie umieścić go w plastikowej formie o odpowiednim rozmiarze.</li>
 <li>Przykryć mózg medium do zatapiania Tissue-Tek i szybko umieścić plastikową formę w kąpieli z suchego lodu i alkoholu w celu szybkiego zamrożenia. Zamrożoną tkankę można przechowywać w temperaturze -80°C do momentu użycia.</li>
 <li>Za pomocą kriosztatu nanieść 2 lub 3 przekroje mózgu na jeden naładowany szkiełko Superfrost Plus. Grubość przekrojów powinna wynosić 10-12 μmPreparaty mogą być przechowywane w temperaturze -80°C do momentu użycia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kolumn Sephadex G50 do oczyszczania sond
„Kolumny Sephadex można nabyć z komercyjnych źródeł, jednak poniżej przedstawiamy niskokosztową alternatywę dla przygotowania kolumn, które będą niezbędne do oczyszczania sond”.
<ol>
 <li>Nawilżyć odpowiednią ilość proszku Sephadex G50 wodą wolną od RNaz, traktowaną DEPC (na przykład 2 g proszku w 10 ml wody traktowanej DEPC), krótko wymieszać roztwór i przechowywać w temperaturze pokojowej, aby wytrącić nadmiar Sephadex G50.</li>
 <li>Usunąć nadsącz (górną warstwę wody) po wytrąceniu Sephadex G50.</li>
 <li>Powtórzyć powyższy proces 3-5 razy.</li>
 <li>Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić roztwór Sephadex G50 w buforze TE (w stosunku 1:1) i przechowywać w temperaturze 4°C do momentu użycia.</li>
 <li>Umieścić autoklawowaną watę szklaną w sterylnej strzykawce 1 ml i ścisnąć ją tłokiem, aby utworzyć zwartą warstwę na dnie, a następnie umieścić strzykawkę w probówce Falcon 15 ml.</li>
 <li>Dokładnie wymieszać roztwór Sephadex G50 w buforze TE. Wypełnić strzykawkę/kolumnę tym roztworem.</li>
 <li>Wirurować kolumnę przez 30 sec przy 10 rpm.</li>
 <li>Powtarzać tę procedurę, aż kolumna zostanie niemal całkowicie wypełniona granulkami Sephadex G50.</li>
 <li>Nanieść na kolumnę 20 μl buforu do płukania kolumny i wirować przez 2 min przy 100 rpm. Odrzucić przefiltrowany płyn.</li>
 <li>Nanieść na kolumnę 20 μl buforu blokującego kolumnę i wirować przez 2 min przy 10 rpm. Powtórzyć ten krok 4-5 razy, aby zrównoważyć kolumnę. Kolumny można przechowywać w temperaturze 4°C do momentu użycia, jeśli zostaną uszczelnione Parafilmem.</li>
</ol>
3. Labellowanie i oczyszczanie ryboprob
Poniżej szczegółowo opisano generowanie i oczyszczanie pojedynczej sondy rybonukleotydowej (riboproby). W przypadku dFISH przygotowanie każdej sondy będzie przebiegać według tej samej metodologii, z wyjątkiem tego, że jedna z sond zostanie znakowana UTP z digoksygeniną (DIG), a druga UTP z biotyną.
<ol>
 <li>Przygotuj stężony (> 150 ng/μl) i oczyszczony roztwór zlinearyzowanego cDNA, aby wygenerować sondy ryboprobowe typu sens (kontrolne) lub antysens.</li>
 <li>Do probówki mikroodśrodkowej o pojemności 1,5 ml dodaj 0,5-1 μg oczyszczonej matrycy cDNA, 2 μl buforu do znakowania sondy 5X, 1 μl mieszanki do znakowania DIG (lub biotyny) 10X, 0,5 μl RNasiny oraz 1 μl odpowiedniej polimerazy RNA, a następnie uzupełnij objętość końcową roztworu do 10 μl wodą wolną od RNaz (traktowaną DEPC).</li>
 <li>Inkubuj roztwór w łaźni wodnej w temperaturze 37°C przez 2 h.</li>
 <li>Dodaj do roztworu 1 μl tRNA (stok; 20 μg/μl) oraz 39 μl buforu blokującego kolumnę.</li>
 <li>Przygotuj kolumnę Sephadex G50 do oczyszczania sondy. W tym celu dodaj do kolumny 50 μl buforu blokującego i wiruj przez 10 s przy 10 rpm. 
 Powtórz ten krok 2-3 razy, aby zrównoważyć kolumnę (tj. do momentu, gdy pełna objętość 50 μl naniesiona na kolumnę zostanie odzyskana po cyklu wirowania).</li>
 <li>Nanieś roztwór sondy na kolumnę Sephadex G50, umieść nową probówkę mikroodśrodkową u podstawy kolumny i wiruj przez 3 min przy 10 rpm, aby otrzymać 50 μl oczyszczonego roztworu ryboproby.</li>
 <li>Oceń jakość i wydajność znakowanej ryboproby, używając standardowego żelu RNA agaroza-formaldehyd lub spektrofotometru.</li>
</ol>
4. Postfiksacja, acetylacja i hybrydyzacja
<ol>
 <li>Wyjmij skrawki z zamrażarki -80°C i pozostaw je do wyrównania temperatury do temperatury pokojowej. Następnie inkubuj skrawki w zimnym, świeżo przygotowanym 3% roztworze paraformaldehydu przez 5 min.</li>
 <li>Krótko przemyj skrawki dwukrotnie w roztworze solistropowej PBS.</li>
 <li>Odwodnij skrawki w standardowej serii alkoholi (70%, 95% i 10%; po 2 min w każdym), a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.</li>
 <li>Inkubuj skrawki w roztworze acetylującym przez 10 min.</li>
 <li>Przemyj skrawki 3 razy w 2X SSPE.</li>
 <li>Ponownie odwodnij skrawki w opisanej powyżej standardowej serii alkoholi i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.</li>
 <li>Przygotuj odpowiednią objętość roztworu do hybrydyzacji i dodaj do niego obie sondy rybowe (stężenie sondy: 1 ng/μl dla każdej sondy). Całkowita objętość roztworu do hybrydyzacji jest określana na podstawie liczby skrawków do hybrydyzacji (16 μl roztworu do hybrydyzacji na skrawek).</li>
 <li>Nanieś odpowiednią objętość roztworu do hybrydyzacji na tkankę oraz szkiełka nakrywkowe, upewniając się, że na tkance nie pozostały pęcherzyki powietrza.</li>
 <li>Umieść szkiełka w metalowym uchwycie. Zanurz uchwyt w kąpieli olejowej z oleju mineralnego w temperaturze 65°C na noc. Upewnij się, że szkiełka nakrywkowe są skierowane do góry (tj. boczna część uchwytu do szkiełek powinna stykać się z dnem pojemnika z olejem mineralnym).</li>
</ol>
5. Przemywanie po hybrydyzacji
<ol>
 <li>Następnego dnia ostrożnie wyjmij uchwyt do szkiełek z kąpieli w oleju mineralnym i krótko opłucz go w chloroformie, aby usunąć nadmiar oleju z szkiełek.</li>
 <li>Umieść szkiełka w roztworze 2X SSPE na 5-10 min. Szkiełka coverlips powinny oddzielić się od szkiełek przedmiotowych podczas przebywania w roztworze.</li>
 <li>Przenieś szkiełka do nowego roztworu 2X SSPE i pozostaw je na 1 hr w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przenieś skrawki do roztworu zawierającego 2X SSPE oraz 50% formamid. Temperatura tego roztworu powinna odpowiadać temperaturze zastosowanej w nocnej procedurze hybrydyzacji. Pozostaw szkiełka w tym roztworze na 1,5 hr.</li>
 <li>Przenieś skrawki do roztworu 0,1X SSPE uprzednio podgrzanego do temperatury stosowanej na etapie hybrydyzacji. Inkubuj skrawki w tym roztworze przez 30 min. Powtórz ten krok przez kolejne 30 min.</li>
</ol>
6. Detekcja i wizualizacja ryboprobes
<ol>
 <li>Przenieś preparaty na szkiełkach do buforu TNT z dodatkiem 0,3% nadtlenku wodoru na 10 min.</li>
 <li>Przemyj skrawki w buforze TNT, 3 razy (po 10 min każde płukanie).</li>
 <li>Używając pisaka DAKO, obrysuj obszar zawierający skrawki mózgu, tworząc wgłębienie. Należy zachować szczególną ostrożność, aby skrawki nie wyschły.</li>
 <li>Nanieś 150 μl buforu TNB na każde szkiełko i inkubuj skrawki w tym roztworze przez 30 min w komorze wilgotnej.</li>
 <li>Usuń nadmiar roztworu TNB, przechylając szkiełka.</li>
 <li>Nanieś 150 μl roztworu TNB zawierającego przeciwciało anty-DIG sprzężone z peroksydazą i przechowuj szkiełka w komorze wilgotnej przez 2 h. Stężenie przeciwciał powinno zostać określone indywidualnie dla każdego badanego transkryptu przed przeprowadzeniem dFISH.</li>
 <li>Przemyj skrawki w buforze TNT; 3 razy, po 10 min każde płukanie.</li>
 <li>Nanieś 150 μl gotowego roztworu tyramidu sprzężonego z Alexa 594 na każde szkiełko i przechowuj je w komorze wilgotnej przez 1 h. Roztwór ten należy przygotować zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
 <li>Przemyj skrawki w buforze TNT; 3 razy, po 10 min każde płukanie.</li>
 <li>Inkubuj skrawki w buforze TNT z dodatkiem 0,3% nadtlenku wodoru przez 10-30 min.</li>
 <li>Przemyj skrawki w buforze TNT; 3 razy, po 10 min każde płukanie.</li>
 <li>Nanieś 150 μl buforu TNB na każde szkiełko i przechowuj je w komorze wilgotnej przez 30 min.</li>
 <li>Usuń nadmiar roztworu TNB, przechylając szkiełka.</li>
 <li>Dodaj 150 μl roztworu TNB zawierającego przeciwciało anty-biotynowe sprzężone z peroksydazą i przechowuj szkiełka w komorze wilgotnej przez 2 h.</li>
 <li>Przemyj skrawki w buforze TNT; 3 razy, po 10 min każde płukanie.</li>
 <li>Nanieś na szkiełka 150 μl gotowego roztworu tyramidu sprzężonego z Alexa 488 i inkubuj skrawki przez 1 h. Roztwór ten należy przygotować zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
 <li>Przemyj skrawki w buforze TNT; 3 razy, po 10 min każde płukanie.</li>
 <li>Dodaj do skrawków 150 μl roztworu Hoechst (1:10 w buforze TNT) i przechowuj je w komorze wilgotnej przez 2 min.</li>
 <li>Przemyj skrawki w buforze TNT; 3 razy, po 5 min każde płukanie.</li>
 <li>Przykryj skrawki szkiełkiem podstawowym, stosując medium montażowe kompatybilne z fluorescencją (np. Vectashield lub ProLong antifade).</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2102/2102fig1.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające wzorce ekspresji białek; zielone i czerwone markery w komórkach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. Prezentujemy tutaj reprezentatywne wyniki dFISH uzyskane w mózgu zebry fincza. Przedstawiono mikrofotografie wykonane w obrębie przyśrodkowo-guzowej części nidopallium (NCM), która jest odpowiednikiem kory słuchowej ssaków u ptaków śpiewających. Przekroje mózgu poddano hybrydyzacji z biotynylowaną sondą ryboprobową skierowaną przeciwko parwalbuminie (A), będącej markerem dla subpopulacji neuronów hamujących, oraz sondą ryboprobową znakowaną DIG skierowaną przeciwko genowi zenk (B), zależnemu od aktywności i będącemu wiarygodnym markerem neuronów aktywowanych przez śpiew. C) Nałożenie obrazów (A) i (B) ukazuje populację neuronów hamujących, które są aktywowane przez doświadczenia słuchowe. Strzałki i groty strzałek wskazują komórki znakowane wyłącznie każdą z dwóch sond ryboprobowych, a gwiazdki wskazują reprezentatywne neurony koekspresujące oba badane transkrypty. Pasek skali = 25 μm.

<ol><li>Jin, L., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Lab+Anal%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: methods and applications.</a> J Clin Lab Anal. 11, 2-9 (1997).</li>
<li>Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization.</a> Clin Lab Med. 10, 215-236 (1990).</li>
<li>Komminoth, P., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+and+signal+amplification%3A+approaches+to+increase+the+sensitivity+of+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22+Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Target and signal amplification: approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization.</a> Histochem Cell Biol. 108, 325-3233 (1997).</li>
<li>Kessler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digoxigenin%3Aanti-digoxigenin+%28DIG%29+technology--a+survey+on+the+concept+and+realization+of+a+novel+bioanalytical+indicator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Probes%22%5BJournal%5D)">The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology--a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system.</a> Mol Cell Probes. 5, 161-205 (1991).</li>
<li>Panoskaltsis-Mortari, A., Bucy, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+with+digoxigenin-labeled+RNA+probes%3A+facts+and+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization with digoxigenin-labeled RNA probes: facts and artifacts.</a> Biotechniques. 18, 300-307 (1995).</li>
<li>Qian, X., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+signal+amplification+methods+for+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Recent developments in signal amplification methods for in situ hybridization.</a> Diagn Mol Pathol. 12, 1-13 (2003).</li>
<li>Mello, C. V., Jarvis, E. D., Denisenko, N., Rivas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+song-regulated+genes+in+the+brain+of+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of song-regulated genes in the brain of songbirds.</a> Methods Mol Biol. 85, 205-217 (1997).</li>
<li>Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+participate+in+the+brain%27s+response+to+birdsong+auditory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons participate in the brain's response to birdsong auditory stimulation.</a> Eur J Neurosci. 20, 1318-1330 (2004).</li>
<li>Velho, T. A., Pinaud, R., Rodrigues, P. V., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-induction+of+activity-dependent+genes+in+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Co-induction of activity-dependent genes in songbirds.</a> Eur J Neurosci. 22, 1667-1678 (2005).</li>
<li>Tremere, L. A., Jeong, J. K., Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+shapes+auditory+processing+in+the+adult+brain+by+regulating+inhibitory+transmission+and+plasticity-associated+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estradiol shapes auditory processing in the adult brain by regulating inhibitory transmission and plasticity-associated gene expression.</a> J Neurosci. 29, 5949-5963 (2009).</li>
<li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li>
<li>Pinaud, R., Jeong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplex+fluorescence+in+situ+hybridization+in+the+study+of+gene+co-regulation+in+the+vertebrate+brain.+Methods+Mol+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol.</a> 611, 115-129 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Niniejszy protokół wykorzystaliśmy do badania organizacji neurochemicznej i funkcjonalnej mózgu kręgowców oraz do określenia, w jaki sposób istotne behawioralnie bodźce sensoryczne wpływają na mechanizmy genomiczne neuronów w dorosłym mózgu 8-10. Z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę w tkance mózgowej myszy, szczurów i ptaków śpiewających, lecz przewidujemy, że protokół ten będzie łatwy do adaptacji w przypadku przekrojów mózgu uzyskanych z wielu gatunków kręgowców, a być może także z tkanek pozaneuralnych. K...

<table><tbody><tr><td>DEPC</td><td>VWR international</td><td>IC15090225</td><td>substancja toksyczna</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania produktów PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>VWR international</td><td>BDH0506-4LP</td><td>substancja toksyczna</td></tr><tr><td>polimeraza RNA T3</td><td>Grupa Roche</td><td>11031163001</td><td></td></tr><tr><td>polimeraza RNA T7</td><td>Grupa Roche</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 7,5)</td><td>VWR international</td><td>IC816124</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449172</td><td></td></tr><tr><td>Spermidyna (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>mieszanina do znakowania RNA DIG</td><td>Grupa Roche</td><td>NC9380805</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina do znakowania RNA biotyną</td><td>Grupa Roche</td><td>NC9440104</td><td></td></tr><tr><td>RNazina</td><td>Promega Corp.</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05491</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5545</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G50</td><td>VWR international</td><td>95016-772</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>VWR international</td><td>101384-758</td><td></td></tr><tr><td>Karta charakterystyki bezpieczeństwa (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (transferowy RNA)</td><td>Invitrogen</td><td>15401011</td><td></td></tr><tr><td>10X MOPS</td><td>VWR international</td><td>14221-398</td><td>substancja toksyczna</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>VWR international</td><td>AAAL04737-36</td><td>substancja toksyczna</td></tr><tr><td>Wodorofosforan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>VWR International</td><td>SX0600-1</td><td></td></tr><tr><td>Trietanoloamina</td><td>VWR international</td><td>IC15216391</td><td></td></tr><tr><td>Bezwieciek octowy</td><td>VWR international</td><td>MK242002</td><td>substancja toksyczna</td></tr><tr><td>podostre stwardniające zapalenie panencefalit</td><td>VWR International</td><td>82021-488</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>VWR international</td><td>JT4028-1</td><td>substancja toksyczna</td></tr><tr><td>Poly A</td><td>Invitrogen</td><td>POLYA.GF</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>VWR international</td><td>IC15169491</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR international</td><td>BDH1109</td><td>rozpuszczalnik organiczny</td></tr><tr><td>Dejonizowany formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td>substancja toksyczna</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>VWR international</td><td>VW36901</td><td>substancja toksyczna</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>JT Baker</td><td>X198-05</td><td></td></tr><tr><td>anty-DIG HRP</td><td>Grupa Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało antybiotynowe z peroksydazą</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP3010</td><td></td></tr><tr><td>TSA Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>T20935</td><td></td></tr><tr><td>TSA Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>T20932</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst</td><td>VWR International</td><td>200025-538</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>forma do zatapiania</td><td>VWR international</td><td>15160-157</td><td></td></tr><tr><td>kriostat</td><td>Leica Microsystems</td><td>CM 1850</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko Superfrost plus</td><td>VWR international</td><td>89033-052</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Roztwory&lt;/p&gt;&lt;ol&gt;&lt;li&gt;Bufor do płukania kolumny: 10 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05 mM EDTA, 50 &amp;#x03BC;g/&amp;#x03BC;l tRNA, 0,1% SDS w 50 ml wody traktowanej DEPC.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Bufor blokujący kolumnę: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA w 50 ml wody traktowanej DEPC.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Bufor TNT: 60 ml 1 M Tris-HCl, 18 ml 5 M NaCl oraz 1,8 ml Triton X-100 w 600 ml wody traktowanej DEPC.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;bufor TNB: 100 mM Tris-HCl, 8,3 &amp;#x03BC;g/&amp;#x03BC;1% BSA, 0,15 M NaCl i 3% Triton X-100 w wodzie traktowanej DEPC.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;bufor TE: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 oraz 1 mM EDTA, pH 7,5.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Roztwór do acetylacji: 2,7 ml trietanolaminy oraz 0,5 ml bezwodnika octowego w 200 ml wody traktowanej DEPC.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Roztwór do hybrydyzacji: 50% formamid, 2X SSPE, 2 &amp;#x03BC;g/&amp;#x03BC;tRNA-l, 1 &amp;#x03BC;g/&amp;#x03BC;l BSA i 1 &amp;#x03BC;g/&amp;#x03BC;16 $\mu$l poly A w wodzie traktowanej DEPC. Na każdą sekcję wymagane jest 16 $\mu$l.&lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w świeżych przekrojach mózgu

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

W niniejszej pracy opisujemy zmodyfikowaną wersję podwójnej fluorescencjiin situmetoda hybrydyzacji (dFISH) zoptymalizowana pod kątem wykrywania dwóch wybranych mRNA w świeżych mrożonych przekrojach mózgu. Nasz zespół z sukcesem zastosował to podejście do badania koregulacji genów. Bardziej szczegółowo, metoda dFISH została przez nas wykorzystana do badania organizacji anatomicznej, właściwości neurochemicznych oraz wpływu doświadczeń sensorycznych w ośrodkowych obwodach sensorycznych z rozdzielczością pojedynczych komórek. Protokół ten został zwalidowany w tkance mózgowej myszy, szczurów i ptaków śpiewających, jednak można go łatwo dostosować do innych gatunków kręgowców, a także do wielu rodzajów tkanek pozanerwowych. W tym filmie przedstawiamy szczegółową demonstrację głównych etapów tej procedury.

Niniejszy protokół opisuje niepromienną procedurę hybrydyzacji in-situ, która umożliwia jednoczesną identyfikację dwóch gatunków transkryptów z rozdzielczością pojedynczych komórek w cienkich przekrojach mózgu kręgowców.

Podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w świeżych przekrojach mózgu

W niniejszym opracowaniu opisujemy zmodyfikowaną wersję metody podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (dFISH), zoptymalizowaną pod kątem wykrywania dwóch wybranych cząsteczek mRNA w świeżym...

Witajcie, jestem JA, pracownik naukowy na stopniu postdoc w laboratorium AL na Uniwersytecie w Rochester. Przedstawimy Państwu metodę hybrydowego trawienia w świeżo zamrożonych sekcjach mózgu w celu jednoczesnego wykrycia dwóch transkryptów mRNA z rozdzielczością pojedynczych komórek. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na pytania z dziedziny neuronauki, takie jak te dotyczące anatomicznej, funkcjonalnej, molekularnej i neurochemicznej organizacji określonego obwodu mózgowego.Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat koagulacji genów w neuronach mózgu AV, można ją również zastosować w innych układach, takich jak gryzonie, a także w różnych tkankach nerwowych. Aby rozpocząć tę procedurę, należy nawodnić odpowiednią ilość proszku SDX G 50 z RNA za pomocą wody.Krótko wymieszaj roztwór i przechowuj w temperaturze pokojowej od dwóch do pięciu minut. Krok ten oddziela kuleczki SDX od dekstrozy znajdującej się w komercyjnym proszku sedex po wytrącaniu Sedex G 50. Usuń nadsącz i powtórz proces od trzech do pięciu razy; po ostatnim przemyciu ponownie zawieś roztwór SX G 50 w buforze TE w stosunku objętości buforu do kuleczek jeden do jednego i przechowuj w temperaturze 4 °C do moment

double-fluorescence-in-situ-hybridization-in-fresh-brain-sections

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Podwójna fluorescencja in situ hybrydyzacji w świeżych sekcjach mózgu

Źródło: Jolly, S., et.al. Połączenie podwójnej fluorescencji  hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w sekcjach mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2016). Ten film demonstruje zastosowanie hybrydyzacji in situ z podwójną fluorescencją do wizualizacji ekspresji dwóch celów RNA w sekcjach mózgu myszy. Protokół obejmuje sekwencyjne wykrywanie RNA za pomocą sond znakowanych izotiocyjanianem fluoresceiny i digoksygeniną, a następnie enzymatyczne wzmacnianie sygnału w...

 Wykonywanie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ w celu wykrycia ekspresji genów w skrawkach mózgu myszy

Źródło: Baleriola, J.,  et. al., Wykrywanie aksonalnie zlokalizowanych mRNA w sekcjach mózgu przy użyciu hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości.  J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje wykrywanie mRNA w aksonach cholinergicznych w utrwalonych mysich wycinkach hipokampa przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i barwienia przeciwciałami. Mikroskopia fluorescencyjna ujawnia przestrzenną lokalizację znakowanych sondą mRNA i acetylotransferazy choliny w neuronach cholinergicznych.

Barwienie immunologiczne neuronów w wycinkach mózgu myszy po fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Hybrydyzacja in situ (ISH) RNA umożliwia wizualizację RNA w komórkach i tkankach. Tutaj pokazujemy, jak połączenie RNAscope ISH z immunohistochemią lub barwnikami histologicznymi może być z powodzeniem wykorzystane do wykrywania mRNA zlokalizowanych na aksonach w odcinkach mózgu myszy i człowieka.

Wykrywanie aksonalnie zlokalizowanych mRNA w skrawkach mózgu za pomocą hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak specyficznie transfekować różne regiony w ośrodkowym układzie nerwowym C57BL/6 za pomocą elektroporacji in utero. W tym protokole zawarte są szczegółowe instrukcje dotyczące transfekcji regionów, które rozwijają się w korę, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i prążkowie.

Kora mózgowa, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i jądro prążkowia specyficzne dla macicy elektroporacja u myszy C57BL/6

Lokalizacja ekspresji genów w określonych typach komórek może być trudna ze względu na brak specyficznych przeciwciał. W tym miejscu opisujemy protokół jednoczesnego potrójnego wykrywania ekspresji genów poprzez połączenie hybrydyzacji in situ RNA z podwójną fluorescencją z barwieniem immunologicznym.

Połączenie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w wycinkach mózgu myszy

Tutaj oferujemy łatwy, tani i efektywny czasowo protokół chemicznego utrwalania tkanki mózgowej naczelnych za pomocą utrwalacza akroleiny, co pozwala na długoterminową konserwację, która jest zgodna z immunohistochemią dla transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Przygotowanie tkanki mózgowej naczelnych innych niż ludzie do wstępnego zatopienia immunohistochemii i mikroskopii elektronowej

Technika swobodnego pływania pozwala badaczom na wykonywanie barwień histologicznych, w tym immunohistochemii na stałych odcinkach tkanki, w celu wizualizacji struktur biologicznych, typu komórki oraz ekspresji i lokalizacji białek. Jest to wydajna i niezawodna technika histochemiczna, która może być przydatna do badania wielu tkanek, takich jak mózg, serce i wątroba.

Barwienia histologiczne z wykorzystaniem swobodnie unoszących się skrawków tkanek

Ten protokół opisuje metodę łączenia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i immunohistochemii fluorescencji (IHC) zarówno w świeżo mrożonych, jak i stałych sekcjach mózgu myszy, w celu uzyskania wieloznakowego sygnału FISH i fluorescencji IHC. IHC celował w białka cytoplazmatyczne i przyłączone do błony.

Połączenie hybrydyzacji fluorescencji in situ multipleksowej z immunohistochemią fluorescencyjną na świeżo zamrożonych lub utrwalonych wycinkach mózgu myszy

Iteracyjna hybrydyzacja in situ wspomagana ekspansją (EASI-FISH) to solidna technika, która łączy mikroskopię ekspansywną z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu wykrycia ekspresji wielu genów w grubej tkance. Protokół ten przedstawia ostatnie postępy w metodzie i jej adaptacji do znakowania nienaruszonego ośrodkowego układu nerwowego Drosophila.

Multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją

To badanie przedstawia uproszczony protokół przetwarzania tkanek obejmujący dekapitację, fiksację, kriosekcję, barwienie fluorescencyjne, barwienie immunologiczne i obrazowanie, który może być rozszerzony na obrazowanie konfokalne i wielofotonowe. Metoda zachowuje skuteczność porównywalną ze skomplikowanymi sekcjami, omijając potrzebę zaawansowanych umiejętności motorycznych. Ilościowa analiza obrazu daje szeroki potencjał badawczy.

Bezpośrednia kriosekcja głów Drosophila w celu wzmocnienia barwienia fluorescencyjnego mózgu i barwienia immunologicznego

Poznaj podwójną fluorescencyjną hybrydyzację in situ w świeżych skrawkach mózgu do jednoczesnej detekcji dwóch transkryptów mRNA w rozdzielczości pojedynczych komórek. Ta metoda pozwala badać ekspresję genów w neuronach.

Podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w świeżych przekrojach mózgu

Przeglądaj więcej filmów