Podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w świeżych przekrojach mózgu

Witajcie, jestem JA, pracownik naukowy na stopniu postdoc w laboratorium AL na Uniwersytecie w Rochester. Przedstawimy Państwu metodę hybrydowego trawienia w świeżo zamrożonych sekcjach mózgu w celu jednoczesnego wykrycia dwóch transkryptów mRNA z rozdzielczością pojedynczych komórek. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na pytania z dziedziny neuronauki, takie jak te dotyczące anatomicznej, funkcjonalnej, molekularnej i neurochemicznej organizacji określonego obwodu mózgowego.

Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat koagulacji genów w neuronach mózgu AV, można ją również zastosować w innych układach, takich jak gryzonie, a także w różnych tkankach nerwowych. Aby rozpocząć tę procedurę, należy nawodnić odpowiednią ilość proszku SDX G 50 z RNA za pomocą wody.

Krótko wymieszaj roztwór i przechowuj w temperaturze pokojowej od dwóch do pięciu minut. Krok ten oddziela kuleczki SDX od dekstrozy znajdującej się w komercyjnym proszku sedex po wytrącaniu Sedex G 50. Usuń nadsącz i powtórz proces od trzech do pięciu razy; po ostatnim przemyciu ponownie zawieś roztwór SX G 50 w buforze TE w stosunku objętości buforu do kuleczek jeden do jednego i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

Następnie należy przygotować kolumny. Umieść autoklawowaną wełnę szklaną w sterylnej strzykawce o pojemności 1 ml i uciśnij ją tłokiem, aby utworzyć zwartą warstwę na dnie. Następnie umieść strzykawkę w probówce typu Falcon o pojemności 15 ml.

Napełnij kolumny roztworem Sedex G 50, wirując w wirówce Beckman z rotorami stałokątnymi C 0 6 5 0 przy 1000 obr./min przez 30 sekund. Po wirowaniu przemyj każdą kolumnę, nakładając 200 µL buforu do płukania kolumn i wirując przez dwie minuty przy 1000 obr./min.

Postępuj jak poprzednio. Na koniec nanieś 200 µL buforu blokującego kolumny na każdą kolumnę i wiruj przez dwie minuty przy 1000 obr./min. Powtórz ten krok od czterech do pięciu razy, aby zrównoważyć kolumnę.

Przechowywać przygotowane kolumny w temperaturze 4 °C do czasu oznakowania sondy RIBA i przygotowania jej do oczyszczania. W przypadku procedury podwójnej hybrydyzacji fluorescencyjnej w C2 lub procedury D-FISH przedstawionej w tym materiale, przygotowuje się dwie sondy RNA: jedną oznakowaną digoksygieną (DIG) i drugą biotyną. Rozpocząć oznakowanie sond od przygotowania roztworów do znakowania sond ribo oraz inkubacji reakcji znakowania w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Po zakończeniu dwugodzinnej inkubacji do każdej reakcji znakowania dodać 1 µL TRNA o stężeniu 20 µg/µL oraz 39 µL buforu blokującego kolumnę.

Następnie przygotuj kolumny EDEX G 50 do oczyszczania sond, dodając 50 µL buforu blokującego do każdej kolumny i wirując przez trzy minuty przy 2000 obr./min. Powtórz ten krok dwa do trzech razy, aby zrównoważyć kolumny. Gdy kolumny będą gotowe, umieść nową probówkę EEND u podstawy kolumny.

Nanieś roztwór sondy na kolumnę Sedex G 50 i wiruj przez trzy minuty przy prędkości 2000 obr./min. Aby uzyskać 50 µL oczyszczonego roztworu sondy Ribo, oceń jakość i wydajność znakowanej i oczyszczonej sondy ribo. Przed przejściem do hybrydyzacji z użyciem kriotomu, pobierz dwa lub trzy przekroje mózgu na szkiełka SuperFrost Plus.

Grubość skrawka powinna wynosić od 10 do 12 mikronów. Preparaty mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Inkubuj skrawki w zimnym, świeżo przygotowanym 3% roztworze paraformaldehydu przez pięć minut.

Następnie krótko wypłucz przekroje dwukrotnie w PBS. Dalej odwodnij przekroje, stosując standardową serię alkohołów: roztwory etanolu o stężeniach 70, 95 i 100% przez dwie minuty w każdym z nich. Po odwodnieniu przekrojów inkubuj je w świeżo przygotowanym roztworze acetylującym przez 10 minut.

Następnie wypłucz przekroje trzykrotnie w podwójnym stężeniu roztworu SSPE, a następnie ponownie odwodnij przekroje po acetylacji, stosując standardową serię alkoholi, tak jak pokazano przed chwilą. Teraz rozpocznij hybrydyzację z sondą rybo. Nanieś odpowiednią objętość roztworu do hybrydyzacji na tkankę, przykryj preparaty szkiełkami podstawowymi i umieść je w metalowym uchwycie do szkiełek.

Zanurz uchwyt w kąpieli olejowej z oleju mineralnego w temperaturze 65 °C na całą noc. Następnego dnia ostrożnie wyjmij uchwyt do szkiełek z kąpieli olejowej i krótko wypłucz go w chloroformie, aby usunąć nadmiar oleju ze szkiełek.

Umieść preparaty w 2× roztworze SSPE na od 5 do 10 minut w celu usunięcia szkiełka nakrywki. Po usunięciu szkiełka nakrywki przenieś preparaty do nowego 2× roztworu SSPE i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej; przed rozpoczęciem tego etapu inkubacji wstępnie podgrzej roztwór 2× SSPE z dodatkiem 50% formamidu do temperatury stosowanej podczas hybrydyzacji. Krok ten kończy jednogodzinną inkubację.

Przenieś preparaty na szkiełkach do podgrzanego wcześniej roztworu 2x SSPE i inkubuj przez 1,5 godziny. Na początku tego etapu inkubacji podgrzej roztwór 0,1x SSPE do tej samej temperatury, która była stosowana w kroku hybrydyzacji. Zakończ przemywanie po hybrydyzacji, przenosząc szkiełka do PODGRZANEGO Wcześniej roztworu 0,1x SSPE i inkubując przez 30 minut.

Powtórz to płukanie raz. Przekroje mózgu są teraz gotowe do detekcji i wizualizacji zhybrydyzowanych sond ryboprob. Dodaj 0,3% nadtlenku wodoru do buforu TNT i inkubuj preparaty w tym roztworze przez 10 minut. Następnie wypłucz preparaty w buforze TNT trzy razy po 10 minut za każdym razem, używając pipety typu deco pen.

Narysuj obwódkę wokół obszaru zawierającego przekroje mózgu. Nanieś 150 µL buforu TNB na każdy preparat i inkubuj przekroje w tym roztworze przez 30 minut. Upewnij się, że przekroje nie wyschną podczas tego etapu.

Następnie nanieś 150 µL roztworu TT NB zawierającego przeciwciało anty-DIG sprzężone z peroksydazą i przechowuj preparaty w komorze wilgotnościowej przez dwie godziny. Po zakończeniu dwugodzinnej inkubacji przemyj sekcje w buforze TNT trzy razy przez 10 minut. Za każdym razem nanieś 150 µL roboczego roztworu T IDE sprzężonego z Alexa 5 9 4 na każdy preparat i przechowuj je w komorze wilgotnościowej przez jedną godzinę.

Po upływie jednej godziny przemyj przekroje w buforze TNT trzy razy przez 10 minut. Za każdym razem inkubuj przekroje w 0,3% nadtlenku wodoru w roztworze buforu TNT przez 10 do 30 minut. Czas inkubacji w roztworze nadtlenku wodoru zależy od obfitości mRNA i powinien zostać przetestowany przed przeprowadzeniem procesu D fish.

Następnie płucz sekcje w buforze TNT trzy razy po 10 minut każdorazowo. Nanieś 150 µL buforu TMB na każdy slajd i pozostaw slajdy w komorze wilgotnej na 30 minut. Usuń nadmiar roztworu TMB, przechylając slajdy.

Dodaj 150 µL roztworu TMB zawierającego przeciwciało anin sprzężone z peroksydazą i przechowuj preparaty w komorze wilgotnościowej przez dwie godziny. Następnie przemyj skrawki w buforze TNT trzy razy po 10 minut. Za każdym razem nanieś na preparaty 150 µL roboczego roztworu przeciwciała mite sprzężonego z Alexa 488 i inkubuj skrawki przez jedną godzinę.

Następnie przemyj skrawki w buforze TNT trzy razy przez 10 minut za każdym razem. Po oznakowaniu obu sond rybo przeciwciałami, inkubuj skrawki w 150 µL roztworu gospodarza przez dwie minuty. Następnie przemyj skrawki w buforze TNT trzy razy przez pięć minut za każdym razem, nanieś na skrawki kompatybilne z fluorescencją medium montażowe, takie jak Vector Shield lub Prolong Antifade, przykryj je szkiełkiem cover slip i obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Te reprezentatywne mikrofotografie pochodzą z eksperymentu na rybach D z przekrojami mózgu ziębika, a konkretnie z regionu NCM, który jest analogiem kory słuchowej ssaków u ptaków śpiewających. Przekroje mózgu poddano hybrydyzacji z dwiema sondami: biotynylowaną sondą rybo skierowaną przeciwko par albuminie, będącej markerem dla subpopulacji neuronów hamujących, oraz znakowaną DIG sondą rybo skierowaną przeciwko genowi zależnemu od aktywności zinc, który jest wiarygodnym markerem neuronów sterujących śpiewem. Nałożenie obu obrazów pokazuje populację komórek neuronów hamujących, które są aktywowane przez doświadczenia słuchowe.

Groty strzałek wskazują komórki znakowane wyłącznie sondą ribo dla par. Strzałki dla albuminy wskazują komórki znakowane wyłącznie sondą RIBA dla cynku, reprezentujące neurony. Komórki wykazujące koekspresję obu interesujących transkryptów są oznaczone gwiazdką. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o utrzymaniu czystości stanowiska pracy oraz stosowaniu wolnych od nukleaz roztworów, tworzyw sztucznych i szkła laboratoryjnego.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat jednoczesnego wykrywania dwóch gatunków MA z rozdzielczością pojedynczej komórki w świeżo zamrożonych przekrojach mózgu w celu badania koregulacji genów w mózgu szczura. Dziękujemy za obejrzenie filmu. Powodzenia w eksperymentach.