Name: Organtypowy model hodowli warstw hipokampa do badania uszkodzeń neuronów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-28T17:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Poznaj metodę hodowli organotypowych plasterków hipokampa do badania uszkodzeń neuronów. Technika pozwala zachować architekturę tkanek i kwantyfikować śmierć komórek w regionach CA1, CA3 oraz zębatej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Finansowane przez NINDS, American Heart Association, American Federation for Aging Research, March of Dimes

1. Przygotowanie
Przed rozpoczęciem należy przygotować niezbędne instrumenty chirurgiczne, media do sekcji i hodowli oraz 7-dniowe młode szczury lub myszy. Protokół jest taki sam dla preparatów mysich i szczurzych.
(i) Materiały i sprzęt
<ul>
	<li>Nożyczki operacyjne (proste, długość 6", kat# RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD)</li>
	<li>Nożyczki do mikrodysekcji (długość 4'", kat# RS5910, Roboz, Gaithersburg, MD)</li>
	<li>Pincety Dumont ze stali węglowej (kat# RS-5045, Roboz, Gaithersburg, MD)</li>
	<li>Zmodyfikowane szklane pipety „transferowe” (odcięte dno pipety Pasteura i wygładzone krawędzie)</li>
	<li>Plastikowa folia Aclar pocięta w kwadraty o wymiarach 2" x 2" (Honeywell, # 812071, Pottsville, PA)</li>
	<li>Gąbki osłonowe 4 x 3 cala (Kendall, kat# 3157, Mansfield, MA)</li>
	<li>Wkładki membranowe Millicell 30 mm (0.4 μm; Millipore, Bedford, MA)</li>
	<li>Krajarka do tkanek McIlwain z dwukrawędziową żyletką (McIlwain tissue chopper, Vibratome Company, St. Louis, MO)</li>
	<li>Mikroskop odwrócony z kamerą CCD i oprogramowaniem do analizy obrazu</li>
</ul>
(ii) Pożywka do sekcji (DM; 1 litr o pH 7,3)
<table border="0">
	<tbody>
 	<tr>
			<td>zrównoważona sól Hanksa</td>
			<td>1 fiolka ( 95,2 g/1L) ( Sigma : H2387 )</td>
		</tr>
 <tr>
			<td>NHCO3 (4,2 mM)</td>
			<td>350 mg</td>
 </tr>
 <tr>
			<td>HEPES (10 mM)</td>
			<td>2,83 g</td>
 </tr>
 <tr>
			<td>Glukoza (3,3 mM)</td>
			<td>6,0 g</td>
 </tr>
		<tr>
			<td>Penicylina/streptomycyna (10x)</td>
			<td>10 ml</td> 
 </tr>
 <tr>
			<td>BSA (0,3%)</td>
			<td>30 mg</td>
 </tr>
 <tr>
			<td>MgSO₄4-7H2O</td>
			<td>1,4 g</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
(iii) Pożywka hodowlana (40 mL)
<table border="0">
	<tbody>
 	<tr>
			<td>MEM (Invitrogen 1575-032)</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>***Zrównoważony roztwór soli Hanksa (Invitrogen 24020-17)</td>
			<td>10 ml</td>
 </tr>
		<tr>
			<td>surowica konia (Invitrogen 26050-070)</td>
			<td>10 mL</td>
 </tr>
		<tr>
 	<td>bufor HEPES (1 M; Invitrogen 15630-080)</td>
			<td>5 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 		<td>Penicylina/Streptomycyna (10x)</td>
			<td>4 ml</td>
 </tr>
		<tr>
 	<td colspan="2">Przed przygotowaniem pożywki dodać 12,8 g glukozy do 50 ml roztworu soli Hanksa (HBSS).</td>
 </tr>
	</tbody>
</table>
(iv) Zwierzęta 
7-dniowe szcząta szczura lub myszy, zazwyczaj jeden miot na eksperyment.
2. W dniu hodowli
<ol>
	<li>Wszystkie narzędzia do sekcji oraz folia Aclar muszą być moczone w 70% ETOH przez 30 minut przed rozpoczęciem. Powierzchnia kapturka do sekcji, ostrze oraz przecinarka do tkanek muszą zostać zdezynfekowane etanolem.</li>
	<li>Przygotować kilka (3-4) 6-dołkowych płytek do hodowli tkankowej; dodać 1 mL pożywki hodowlanej do każdej dołki i wstawić do każdej z nich przepuszczalną membranę Millipore. Umieścić płytki 6-dołkowe w inkubatorze w temperaturze 37° do momentu przeniesienia skrawków.</li>
	<li>Przygotować kilka (4-6) płytek 60 mm z DM i umieścić je w lodzie.</li>
	<li>Szybko przeprowadzić dekapitację za pomocą nożyczek i zanurzyć w 70% ETOH, a następnie szybko odsłonić mózg, wykonując cięcie strzałkowe czaszki. Ostrożnie usunąć mózg i natychmiast umieścić w zimnym DM. Rozdzielić go na dwie półkule i położyć każdą z nich stroną przyśrodkową dołu na gąbce przykrywnej na 2-3 sekundy.</li>
	<li>Delikatnie podnieść i położyć półkulę na kwadracie folii Aclar, a następnie umieścić na przecinarce do tkanek; przeciąć mózg w płaszczyźnie wieńcowej na sekcje o grubości 350 μm. Po zakończeniu delikatnie pobrać kwadrat Aclar z pociętą półkulą i zanurzyć w zimnym DM.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu sekcyjnego wyodrębnić sekcje hipokampa. W przypadku szczura powinno to być 5 sekcji obejmujących hipokamp od strony rostralnej do kaudalnej, a w przypadku myszy 3-4 sekcje.</li>
	<li>Wyjąć z inkubatora do hodowli tkankowej w temperaturze 37° płytki 6-dołkowe z wkładami membranowymi. Przenieść poszczególne skrawki hipokampa na membrany przepuszczalne za pomocą szklanej pipety transferowej. Jeśli na membranę przedostanie się zbyt dużo DM, usunąć nadmiar DM pipetą Pasteura. Umieścić pięć skrawków hipokampa na każdej membranie. Przewidzieć co najmniej 3 dołki na każdą próbę, czyli 15 skrawków.</li>
	<li>Inkubować płytki hodowlane w temperaturze 37° w inkubatorze z 5% CO nawilżonym przez 12-14 dni przed rozpoczęciem eksperymentu toksyczności. Pożywkę hodowlaną można wymieniać dwa razy w tygodniu.</li>
</ol>
3. Indukowanie i ilościowe określanie uszkodzeń neuronów hipokampa w kulturze skrawków
<ol>
	<li>Po 12–14 dniach hodowli do pożywki dodać 5 μg/mL jodku propidyny (PI). Krok ten umożliwi wizualizację i ilościowe oznaczenie podstawowej śmierci komórkowej.</li>
	<li>Następnego dnia oznaczyć fluorescencję PI w podregionie CA1 (oraz/lub CA3 lub zakręcie zębatym, jeśli jest to pożądane) każdego skrawka hipokampa i wyznaczyć średnie wartości pomiarów fluorescencji PI reprezentujące podstawową śmierć komórkową (oznaczaną jako czas=0 godzin, lub T0). Do akwizycji i kwantyfikacji obrazów stosujemy oprogramowanie OpenLab (Improvision, U.K.), jednak do pomiaru intensywności fluorescencji można użyć innego oprogramowania do akwizycji i analizy obrazu.</li>
	<li>Bezpośrednio po akwizycji obrazów fluorescencji PI dla T0, wywołać uszkodzenie neuronów wybraną metodą (stosowaliśmy 10 μM NMDA, deprywację tlenowo-glukozową lub LPS przez jedną godzinę w celu wywołania toksyczności neuronalnej 2,5). Po stymulacji toksycznej wymienić pożywkę na świeżą, zawierającą 5 μg/mL PI, i inkubować skrawki przez noc.</li>
	<li>W 3. dniu oznaczyć średnią fluorescencję PI dla warunków eksperymentalnych po 24 h, czyli T24.</li>
	<li>Po akwizycji obrazów natychmiast zmienić pożywkę, dodać 10 μM NMDA oraz 5 μg/mL PI i inkubować skrawki przez noc, aby osiągnąć maksymalną śmierć neuronów.</li>
	<li>W 4. dniu oznaczyć średnią fluorescencję PI dla maksymalnej śmierci neuronalnej, zdefiniowanej jako Tmax. Obliczyć procent śmierci komórkowej według wzoru: (T24 - T0) / (Tmax-T0).</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2106/2106fig1.jpg" alt="Proces eksperymentu śmierci komórkowej; oś czasu fluorescencji PI i wzór obliczeniowy, obrazy mikroskopowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. (A) Oś czasu generowania plastrów hipokampa oraz późniejszego wywołania urazu eksperymentalnego i akwizycji obrazów. (B) Reprezentatywne obrazy plastrów hipokampa w stanie bazowym (T0), 24 godziny po 1-godzinnej ekspozycji na 10 μM NMDA (T24), a następnie po kolejnych 24 h lub 10 μM NMDA w celu uzyskania maksymalnego uszkodzenia neuronów (Tmaks.).

<ol><li>Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).</li>
<li>McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+Function+of+the+PGE2+EP2+Receptor+in+Cerebral+Ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia.</a> J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).</li>
<li>Czapiga, M., Colton, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+microglia+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Function of microglia in organotypic slice cultures.</a> J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).</li>
<li>Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+non-glutamate+receptor+mediated+toxicity+caused+by+oxygen+and+glucose+deprivation+in+organotypic+hippocampal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures.</a> J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).</li>
<li>Wu, L., Wang, Q., Liang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+Effects+of+prostaglandin+recetor+signaling+on+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letter%22%5BJournal%5D)">Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival.</a> Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).</li>
<li>Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+in+vitro%3A+Analysis+of+morphology+and+adhesion+molecule+expression+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Glia. 18, 319-319 (1996).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Aby zapewnić powtarzalne i spójne wyniki podczas replikacji eksperymentów, należy przestrzegać dwóch istotnych kwestii. Po pierwsze, ważne jest, aby skrawki hipokampa dojrzewały przez 12-14 dni przed rozpoczęciem doświadczeń. Izolacja skrawków wywołuje znaczną odpowiedź mikrogleju, a komórki te pozostają aktywne przez pewien czas, wracając do spoczynkowego stanu rozgałęzionego około 10 dnia in vitro 3,6. Po drugie, średnia intensywność fluorescencji PI jest proporcjonalna do liczby uszkodzonych komóre...

model organotypowej hodowli skrawków hipokampa do badania uszkodzeń neuronów

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypowa hodowla plastrów hipokampa jest metodą in vitro służącą do badania mechanizmów uszkodzeń neuronalnych, w której podstawowa architektura i skład hipokampa są w stosunkowo dużym stopniu zachowane 1. System hodowli organotypowej umożliwia badanie efektów neuronalnych, astrocytarnych i mikroglialnych, jednak jako preparat ex vivo nie uwzględnia wpływu przepływu krwi ani rekrutacji obwodowych komórek zapalnych. Z tego względu metoda ta jest często stosowana do badania uszkodzeń ekscytotoksycznych i hipoksyjnych neuronów piramidowych hipokampa, ale była również wykorzystywana do analizy odpowiedzi zapalnej. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody tworzenia hodowli plastrów hipokampa z mózgu gryzoni postnatalnych, podawania bodźców toksycznych w celu wywołania uszkodzeń neuronalnych oraz badania i kwantyfikacji śmierci neuronów hipokampa.

Organoptypowy model hodowli plastrów hipokampa jest modelem in vitro stosowanym do badania uszkodzeń neuronalnych w różnych paradygmatach. W niniejszym artykule opisujemy metody przygotowania hodowli plastrów oraz ilościowego oznaczania uszkodzeń neuronalnych.

Model organotypowej hodowli skrawków hipokampa do badania uszkodzeń neuronów

Organotypowe hodowle wycinków hipokampa to metoda in vitro służąca do badania mechanizmów uszkodzeń neuronalnych, w której podstawowa architektura i skład...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie organotypowych kultur plastrów hipokampa, które mogą być wykorzystane do modelowania uszkodzeń neuronów w odpowiedzi na różne bodźce, w tym NMDA, ekscytotoksyczność, deprywację tlenu i glukozy lub bodźce zapalne, takie jak lipopolisacharyd lub peptyd beta-amyloidowy. Cel ten osiąga się poprzez wstępne wyizolowanie mózgu postnatalnego i pocięcie każdej półkuli w celu uzyskania przekrojów koronarnych. Drugim krokiem procedury jest wyizolowanie obszarów hipokampa i ich hodowla na wkładkach membranowych w płytkach sześciodołkowych. Po zakończeniu hodowli plastry barwi się jodkiem propidium i oblicza poziom spontanicznej śmierci neuronów.Na koniec skrawki poddaje się działaniu czynnika neurotoksycznego i ponownie barwi, aby zmierzyć odpowiedź toksyczną na zastosowane leczenie. W rezultacie można uzyskać dane obrazujące procent zgonów neuronów w obszarach CA1, CA3 oraz zakręcie zębatym hipokampa w różnych warunkach eksperymentalnych poprzez kwantyfikację fluorescencji jodku propidyny z wykorzystaniem mikroskopii immunofluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak pierwotna hodowla neuronów, jest możl

the-organotypic-hippocampal-slice-culture-model-for-examining

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Model tkankowej hodowli skorupy hipokampa do badania uszkodzeń neuronów

Opisujemy metodę przygotowania organotypowych skrawków hipokampa, którą można łatwo dostosować do innych obszarów mózgu. Skrawki mózgu umieszcza się na porowatych membranach, pozwalając na utworzenie interfejsu z pożywką hodowlaną. Metoda ta pozwala zachować ogólną architekturę hipokampa przez okres do 2 tygodni hodowli.

Organotypowe hodowle przekrojów hipokampa

Ten film demonstruje metodę przygotowania organotypowych kultur wycinków hipokampa z mózgu szczeniaka szczura. Przedstawia etapy związane z sekcją hipokampa, krojeniem i warunkami hodowli wymaganymi do promowania żywotności i wzrostu komórek w wycinkach hipokampa, ostatecznie generując organotypowe kultury warstwowe.

Przygotowanie organtypowych kultur plasterkowych z hipokampa szczeniaka szczura

Organotypowa kokultura wycinków mózgu z komórkami rakowymi umożliwia wizualizację zmian morfologicznych za pomocą fluorescencji, jak również mikroskopii w jasnym polu (wideo) podczas procesu inwazji komórek rakowych w tkance mózgowej. Ten modelowy system pozwala również na podejście oparte na wymianie i uzupełnianiu komórek oraz oferuje szeroką gamę manipulacji i analiz.

System kokultury z organotypowym wycinkiem mózgu i sferoidą 3D komórek rakowych

Opracowaliśmy model wycinka mózgu, który może być wykorzystany do zbadania mechanizmów molekularnych związanych z uszkodzeniem mózgu za pośrednictwem ekscytotoksyczności. Ta technika generuje żywotną dojrzałą tkankę mózgową i zmniejsza liczbę zwierząt wymaganych do eksperymentów, jednocześnie utrzymując częściowo nienaruszone obwody neuronalne, interakcje komórkowe i przedziały postsynaptyczne.

Ekscytotoksyczna stymulacja mikrowycinków mózgu jako model udaru in vitro

Opisano technikę badania komórek NG2 i oligodendrocytów za pomocą systemu hodowli plasterkowej w przodomózgowiu i móżdżku.  Metoda ta pozwala na badanie dynamiki proliferacji i różnicowania komórek w obrębie linii oligodendrocytów, w której można łatwo manipulować środowiskiem zewnątrzkomórkowym przy zachowaniu cytoarchitektury tkanek.

Organotypowe kultury warstwowe do badania dynamiki oligodendrocytów i mielinizacji

Przedstawiono protokół dla organotypowych kultur entorhino-hipokampowych, który pozwala na odtworzenie wielu aspektów niedokrwiennego uszkodzenia mózgu. Badając zmiany układu nerwowo-naczyniowego oprócz zmian w neuronach, protokół ten jest wszechstronnym narzędziem do badania zmian plastycznych w tkance nerwowej po urazie.

Analiza przebudowy nerwowo-naczyniowej w organotypowych kulturach entorhino-hipokampowych plastrów

Tutaj opisujemy technikę badania neurogenezy poporodowej hipokampa za pomocą techniki organotypowej hodowli plastrów. Metoda ta pozwala na manipulację neurogenezą dorosłych w warunkach in vitro i pozwala na bezpośrednie zastosowanie środków farmakologicznych do hodowanego hipokampa.

Organotypowe kultury warstwowe do badań neurogenezy poporodowej

Organotypowe kultury plastrów hipokampa (OHSC) reprezentują model in vitro, który bardzo dobrze symuluje sytuację in vivo. W tym miejscu opisujemy ulepszony protokół krojenia oparty na wibratomie w celu uzyskania wysokiej jakości plastrów do wykorzystania w ocenie potencjału neuroprotekcyjnego nowych substancji lub biologicznego zachowania komórek nowotworowych.

Organotypowe kultury warstwowe hipokampa jako model do badania neuroprotekcji i inwazyjności komórek nowotworowych

Przedstawiono protokół przygotowania swobodnie pływających kultur warstwowych z dorosłego ludzkiego mózgu. Protokół jest odmianą szeroko stosowanej metody hodowli plastrowej z wykorzystaniem wkładek membranowych. Jest prosty, opłacalny i zalecany do przeprowadzania krótkoterminowych testów mających na celu rozwikłanie mechanizmów neurodegeneracji stojących za chorobami mózgu związanymi z wiekiem.

Krótkoterminowe, swobodnie unoszące się w powietrzu kultury warstwowe z dorosłego ludzkiego mózgu

Tutaj opisujemy przygotowanie organicznych plastrów kory nosa i hipokampa. Przy stopniowym i kontrolowanym pozbawianiu surowicy, plastry te przedstawiają ewoluujące zdarzenia podobne do padaczki i mogą być uważane za model epileptogenezy ex vivo. System ten stanowi doskonałe narzędzie do monitorowania dynamiki spontanicznej aktywności, a także do oceny progresji cech neurozapalnych w całym przebiegu epileptogenezy.

Model epileptogenezy w organotypowych kulturach warstwowych kory nosa i hipokampa

Ten artykuł ma na celu opisanie systematycznego protokołu uzyskiwania poziomych wycinków mózgu hipokampa u myszy. Celem tej metodologii jest zachowanie integralności szlaków włókien hipokampa, takich jak ścieżka perforantu i szlak włókien omszałych, w celu oceny procesów neurologicznych związanych z zakrętem zębatym.

Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

Poznaj metodę hodowli organotypowych plasterków hipokampa do badania uszkodzeń neuronów. Technika pozwala zachować architekturę tkanek i kwantyfikować śmierć komórek w regionach CA1, CA3 oraz zębatej.

Model organotypowej hodowli skrawków hipokampa do badania uszkodzeń neuronów

Przeglądaj więcej filmów