Wytwarzanie biologicznych materiałów wstrzykiwalnych do inżynierii tkankowej mięśnia sercowego

Żele macierzy wytwarzane z decelularyzowanej tkanki osierdziowej i mięśniowej zachowują natywne składniki macierzy pozakomórkowej, w tym różnorodne białka, peptydy i glikozaminoglikany. Macierze tkankowe te mogą być wykorzystywane w inżynierii tkankowej. W tym filmie żele macierzy są wytwarzane poprzez decelularyzację tkanki osierdziowej w celu uzyskania acellularnej macierzy pozakomórkowej.

Następnie macierz zewnątrzkomórkową poddaje się obróbce w celu stworzenia rozpuszczalnej wersji w formie cieczy. W kolejnym kroku rozpuszczalną macierz testuje się na modelu małych zwierząt, aby ocenić jej przydatność jako rusztowania do wstrzykiwania. Analiza histologiczna i immunohistochemiczna wykazuje, że in vivo wstrzyknięty materiał tworzy porowate włókniste rusztowanie, które umożliwia infiltrację komórek naczyniowych.

Witajcie, nazywam się Sonia Zeki. Jestem doktorantką w laboratorium dr Karen Chrisman na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Diego. Dzisiaj przygotujemy solubilizowaną macierz zewnątrzkomórkową (sECM) z tkanki zdecelularyzowanej i zaprezentujemy testy in vivo w zastosowaniach z zakresu inżynierii tkankowej serca.

Techniki te są istotne dla opracowania terapii z wykorzystaniem wstrzykiwalnego biomateriału w leczeniu niewydolności serca. Procedurę chirurgiczną po zawale mięśnia sercowego zaprezentuje Pam, neurochirurg weterynaryjny w naszym laboratorium. Zatem zacznijmy.

Protokół należy rozpocząć od decelularyzacji tkanki w celu pozostawienia samej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). W pierwszej kolejności osierocze osierdzie świni należy umieścić w zlewce z wodą dejonizowaną i przemyć, mieszając przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po przemyciu tkankę należy umieścić w 1× PBS zawierającym 1% SDS oraz 1% penicyliny i streptomycyny i mieszać nieprzerwanie przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Następnego dnia tkankę należy ponownie umieścić w wodzie dejonizowanej i mieszać nieprzerwanie przez pięć godzin, wstrząsając w probówce 50 ml aż do całkowitego usunięcia piany.

Barwienie hematyną i eozyną powinno wykazać brak jąder komórkowych w tkance zdecelularyzowanej. Umieścić pozostałą część zdecelularyzowanej tkanki w stożkowej probówce o pojemności od 15 do 50 ml. Następnie umieścić tkankę w zamrażarce o temperaturze -80 °C.

Liofilizuj zamrożone próbki poprzez suszenie mrozowe pod bardzo niskim ciśnieniem i w bardzo niskiej temperaturze aż do całkowitego wyschnięcia. W zależności od zastosowanego systemu i zawartości wody w próbkach, proces ten może trwać od 12 do 72 godzin. Po całkowitym wysuszeniu zdecelularyzowanej tkanki przenieś ją do młyna Wiley Minim.

Używając sita o gęstości oczek 40 gauge, rozetrzyj tkankę na drobny proszek. Gdy większość próbki przejdzie przez filtr, wyjmij naczynie zbiorcze. Próbka ta jest odtąd nazywana proszkiem z macierzy zewnątrzkomórkowej lub proszkiem ECM.

W tym momencie można przeprowadzić drugi etap liofilizacji, jeżeli nie przechodzi się niezwłocznie do kolejnego kroku. Zapewnia to dokładność odważonej masy niezbędnej do rozpuszczenia ECM. Odważ pożądaną ilość proszku ECM do sterylnej fiolki.

Dodać sterylnie filtrowany roztwór chlorku wodoru o stężeniu 1 mg/mL Pepcid do fiolki scyntylacyjnej z proszkiem ECM, tak aby stężenie ECM wynosiło 10 mg/mL. Włożyć mieszadło magnetyczne i umieścić fiolkę na mieszalce magnetycznej.

Mieszać nieprzerwanie od 48 do 60 godzin, okresowo zgarniając ze ścianek fiolki resztki za pomocą sterylnej łyżki lub szpatułki WHE. Należy to robić, aby zapewnić trawienie całego proszku ECM. W miarę trawienia ECM będzie on przechodzić do roztworu.

Po upłynnieniu ECM umieść próbkę w lodzie i dostosuj pH do wartości 7,4, używając wodorotlenku sodu oraz kwasu solnego. Po skorygowaniu pH dodaj 10x PBS w taki sposób, aby końcowe stężenie roztworu wynosiło 1x PBS. Na przykład, jeśli dysponujesz 900 µL roztworu ECM, po regulacji pH należy dodać 100 µL 10x PBS.

Wyznacz stężenie zsolubilizowanego roztworu ECM, sumując objętości dodane w celu neutralizacji oraz objętości pobrane do pomiaru pH. Następnie dodaj PBS (1×), aby osiągnąć pożądane stężenie końcowe: 6 mg/mL.

W dniu operacji przygotuj 75 µL wstrzyknięcia rozpuszczonej ECM w strzykawce 0,1 mL z igłą o rozmiarze 30 G. Utrzymaj znieczulenie intubowanej samicy szczura rasy Harlan dolly za pomocą 2,5% izofluranu. Podaj lek do oka, a następnie zweryfikuj głębokość znieczulenia, wykonując test uciśnięcia palca u stopy.

Podaj trzy mililitry roztworu Ringera z mleczanem drogą podskórną w dolnej części brzucha w celu nawodnienia. Następnie ułóż zwierzę w pozycji tyłem na stole operacyjnym i delikatnie przymocuj kończyny taśmą. Użyj trymera do usunięcia włosów z brzucha, a następnie wciągnij luźną sierść odkurzaczem.

Wykonaj serię wstrzyknięć lidokainy 2% w objętości 50 µL wzdłuż przekątnej od wyrostka miecza do dolnej prawej strony brzucha. Następnie przemyj obszar trzykrotnie Betadyną, zaczynając od środka i przesuwając się na zewnątrz. Powtórz przemywanie za pomocą alkoholu izopropylowego.

Następnie przykryj zwierzę polem chirurgicznym z gotowym okrągłym otworem. Zabeziecz pole chirurgiczne. Użyj skalpela nr 10.

Wykonaj nacięcie o długości od trzech do czterech centymetrów od wyrostka mieczowatego do dolnej prawej strony brzucha. Zlokalizuj wyrostek mieczowaty i dokonaj pionowej dyssekcji przez mięśnie w kierunku prawym, uważając, aby nie uszkodzić dużego naczynia po prawej stronie. Następnie za pomocą nożyczek przetnij mięśnie w kierunku bocznym, odsłaniając przeponę.

Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić wątroby, używając 36 calowego odcinka nici chirurgicznej Vicryl 3-0 oraz pary kleszczyków hemostatycznych. Przeciągnij jedną igłę przez wyrostek mieczowaty i wyciągnij nić do połowy. Zlep końce nici taśmą i przymocuj je do punktu nad zwierzęciem i za nim, unosząc wyrostek mieczowaty i odsłaniając przeponę za pomocą kolejnego 36 calowego odcinka nici Vicryl 3-0.

Przewlecz igłę przez mięsień znajdujący się najbliżej wyrostka mieczowatego, a następnie wyciągnij ją i przymocuj koniec do innego punktu po prawej stronie stołu operacyjnego, aby w pełni odsłonić jamę chirurgiczną. Następnie, używając małej mikro-pincety typu rat tooth, chwyć środek przepony, wyciągnij go i wykonaj bardzo małe nacięcie tępymi nożyczkami. Po wykonaniu tego otworu płuca zostaną cofnięte.

Wykonaj nacięcie o długości od dwóch do trzech centymetrów pionowo przez przeponę, aby uwidocznić serce. Następnie wprowadź trzymilowy wymaz po lewej stronie jam ciała i odsunie płuca. Przymocuj wymaz w tej pozycji za pomocą kleszczyków ręcznikowych.

Używając innego wymazu, odsuń prawe płuco, aby zlokalizować worek osierdzia. Następnie, używając mikro pincety oraz dużych pincet z ząbkami, przerwij worek osierdzia, odsłaniając wierzchołek serca. Chwyć wierzchołek serca prawą mikro pincetą z ząbkami i wprowadź igłę w celu wstrzyknięcia rozpuszczonej macierzy, kierując ściętym końcem igły w lewo.

W odległości jednej trzeciej od wierzchołka, równolegle do powierzchni epikardialnej. Należy uważać, aby nie uszkodzić żyły wieńcowej przedniej. Wstrzyknąć rozpuszczony żel matrycowy i odczekać kilka sekund przed wyjęciem igły.

Tkanka w miejscu wstrzyknięcia powinna wybielić; należy odsączyć krew z jamy ciała, a następnie za pomocą zakrzywionych mikrohemostatów usunąć kleszczyki i tampon trzymający prawe płuco. Wykonać początkowy węzeł, używając 30 calowej nitki z prolinu 5-0. Następnie za pomocą mikro pincety z ząbkami zaszyć przeponę szwem ciągłym i igłą stożkową, a następnie całkowicie zamknąć otwór. Wprowadzić rurkę ssącą PE 1 60 i zamknąć wokół niej, używając strzykawki 10 ml w celu ewakuacji treści z jamy klatki piersiowej.

W miarę zaciśkania szwu przepona powinna być wklęsła. Zredukuj stężenie fluorynu do 1%. Usuń oba szwy 3-0 Vicryl utrzymujące jamę w otwarciu. Nawodnij mięsień, usuwając nadmiar płynu za pomocą tamponu lub sterylnej gazy.

Użyj nowego odcinka nici chirurgicznej 3-0, aby zamknąć warstwę mięśniową za pomocą szwów przerywanych. Następnie wyłącz podawanie izofluranu. Oczyść obszar i użyj zszywacza skórnego do zamknięcia skóry.

Następnie nałożyć potrójną maść antybiotykową w miejscu ncięcia. Pozostawić szczura do wybudzenia w atmosferze 100% oxygen. Gdy zwierzę zacznie oddychać samodzielnie poza respiratorem, usunąć rurkę intubacyjną z tchawicy.

Gdy zwierzę odzyska zdolność poruszania się, podać podskórnie dawkę 0,05 mg/kg buprenorfiny hydrochloride jako środek przeciwbólowy, a następnie umieścić je w klatce domowej na sterylnym ręczniku. Tkankę serca szczurów, którym wstrzyknięto rozpuszczalne żele matrycowe, przekrojono i wybarwiono hematoksyliną i eozyną w celu przeprowadzenia makroskopowej analizy tkankowej w różnych punktach czasowych. Po operacji, w wczesnych punktach czasowych, miejsce wstrzyknięcia wygląda jak różowa sieć włóknista, która w późniejszych punktach czasowych rozprzestrzenia się śródmiąższowo.

Napływ komórek obserwuje się po dwóch tygodniach. Widoczna jest degradacja wstrzykniętej macierzy. Jeśli ECM została oznakowana biotyną przed wstrzyknięciem, można ją zwizualizować bardziej bezpośrednio, barwiąc biotynę streptawidyną sprzężoną z HRP, aby zobrazować wrastanie i formowanie się naczyń w obszarze wstrzyknięcia macierzy.

Przedstawione preparaty zostały poddane barwieniu współbieżnemu z użyciem fitry. Wykorzystano koniugat selektyny wiążącej się z komórkami śródbłonka, widoczny w kolorze zielonym, oraz przeciwciało przeciwko aktynie mięśni gładkich, widoczne w kolorze czerwonym. W pobliżu miejsca iniekcji można również zidentyfikować komórki macierzyste.

Zostały one zwizualizowane za pomocą barwienia immunohistochemicznego na C kit. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować solubilizowaną ECM z odkomórkowanej tkanki i przetestować ją in vivo w zastosowaniach inżynierii tkanki serca. Należy pamiętać, że choć w tym przypadku wykorzystano tkankę osierdzia, tę ogólną procedurę można zmodyfikować tak, aby można było ją zastosować z dowolnym źródłem tkanki.

Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.