Name: Wytwarzanie materiałów iniekcyjnych pochodzenia biologicznego do inżynierii tkankowej mięśnia sercowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania żeli macierzowych z dekompozycyjnej tkanki osierdziowej i ich zastosowanie w inżynierii tkankowej mięśnia sercowego szczura. Technika ta umożliwia tworzenie wstrzykiwalnych rusztowań wspierających regenerację tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te zostały częściowo sfinansowane przez program NIH Director's New Innovator Award, będący częścią NIH Roadmap for Medical Research, w ramach grantu nr 1-DP2-OD004309-01. S.B.S-N. pragnie podziękować NSF za przyznanie stypendium Graduate Research Fellowship.

<ol><li>Seif-Naraghi, S. B., Salvatore, M. A., Magoffin-Schup, P. J., Hu, D. P., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+characterization+of+an+injectable+pericardial+matrix+gel%3A+A+potentially+autologous+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Design and characterization of an injectable pericardial matrix gel: A potentially autologous scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Tissue Engineering. , (2009).</li>
<li>Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+rheological+characterization+of+a+gel+form+of+the+porcine+urinary+bladder+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix.</a> Biomaterials. 29, 1630-1630 (2008).</li>
<li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27, 3675-3675 (2006).</li>
<li>Liao, J., Joyce, E. M., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+decellularization+on+the+mechanical+and+structural+properties+of+the+porcine+aortic+valve+leaflet%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effects of decellularization on the mechanical and structural properties of the porcine aortic valve leaflet.</a> Biomaterials. 29, 1065-1065 (2008).</li>
<li>Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+derived+myocardial+matrix+as+an+injectable+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Biomaterials. 30, 5409-5409 (2009).</li>
<li>Christman, K. L., Vardanian, A. J., Fang, Q., Sievers, R. E., Fok, H. H., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+fibrin+scaffold+improves+cell+transplant+survival%2C+reduces+infarct+expansion%2C+and+induces+neovasculature+formation+in+ischemic+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Injectable fibrin scaffold improves cell transplant survival, reduces infarct expansion, and induces neovasculature formation in ischemic myocardium.</a> J Am Coll Cardiol. 44, 654-654 (2004).</li>
<li>Christman, K. L., Fok, H. H., Sievers, R. E., Fang, Q., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+glue+alone+and+skeletal+myoblasts+in+a+fibrin+scaffold+preserve+cardiac+function+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Fibrin glue alone and skeletal myoblasts in a fibrin scaffold preserve cardiac function after myocardial infarction.</a> Tissue Eng. 10, 403-410 (2004).</li>
<li>Huang, N. F., Sievers, R. E., Park, J. S., Fang, Q., Li, S., Lee, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rodent+model+of+myocardial+infarction+for+testing+the+efficacy+of+cells+and+polymers+for+myocardial+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rodent model of myocardial infarction for testing the efficacy of cells and polymers for myocardial reconstruction.</a> Nat Protoc. (1), 1596-1609 (2006).</li>
<li>Ott, H. C., Matthiesen, T. S., Goh, S. K., Black, L. D., Kren, S. M., Netoff, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+as+a+biologic+scaffold+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix as a biologic scaffold material.</a> Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).</li>
</ol>

Wykorzystanie zwierząt: Wszystkie eksperymenty w niniejszym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi opublikowanymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Diego oraz Amerykańskie Stowarzyszenie Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care).

Niniejsza metoda umożliwia wytwarzanie pochodnych biologicznie, wstrzykiwalnych rusztowań do inżynierii tkanki mięśnia sercowego. Chociaż metody te zostały początkowo opracowane w celu wytwarzania i testowania in vivo żelu z macierzy mięśnia sercowego i zaprezentowano je tutaj z wykorzystaniem żelu z macierzy osierdzia, protokół ten można dostosować do użytku z dowolną tkanką, pod warunkiem, że tkanka ta może zostać odpowiednio zdecelularyzowana. Decelularyzacja powinna zostać przeprowadzona i zweryfikowana prze...

<table><tbody><tr><td>&lt;silny&gt;Odczynniki:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p6887-1G</td><td>Liofilizowany </td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>21217</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidyna-HRP</td><td>Thomas Scientific</td><td>21130</td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Sprzęt:&lt;/strong&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Młyn Wiley Mini Mill</td><td>Thomas Scientific</td><td>3383L10</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator Labconco</td><td>Labconco Corp.</td><td>7670520</td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Wyposażenie chirurgiczne:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>67618-154-16</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Ringera z mleczanem</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>003966</td><td></td></tr><tr><td>Żel KY</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>28658</td><td></td></tr><tr><td>Lidokaina, 2%</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>17767</td><td></td></tr><tr><td>Klorowodorek buprenorfiny</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>12496-0757-1</td><td></td></tr><tr><td>Maść zastępcza do łez</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9860843</td><td></td></tr><tr><td>Potrójna maść antybiotykowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>19082795</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>60307-120-25</td><td></td></tr><tr><td>Otoskop </td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>008699</td><td></td></tr><tr><td>Kurek odcinający</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>006245</td><td></td></tr><tr><td>szew Vicryl 3-0</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>J327H</td><td></td></tr><tr><td>Szew z Proline 5-0</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>s-1173</td><td></td></tr><tr><td>igła tnąca odwrotna (RC)</td><td>Ethicon Inc.</td><td>8684G</td><td></td></tr><tr><td>Mikro clampy hemostatyczne </td><td>Fine Science Tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokleszczyki do zębów szczura</td><td>Fine Science Tools</td><td>11084-07</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel nr 10</td><td>Fine Science Tools</td><td>10110-01</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki tępe</td><td>Fine Science Tools</td><td>14108-09</td><td></td></tr><tr><td>Ostre nożyczki zakrzywione</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td></td></tr><tr><td>Duże pęsety ząbkowane</td><td>Fine Science Tools</td><td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>przewód ssawiący PE160</td><td>BD Biosciences</td><td>427430</td><td></td></tr><tr><td>Klipery </td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>21608</td><td></td></tr><tr><td>Zszywki skórne/zszywacz skórny </td><td>Ethicon Inc.</td><td>PRR35</td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Ogólne materiały i odczynniki:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszadła magnetyczne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,1 M HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strzykawki 0,1 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 10 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>patyczki higieniczne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klej chirurgiczny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obłożenie chirurgiczne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klematy ręcznikowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mały odkurzacz ręczny </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie biologicznych materiałów wstrzykiwalnych do inżynierii tkankowej mięśnia sercowego

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

Niniejszy protokół przedstawia metody przygotowania wstrzykiwalnego żelu z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) do zastosowań w inżynierii tkankowej mięśnia sercowego. W skrócie, tkanka odkomórkowiona zostaje liofilizowana, zmielona, poddana trawieniu enzymatycznemu, a następnie doprowadzona do fizjologicznego pH. Liofilizacja usuwa całą zawartość wody z tkanki, w wyniku czego powstaje sucha macierz ECM, którą można zmielić na drobny proszek za pomocą małej młynki. Po zmieleniu proszek ECM jest trawiony pepsyną w celu utworzenia wstrzykiwalnej macierzy. Po dostosowaniu do pH 7.4 ciekawy materiał macierzy może zostać wstrzyknięty do mięśnia sercowego. Wyniki poprzednich analiz charakterystyki wykazały, że żele macierzy otrzymywane z odkomórkowanej tkanki osierdzia i mięśnia sercowego zachowują natywne składniki ECM, w tym różnorodne białka, peptydy i glikozaminoglikany. Biorąc pod uwagę zastosowanie tego materiału w inżynierii tkankowej, szczególnie przydatna jest charakterystyka in vivo; tutaj przedstawiono metodę wykonywania wstrzyknięcia śródściennego do wolnej ściany lewej komory (LV) jako sposób analizy odpowiedzi gospodarza na żel macierzy w modelu małych zwierząt. Dostęp do jamy klatki piersiowej uzyskuje się poprzez przeponę, a wstrzyknięcie wykonuje się nieco powyżej wierzchołka w wolnej ścianie LV. Rusztowanie pochodzenia biologicznego można zwizualizować poprzez znakowanie biotyną przed wstrzyknięciem, a następnie barwienie przekrojów tkankowych neutrawidyną sprzężoną z peroksydazą chrzanową i wizualizację za pomocą barwienia diaminobenzydyną (DAB). Analiza obszaru wstrzyknięcia może być również przeprowadzona za pomocą barwienia histologicznego i immunohistochemicznego. W ten sposób wykazano, że wcześniej badane żele macierzy osierdziowej i mięśnia sercowego tworzą włókniste, porowate sieci i promują angiogenezę w obszarze wstrzyknięcia.

Opisano metody przygotowania wstrzykiwalnego żelu macierzy z tkanki decelularyzowanej oraz jego wstrzykiwania do mięśnia sercowego szczura in vivo.

Wytwarzanie biologicznych materiałów wstrzykiwalnych do inżynierii tkankowej mięśnia sercowego

Niniejszy protokół przedstawia metody przygotowania wstrzykiwalnego żelu z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) do zastosowań w inżynierii tkankowej mięśnia sercowego. ...

Żele macierzy wytwarzane z decelularyzowanej tkanki osierdziowej i mięśniowej zachowują natywne składniki macierzy pozakomórkowej, w tym różnorodne białka, peptydy i glikozaminoglikany. Macierze tkankowe te mogą być wykorzystywane w inżynierii tkankowej. W tym filmie żele macierzy są wytwarzane poprzez decelularyzację tkanki osierdziowej w celu uzyskania acellularnej macierzy pozakomórkowej.Następnie macierz zewnątrzkomórkową poddaje się obróbce w celu stworzenia rozpuszczalnej wersji w formie cieczy. W kolejnym kroku rozpuszczalną macierz testuje się na modelu małych zwierząt, aby ocenić jej przydatność jako rusztowania do wstrzykiwania. Analiza histologiczna i immunohistochemiczna wykazuje, że in vivo wstrzyknięty materiał tworzy porowate włókniste rusztowanie, które umożliwia infiltrację komórek naczyniowych.Witajcie, nazywam się Sonia Zeki. Jestem doktorantką w laboratorium dr Karen Chrisman na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Diego. Dzisiaj przygotujemy solubilizowaną macierz zewnątrzkomórkową (sECM) z tkanki zdecelularyzowanej i zaprezentujemy testy in vivo w zastosowaniach z zakresu inżynierii tkankowej serca.Techniki te są istotne dla opracowania terapii z wykorzystaniem wstrzykiwalnego biomateriału w leczeniu niewydolności serca. Procedurę chirurgiczną po zawale mięśnia sercowego zaprezentuje Pam, neurochirurg weterynaryjny w naszym laboratorium. Zatem zacznijmy.Protokół należy rozpocząć od decelularyzacji tkanki w celu pozostawienia samej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). W pierwszej kolejności osierocze osierdzie świni należy umieścić w zlewce z wodą dejonizowaną i przemyć, mieszając przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po przemyciu tkankę należy umieścić w 1× PBS zawierającym 1% SDS oraz 1% penicyliny i streptomycyny i mieszać nieprzerwanie przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Następnego dnia tkankę należy ponownie umieścić w wodzie dejonizowanej i mieszać nieprzerwanie przez pięć godzin, wstrząsając w probówce 50 ml aż do całkowitego usunięcia piany.Barwienie hematyną i eozyną powinno wykazać brak jąder komórkowych w tkance zdecelularyzowanej. Umieścić pozostałą część zdecelularyzowanej tkanki w stożkowej probówce o pojemności od 15 do 50 ml. Następnie umieścić tkankę w zamrażarce o temperaturze -80 °C.Liofilizuj zamrożone próbki poprzez suszenie mrozowe pod bardzo niskim ciśnieniem i w bardzo niskiej temperaturze aż do całkowitego wyschnięcia. W zależności od zastosowanego systemu i zawartości wody w próbkach, proces ten może trwać od 12 do 72 godzin. Po całkowitym wysuszeniu zdecelularyzowanej tkanki przenieś ją do młyna Wiley Minim.Używając sita o gęstości oczek 40 gauge, rozetrzyj tkankę na drobny proszek. Gdy większość próbki przejdzie przez filtr, wyjmij naczynie zbiorcze. Próbka ta jest odtąd nazywana proszkiem z macierzy zewnątrzkomórkowej lub proszkiem ECM.W tym momencie można przeprowadzić drugi etap liofilizacji, jeżeli nie przechodzi się niezwłocznie do kolejnego kroku. Zapewnia to dokładność odważonej masy niezbędnej do rozpuszczenia ECM. Odważ pożądaną ilość proszku ECM do sterylnej fiolki.Dodać sterylnie filtrowany roztwór chlorku wodoru o stężeniu 1 mg/mL Pepcid do fiolki scyntylacyjnej z proszkiem ECM, tak aby stężenie ECM wynosiło 10 mg/mL. Włożyć mieszadło magnetyczne i umieścić fiolkę na mieszalce magnetycznej.Mieszać nieprzerwanie od 48 do 60 godzin, okresowo zgarniając ze ścianek fiolki resztki za pomocą sterylnej łyżki lub szpatułki WHE. Należy to robić, aby zapewnić trawienie całego proszku ECM. W miarę trawienia ECM będzie on przechodzić do roztworu.Po upłynnieniu ECM umieść próbkę w lodzie i dostosuj pH do wartości 7,4, używając wodorotlenku sodu oraz kwasu solnego. Po skorygowaniu pH dodaj 10x PBS w taki sposób, aby końcowe stężenie roztworu wynosiło 1x PBS. Na przykład, jeśli dysponujesz 900 µL roztworu ECM, po regulacji pH należy dodać 100 µL 10x PBS.Wyznacz stężenie zsolubilizowanego roztworu ECM, sumując objętości dodane w celu neutralizacji oraz objętości pobrane do pomiaru pH. Następnie dodaj PBS (1×), aby osiągnąć pożądane stężenie końcowe: 6 mg/mL.W dniu operacji przygotuj 75 µL wstrzyknięcia rozpuszczonej ECM w strzykawce 0,1 mL z igłą o rozmiarze 30 G. Utrzymaj znieczulenie intubowanej samicy szczura rasy Harlan dolly za pomocą 2,5% izofluranu. Podaj lek do oka, a następnie zweryfikuj głębokość znieczulenia, wykonując test uciśnięcia palca u stopy.Podaj trzy mililitry roztworu Ringera z mleczanem drogą podskórną w dolnej części brzucha w celu nawodnienia. Następnie ułóż zwierzę w pozycji tyłem na stole operacyjnym i delikatnie przymocuj kończyny taśmą. Użyj trymera do usunięcia włosów z brzucha, a następnie wciągnij luźną sierść odkurzaczem.Wykonaj serię wstrzyknięć lidokainy 2% w objętości 50 µL wzdłuż przekątnej od wyrostka miecza do dolnej prawej strony brzucha. Następnie przemyj obszar trzykrotnie Betadyną, zaczynając od środka i przesuwając się na zewnątrz. Powtórz przemywanie za pomocą alkoholu izopropylowego.Następnie przykryj zwierzę polem chirurgicznym z gotowym okrągłym otworem. Zabeziecz pole chirurgiczne. Użyj skalpela nr 10.Wykonaj nacięcie o długości od trzech do czterech centymetrów od wyrostka mieczowatego do dolnej prawej strony brzucha. Zlokalizuj wyrostek mieczowaty i dokonaj pionowej dyssekcji przez mięśnie w kierunku prawym, uważając, aby nie uszkodzić dużego naczynia po prawej stronie. Następnie za pomocą nożyczek przetnij mięśnie w kierunku bocznym, odsłaniając przeponę.Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić wątroby, używając 36 calowego odcinka nici chirurgicznej Vicryl 3-0 oraz pary kleszczyków hemostatycznych. Przeciągnij jedną igłę przez wyrostek mieczowaty i wyciągnij nić do połowy. Zlep końce nici taśmą i przymocuj je do punktu nad zwierzęciem i za nim, unosząc wyrostek mieczowaty i odsłaniając przeponę za pomocą kolejnego 36 calowego odcinka nici Vicryl 3-0.Przewlecz igłę przez mięsień znajdujący się najbliżej wyrostka mieczowatego, a następnie wyciągnij ją i przymocuj koniec do innego punktu po prawej stronie stołu operacyjnego, aby w pełni odsłonić jamę chirurgiczną. Następnie, używając małej mikro-pincety typu rat tooth, chwyć środek przepony, wyciągnij go i wykonaj bardzo małe nacięcie tępymi nożyczkami. Po wykonaniu tego otworu płuca zostaną cofnięte.Wykonaj nacięcie o długości od dwóch do trzech centymetrów pionowo przez przeponę, aby uwidocznić serce. Następnie wprowadź trzymilowy wymaz po lewej stronie jam ciała i odsunie płuca. Przymocuj wymaz w tej pozycji za pomocą kleszczyków ręcznikowych.Używając innego wymazu, odsuń prawe płuco, aby zlokalizować worek osierdzia. Następnie, używając mikro pincety oraz dużych pincet z ząbkami, przerwij worek osierdzia, odsłaniając wierzchołek serca. Chwyć wierzchołek serca prawą mikro pincetą z ząbkami i wprowadź igłę w celu wstrzyknięcia rozpuszczonej macierzy, kierując ściętym końcem igły w lewo.W odległości jednej trzeciej od wierzchołka, równolegle do powierzchni epikardialnej. Należy uważać, aby nie uszkodzić żyły wieńcowej przedniej. Wstrzyknąć rozpuszczony żel matrycowy i odczekać kilka sekund przed wyjęciem igły.Tkanka w miejscu wstrzyknięcia powinna wybielić; należy odsączyć krew z jamy ciała, a następnie za pomocą zakrzywionych mikrohemostatów usunąć kleszczyki i tampon trzymający prawe płuco. Wykonać początkowy węzeł, używając 30 calowej nitki z prolinu 5-0. Następnie za pomocą mikro pincety z ząbkami zaszyć przeponę szwem ciągłym i igłą stożkową, a następnie całkowicie zamknąć otwór. Wprowadzić rurkę ssącą PE 1 60 i zamknąć wokół niej, używając strzykawki 10 ml w celu ewakuacji treści z jamy klatki piersiowej.W miarę zaciśkania szwu przepona powinna być wklęsła. Zredukuj stężenie fluorynu do 1%. Usuń oba szwy 3-0 Vicryl utrzymujące jamę w otwarciu. Nawodnij mięsień, usuwając nadmiar płynu za pomocą tamponu lub sterylnej gazy.Użyj nowego odcinka nici chirurgicznej 3-0, aby zamknąć warstwę mięśniową za pomocą szwów przerywanych. Następnie wyłącz podawanie izofluranu. Oczyść obszar i użyj zszywacza skórnego do zamknięcia skóry.Następnie nałożyć potrójną maść antybiotykową w miejscu ncięcia. Pozostawić szczura do wybudzenia w atmosferze 100% oxygen. Gdy zwierzę zacznie oddychać samodzielnie poza respiratorem, usunąć rurkę intubacyjną z tchawicy.Gdy zwierzę odzyska zdolność poruszania się, podać podskórnie dawkę 0,05 mg/kg buprenorfiny hydrochloride jako środek przeciwbólowy, a następnie umieścić je w klatce domowej na sterylnym ręczniku. Tkankę serca szczurów, którym wstrzyknięto rozpuszczalne żele matrycowe, przekrojono i wybarwiono hematoksyliną i eozyną w celu przeprowadzenia makroskopowej analizy tkankowej w różnych punktach czasowych. Po operacji, w wczesnych punktach czasowych, miejsce wstrzyknięcia wygląda jak różowa sieć włóknista, która w późniejszych punktach czasowych rozprzestrzenia się śródmiąższowo.Napływ komórek obserwuje się po dwóch tygodniach. Widoczna jest degradacja wstrzykniętej macierzy. Jeśli ECM została oznakowana biotyną przed wstrzyknięciem, można ją zwizualizować bardziej bezpośrednio, barwiąc biotynę streptawidyną sprzężoną z HRP, aby zobrazować wrastanie i formowanie się naczyń w obszarze wstrzyknięcia macierzy.Przedstawione preparaty zostały poddane barwieniu współbieżnemu z użyciem fitry. Wykorzystano koniugat selektyny wiążącej się z komórkami śródbłonka, widoczny w kolorze zielonym, oraz przeciwciało przeciwko aktynie mięśni gładkich, widoczne w kolorze czerwonym. W pobliżu miejsca iniekcji można również zidentyfikować komórki macierzyste.Zostały one zwizualizowane za pomocą barwienia immunohistochemicznego na C kit. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować solubilizowaną ECM z odkomórkowanej tkanki i przetestować ją in vivo w zastosowaniach inżynierii tkanki serca. Należy pamiętać, że choć w tym przypadku wykorzystano tkankę osierdzia, tę ogólną procedurę można zmodyfikować tak, aby można było ją zastosować z dowolnym źródłem tkanki.Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

fabrication-biologically-derived-injectable-materials-for-myocardial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wytwarzanie biologicznie pochodnych materiałów wstrzykiwanych do inżynierii tkanki mięśnia sercowego

W niniejszej pracy przedstawiamy sposób wytwarzania konstruktów tkankowych na bazie kolagenu zawierających mioblasty szkieletowe. Te trójwymiarowe konstrukty inżynieryjne mogą być wykorzystywane do zastępowania lub naprawy tkanek in vivo. Na potrzeby naszych badań zaprojektowaliśmy je jako przekaźnik elektryczny przedsionkowo-komorowy do leczenia całkowitego bloku serca[1].

Wytwarzanie inżynieryjnych konstruktów tkanki mięśniowej

Generowanie wyrównanej tkanki mięśnia sercowego jest kluczowym wymogiem dla dostosowania najnowszych osiągnięć w biologii komórek macierzystych do klinicznie użytecznych celów. W tym artykule opisujemy podejście do druku mikrokontaktowego w celu precyzyjnej kontroli kształtu i funkcji komórki. Korzystając z wysoce oczyszczonych populacji embrionalnych komórek progenitorowych serca pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych, generujemy anizotropową funkcjonalną tkankę mięśnia sercowego.

Generowanie wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego poprzez drukowanie mikrokontaktowe

Aby stworzyć wysoce zorganizowane struktury złożonej tkanki, należy złożyć wiele typów materiałów i komórek w zintegrowany kompozyt.  Ten kombinatoryczny projekt obejmuje warstwowe arkusze komórek specyficzne dla narządów z dwoma odrębnymi materiałami pochodzenia biologicznego, zawierającymi silną włóknistą podstawę macierzy oraz komórki śródbłonka w celu usprawnienia tworzenia nowych naczyń.

Inżynieria tkankowa: budowa wielokomórkowego rusztowania 3D do dostarczania warstwowych arkuszy komórkowych

Ten protokół ma na celu złagodzenie ograniczeń związanych z nieprawidłowym przeszczepem komórek macierzystych w leczeniu zawałów mięśnia sercowego za pomocą systemu hydrożelowego i kleju na bazie fibryny. Dzięki takiemu podejściu można utrzymać kontakt komórka-tkanka po zawale choroby, zwiększając potencjał terapeutyczny korzystnych środków w miejscu urazu.

Konstrukt hydrożelowy i podejście oparte na kleju na bazie fibryny w celu dostarczania leków w mysim modelu zawału mięśnia sercowego.

Ten manuskrypt opisuje tworzenie zdefiniowanych tkanek serca za pomocą ekspresji markerów powierzchniowych i sortowania komórek. Zdefiniowane tkanki mogą być następnie wykorzystane w bioreaktorze wielotkankowym do zbadania mechanizmów terapii komórkami serca w celu zapewnienia funkcjonalnego, a jednocześnie kontrolowanego systemu modelowego ludzkiego serca.

Budowa zdefiniowanych tkanek serca zaprojektowanych przez człowieka w celu zbadania mechanizmów terapii komórkami serca

Ten protokół opisuje wytwarzanie elastycznych makroporowatych mikrokriożeli 3D poprzez integrację mikrofabrykacji z technologią kriożelacji. Po załadowaniu komórkami generowane są mikrotkanki 3D, które można łatwo wstrzyknąć in vivo w celu ułatwienia terapii regeneracyjnej lub złożyć w matryce do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków in vitro.

Mikrotkanki 3D do iniekcyjnej terapii regeneracyjnej i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków

Ten protokół opisuje całkowitą decelularyzację ludzkiego mięśnia sercowego przy jednoczesnym zachowaniu jego składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Dalsze przetwarzanie macierzy zewnątrzkomórkowej powoduje produkcję mikrocząstek i cytoprotekcyjnego hydrożelu samoorganizującego się.

Przetwarzanie ludzkiej tkanki serca w kierunku samoorganizującego się hydrożelu macierzy zewnątrzkomórkowej do zastosowań in vitro i in vivo

Obecny protokół generuje siatkowe tkanki serca zawierające komórki sercowo-naczyniowe pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, aby umożliwić badanie terapii implantacji komórek w chorobach serca.

Przygotowanie zmodyfikowanych tkanek serca w kształcie siatki pochodzących z ludzkich komórek iPS do naprawy mięśnia sercowego in vivo

Terapia oparta na komórkach macierzystych pojawiła się jako skuteczna strategia naprawy uszkodzonych tkanek serca po zawale mięśnia sercowego. Zapewniamy optymalną aplikację in vivo do przeszczepu komórek macierzystych przy użyciu hydrożeli żelatynowych, które mogą być sieciowane enzymatycznie.

Domięśniowe przeszczepienie hydrożeli iniekcyjnej obciążających MSC po zawale mięśnia sercowego w modelu mysim

Trójwymiarowe tkanki serca bioinżynieryjne wykorzystujące kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych okazały się obiecującymi modelami do badania zdrowego i chorego ludzkiego mięśnia sercowego in vitro, jednocześnie podsumowując kluczowe aspekty rodzimej niszy sercowej. Manuskrypt ten opisuje protokół wytwarzania i analizy zmodyfikowanych tkanek serca o wysokiej zawartości wygenerowanych z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Projektowanie bioreaktora w celu usprawnienia pozyskiwania danych i modelowania przepustowości zmodyfikowanych tkanek serca

Przedstawiono powtarzalną metodę generowania 3D tkanek mięśnia sercowego, łączących rusztowania polikaprolaktonu (PCL) i hydrożele fibrynowe pochodzące z hiPSC. Technika ta zapewnia precyzyjną kontrolę nad architekturą rusztowania i może być stosowana w przedklinicznych testach leków i modelowaniu chorób serca.

Generowanie 3D ludzkiej tkanki mięśnia sercowego przy użyciu elektroprzędzenia stopionego zapisu rusztowań polikaprolaktonowych i komórek serca pochodzących z hiPSC

Poznaj metodę wytwarzania żeli macierzowych z dekompozycyjnej tkanki osierdziowej i ich zastosowanie w inżynierii tkankowej mięśnia sercowego szczura. Technika ta umożliwia tworzenie wstrzykiwalnych rusztowań wspierających regenerację tkanek.

Wytwarzanie biologicznych materiałów wstrzykiwalnych do inżynierii tkankowej mięśnia sercowego

Przeglądaj więcej filmów