Badanie wpływu heterogeniczności komórek glejowych na wzrost aksonów z wykorzystaniem nowej metody kokultury

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie wpływu heterogeniczności glejowej na wzrost aksonów i przeżywalność komórek DRG. Jest to realizowane poprzez wstępne wyizolowanie komórek glejowych z kory mózgu noworodka szczura. Drugim krokiem procedury jest hodowla i oczyszczanie neuronów DRG z embrionu szczura.

Trzecim krokiem procedury jest dodanie oczyszczonych neuronów DRG do komórek glio. Ostatnim etapem procedury jest obserwacja wzrostu aksonów w hodowli komórkowej oraz przeprowadzenie barwienia komórek i analizy ilościowej. W końcowym etapie można uzyskać wyniki.

Wykazano, że wzrost neuronów z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) jest pod wpływem heterogenicznych komórek glejowych, co udowodniono za pomocą rejestracji time-lapse oraz mikroskopii immunofluorescencyjnej. Dzień dobry, reprezentuję laboratorium Neuro Imaging w Katedrze Neurologii na UCRA. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę badania heterogenicznego wpływu komórek glejowych na wzrost w nowej metodzie hodowli neuronów.

W naszym laboratorium stosujemy tę nową metodę do badania interakcji między neuronami a komórkami glejowymi. Przejdźmy zatem do badania. Aby ustanowić kokulturę gleju i neuronów zwojów korzeni grzbietowych (DRG), rozpoczniemy od hodowli komórek glejowych w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Dno wysterylizowanych płytek hodowlanych z 24 dołkami wyścielamy wysterylizowanymi okrągłymi szkiełkami podstawkowymi, a następnie szkiełka w dołkach płytki hodowlanej z sześcioma dołkami pokrywamy polilizyną i inkubujemy przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.

Opłucz szkiełka nakrywkowe i płytki hodowlane dwukrotnie wodą destylowaną, a następnie wysusz je na powietrzu. Następnie pipetuj 200 µL lub 2 mL zmodyfikowanej pożywki Eagle'a (DMEM) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do każdej studni płytki 24-dołkowej lub 6-dołkowej, odpowiednio. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 do następnego dnia.

Zesterylizuj komorę do mikrodysekcji z pozytywnym przepływem powietrza. Włącz lampę UV na 20 minut, a następnie spryskaj wszystkie powierzchnie pod komorą 70% etanolem i odczekaj 15 minut przed użyciem. Rozpocznij pracę od głów dwóch szczurząt w wieku od P2 do P6, które zostały znieczulone metodą hipotermii.

Następnie dokonuje się dekapitacji u podstawy otworu wielkiego (foramen magnum) za pomocą nożyczek chirurgicznych. Czaszkę otwiera się wzdłuż szwu strzałkowego, używając nożyczek irydowych, a następnie usuwa się sklepienie czaszki. Przedmózgowie należy wyjąć i umieścić w schłodzonym medium Levo's L 15, a następnie powtórzyć procedurę z drugą głową.

Następnie, pracując pod mikroskopem stereoskopowym, ostrożnie usuń oponę twardą oraz błony i naczynia krwionośne pokrywające mózg. Wyizoluj korę i przemyj ją kilkukrotnie pożywką L 15.

Za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych podziel korę na małe fragmenty. Następnie inkubuj w medium L 15 zawierającym 0,125% tripsyny w EDTA w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Następnie przenieś bloki tkankowe do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml DMEM z 20% FBS.

Dodaj DS do stężenia końcowego 10 µg/mL. Następnie użyj pipety Pasteura wypalanej w ogniu, aby zamieszać roztwór tkankowy około 20 razy w celu rozdzielenia komórek. Na koniec przemyj komórki raz pożywką DMEM zawierającą 10% FBS i określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru.

Następnie wysiej komórki w zagęszczeniu od 5, 000 do 10, 000 komórek na centymetr kwadratowy i inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Wymieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu, aby wyizolować, oczyścić i hodować DRGs. Najpierw przygotuj płytki 24-dołkowe z szklanymi szkiełkami podstawkowymi pokrytymi polilizyną, zgodnie z wcześniejszą instrukcją.

Do każdego szkiełka podstawowego dodaj 100 µL pożywki NVF i inkubuj płytki w temperaturze 37 °C do następnego dnia. Zesterylizuj komorę z laminarnym przepływem powietrza w sposób opisany wcześniej. Następnie rozpocznij pracę z embrionami szczura w stadium od E 12 do E 15, które zostały wyizolowane pod mikroskopem stereo z macicy ciężarnej szczurzycy uśmierconej dwutlenkiem węgla.

Wyizolować rdzenie kręgowe wraz z połączonymi z nimi zwojami korzeni grzbietowych i przenieść je do szalek 35 mm zawierających schłodzoną pożywkę L 15. Za pomocą pęsety mikrochirurgicznej ostrożnie oddzielić połączone zwoje korzeni grzbietowych od rdzeni kręgowych w schłodzonej pożywce L 15, odcinając połączone aksony w sposób nieuszkadzający zwojów.

Zazwyczaj z jednego rdzenia kręgowego izoluje się od 20 do 30 zwojów rdzeniowych (DRG) po wyizolowaniu wszystkich DRG z rdzeni kręgowych. Wszystkie wyizolowane DRG należy inkubować w 0,125% trypsynie w EDTA przez 20 minut w temperaturze 37°C i 5% CO2. Komórki należy przepłukać raz w DMEM z 20% FBS, a następnie dodać DNA i kilkukrotnie pipetować za pomocą wypalanej pipety pasterskiej, aby utworzyć jednorodną zawiesinę komórkową, tak jak pokazano w przypadku komórek glejowych. Należy przeprowadzić drugie przemycie w medium MBF, policzyć komórki, a następnie wysiać je na przygotowane szkiełka podstawowe w płytkach 24-dołkowych w zagęszczeniu 5 000 komórek na dołek i inkubować przez noc w celu oczyszczenia neuronów DRG.

Od 18 do 24 godzin po wysianiu. Po 72 godzinach wymienić medium na medium neurobasalne zawierające 20 µM 5-fluoro-2'-deoksyurydyny. Wymienić połowę medium na medium neurobasalne bez FUDR.

Następnie medium wymienia się co drugi dzień. Około 20 dni po wysianiu komórek glejowych osiągną one konfluencję i będą gotowe do kokultury z neuronami na 24 godziny przed połączeniem obu typów komórek.

Zastąp pożywkę dla komórek glejowych pożywką MBF. Przygotuj zawiesinę pojedynczych komórek z oczyszczonych zwojów korzeni grzbietowych (DRG) zgodnie z wcześniej zaprezentowaną metodą. Określ gęstość komórek.

Następnie wysiej neurony na komórki glejowe w zagęszczeniu 500 komórek na centymetr kwadratowy. Przeżywalność neuronów i wzrost neurytów na komórkach glejowych można analizować w różnych punktach czasowych, wykorzystując oprogramowanie do analizy obrazu oraz immunochemię z użyciem przeciwciał specyficznych dla danego typu komórek. Oto przykłady komórek glejowych i neuronów z zwojów korzeniowych tylnych (DRG) hodowanych osobno oraz w ko-kulturze; komórki glejowe osiągają konfluencję po 20 dniach.

W hodowli. Pod mikroskopem fazokontrastowym wyraźnie widać było, że różne subpopulacje komórek glejowych tworzą odmienne wzorce wzrostu i morfologie. Analiza immunocytochemiczna wykazała, że astrocyty wykazujące ekspresję GFAP stanowiły ponad 90% hodowli.

Stosując naszą metodę traktowania FUDR przez 72 godziny, czystość neuronów z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) osiągnie poziom do 99% w ciągu sześciu dni; komórki te wykażą swoją charakterystyczną morfologię z wysoką gęstością wzrostu neurytów w kokulturze neuronów i komórek glejowych. Adhezja neuronów DRG oraz wzrost neurytów następowały sprawnie na komórkach glejowych w ciągu czterech godzin od wysiewu. Adhezja neuronów i wzrost neurytów były zależne od subpopulacji komórek glejowych, które tworzą specjalne podstruktury wzorców wzrostu, możliwe do łatwej identyfikacji pod mikroskopem fazowo-kontrastowym. Za pomocą immunocytochemii pokażę Państwu, jak prowadzić kokulturę neuronów DRG z komórkami glejowymi, aby zbadać wpływ heterogeniczności komórek glejowych na wzrost neuronów.

Podczas przeprowadzania tej procedury bardzo ważne jest, aby obchodzić się z tkanką niezwykle delikatnie i utrzymywać komórki w medium. Nigdy nie wystawiaj ich na działanie powietrza i nie dopuszczaj do ich wyschnięcia. To wszystko.

Dziękujemy za obejrzenie materiału i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.