Name: Badanie wpływu heterogeniczności komórek glejowych na wzrost aksonów przy użyciu nowej metody kokultury (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Poznaj metodę kokultury do badania wpływu heterogeniczności komórek glejowych na wzrost aksonów neuronów DRG szczura. Technika ta pozwala analizować adhezję i wzrost neuritów w kontrolowanych warunkach in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to zostało wsparte przez fundację FMMU new finding foundation oraz częściowo z funduszy NIH.

1. Hodowla komórek glejowych
Komórki glejowe można hodować z różnych obszarów ośrodkowego układu nerwowego. Cały proces przedstawiono na schemacie procesu.
<img src="/files/ftp_upload/2111/2111process.jpg" alt="Schemat kokultury gleju i zwojów korzeniowych tylnych (DRG): przedstawia proces izolacji komórek, trawienia oraz wpływ na wzrost neuronów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Proces 1">
Dzień 1 Powlekanie płytek hodowlanych i szkiełek nakrywkowych
<ol>
	<li>Wysuszyć wysterylizowane szklane okładki mikroskopowe w autoklawie.</li>
	<li>Umieścić wysterylizowane okładki w sterylnej 24-dołkowej płytce hodowlanej.</li>
	<li>Pokryć okładki poli-lizyną i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pokryć 6-dołkowe płytki hodowlane w ten sam sposób, co w kroku 3.</li>
	<li>Przemyć okładki oraz 6-dołkową płytkę hodowlaną dwukrotnie wodą destylowaną i wysuszyć strumieniem powietrza w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
	<li>Dodać 20 μL pożywki DMEM (z 10% FBS) do każdego dołka w płytce 24-dołkowej oraz 2 mL do każdego dołka w płytce 6-dołkowej, a następnie umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2</li>
</ol>
Dzień 2 Izolowanie kory i hodowla komórek glejowych
<ol>
	<li>Zdezynfekuj komorę do preparatyki tkanek (positive flow dissection hood).</li>
	<li>Włącz lampę UV na 20 min.</li>
	<li>Spryskaj wszystkie powierzchnie 70% etanolem i odczekaj 15 min przed użyciem.</li>
	<li>Zanurz młode szczury (P2-P6) w anestezji poprzez hipotermię, a następnie dokonaj dekapitacji u podstawy otworu wielkiego (foramen magnum) za pomocą nożyc operacyjnych.</li>
	<li>Otwórz czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego za pomocą nożyczek irydowych i odchyl kości czaszki.</li>
	<li>Usuń przedmózowie i umieść go w schłodzonym medium L15; pod stereomikroskopem ostrożnie oczyść oponę twardą i miękką wraz z naczyniami krwionośnymi, wyizoluj korę mózgową i kilkakrotnie przemyj medium L15.</li>
	<li>Pokrój korę mózgową na małe fragmenty za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych.</li>
	<li>Dodaj 0,125% trypsyny-EDTA przygotowanej w medium L15 do fragmentów kory i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 15 min.</li>
	<li>Przenieś bloki tkanki do probówki 50 mL zawierającej 20 mL medium DMEM z 20% FBS, dodaj roztwór zapasowy DNazy do stężenia końcowego 10 µg/mL, aspiruj zawiesinę tkankową góra-dół 20 razy za pomocą wypalanej szklanej pipety Pasteura, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.</li>
	<li>Przemyj zawiesinę komórkową raz medium DMEM, resuspenduj komórki w DMEM z 10% FBS, policz komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru i wysiej komórki w zagęszczeniu 50-100/cm2. Hoduj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2, wymieniając połowę medium 2 razy w tygodniu.</li>
</ol>
2. Izolacja, hodowla i oczyszczanie neuronów z zwojów korzeni grzbietowych
Dzień 1 Przygotowanie materiału hodowlanego
<ol>
	<li>Pokryć sterylizowane szkiełka nakrywki poli-lizyną, dwukrotnie przemyć szkiełka wodą destylowaną i wysuszyć na powietrzu, a następnie umieścić je w płytkach 24-dołkowych.</li>
	<li>Dodać 10μL pożywki Neurobasal z 2% B27 i 2.5S NGF (50 ng/mL), a następnie włożyć płytkę do inkubatora w temperaturze 37 stopni z 5% CO2.</li>
</ol>
Dzień 2 Izolacja zwojów korzeni grzbietowych (DRG) z embrionów
<ol>
	<li>Sterylizację komory z laminarnym przepływem powietrza przeprowadzono w taki sam sposób, jak w przypadku hodowli komórek glejowych.</li>
	<li>Hipotermicznie uśmiercono ciężarną szczurzycę (E15) poprzez przedawkowanie CO2, zdezynfekowano brzuch 70% etanolem, a następnie wyizolowano zarodki z macicy i przeniesiono je do schłodzonego medium L15.</li>
	<li>Pod stereomikroskopem wyizolowano rdzenie kręgowe wraz z połączonymi zwojami korzeni grzbietowych i przeniesiono je do naczyń 35mm z schłodzonym medium L15.</li>
	<li>Przygotowano zawiesinę pojedynczych komórek i przepłukano ją raz medium NBF (medium Neurobasal zawierające 2% B27 oraz 2.5S NGF (50 ng/mL)).</li>
</ol>
Dzień 3 Oczyszczanie neuronów z DRG
<ol>
	<li>18–24h po wysianiu neuronów dodać do hodowli neuronów skoncentrowany roztwór zapasu FUDR o stężeniu 1 mM, aby uzyskać stężenie końcowe 20 μM i objętość końcową 20 μL.</li>
	<li>72h później wymienić połowę medium na medium Neurobasal zawierające 2% B27 oraz 2.5S NGF (50ng/mL) bez FUDR. Następnie wymieniać medium co drugi dzień.</li>
</ol>
3. Kokultura neuronów DRG z komórkami glejowymi
<ol>
 <li>Gdy hodowla komórek glejowych osiągnęła konfluencję (około 20 dni po wysianiu), były one gotowe do kokultury z neuronami.</li>
	<li>Na 24 godziny przed dodaniem oczyszczonych neuronów zmieniono medium komórek glejowych na medium Neurobasal zawierające 2% B27 i 2.5S NGF (50 ng/mL).</li>
	<li>Oczyszczone neurony zebrano z dołków hodowlanych; zawiesinę pojedynczych komórek uzyskano poprzez mechaniczne przejście przez wypalaną pipetę Pasteura.</li>
	<li>Po przeliczeniu liczby komórek, neurony wysiano w gęstości 500/cm2 na konfluentne komórki glejowe w medium Neurobasal zawierającym 2% B27 i 2.5S NGF (50ng/mL).</li>
	<li>Adhezję neuronów oraz wzrost neurytów na komórkach glejowych można było rejestrować i analizować w różnych punktach czasowych za pomocą oprogramowania do analizy obrazu oraz immunocytochemii z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych dla danego typu komórek.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
<ol>
	<li>Kultura komórek glejowych: Po wysianiu komórki glejowe osiągają konfluencję około 20. dnia. W badaniu pod mikroskopem fazokontrastowym łatwo było zidentyfikować, że różne morfologiczne subpopulacje komórek glejowych tworzą odmienne podstruktury wzorca wzrostu, a astrocyty wykazujące pozytywną reakcję na GFAP stanowiły ponad 90%, co wykazano techniką immunocytochemiczną (Rysunek 1, Rysunek 2).</li>
	<li>Kultura neuronów z DRG: W zastosowanej metodzie, po 72-godzinnej inkubacji z FUDR, czystość neuronów z DRG osiąga poziom do 9% w ciągu 6 dni; neurony z DRG wykazały charakterystyczną morfologię oraz wysoką gęstość wzrostu neurytów (Rysunek 3, Rysunek 4).</li>
	<li>Kokultura komórek glejowych i neuronów: Adhezja neuronów z DRG oraz wypustki neurytów rozwijały się sprawnie na komórkach glejowych w ciągu 4 godzin od wysiania; dokładne obserwacje wykazały, że adhezja neuronów i wzrost neurytów były zależne od subpopulacji komórek glejowych tworzących specjalne podstruktury wzorca wzrostu, co można było łatwo zidentyfikować pod mikroskopem fazokontrastowym oraz za pomocą immunocytochemii (Rysunek 5, Rysunek 6).</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig1.jpg" alt="Obraz mikroskopowy z hodowli komórkowej przedstawiający fibroblasty do badania i analizy tkanek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rycina 1. Morfologia konfluencyjnych komórek glejowych. Komórki glejowe kory mózgu wysiano na szkiełka podstawkowe pokryte polilizyną i hodowano przez 20 dni; zwróć uwagę na różny wzorzec wzrostu komórek glejowych – komórki po lewej stronie są rozmieszczone promieniście.
<img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig2.jpg" alt="Obraz mikroskopowy tkanki nerwowej przedstawiający zabarwione na czerwono włókna do badania struktury komórkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rycina 2. Konfluentne komórki glejowe znakowane przeciwciałem przeciwko gliałemu kwaśnemu białku włóknistemu (GFAP). Zwróć uwagę na promienisty układ komórek wykazujących pozytywną reakcję na GFAP (czerwone) po prawej stronie.
<img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig3.jpg" alt="Kiełkowanie zarodników grzybów pod mikroskopem, wykazujące połączenia wzrostu strzępek nitkowatych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rysunek 3. Neurony z zwojów korzeni grzbietowych uległy wzrostowi in vitro bez zastosowania FUDR. Zanieczyszczające komórki stanowiły tło dla neuronów zzęłów korzeni grzbietowych (DRG).
<img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig4.jpg" alt="Obraz mikroskopowy z hodowli komórkowej przedstawiający fibroblasty, przydatny do badania wzrostu i morfologii komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> Rycina 4. Neurony z zwojów korzeni grzbietowych uległy wzrostowi in vitro po zastosowaniu FUDR. Zanieczyszczające tło komórkowe zostało całkowicie wyeliminowane.
<img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig5.jpg" alt="Hodowla komórkowa pod mikroskopem; wzorzec wzrostu komórek w badaniach biologicznych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> Rysunek 5. Neurony zwojów korzeni grzbietowych hodowane na komórkach glejowych. Adhezja neuronów i wzrost neurytów zostały zahamowane na napromieniowanych uporządkowanych komórkach oraz ograniczone na komórkach glejowych po prawej stronie.
<img src="/files/ftp_upload/2111/2111fig6.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej neuronów, przedstawiający jądra komórkowe i dendryty, do badania sieci neuronalnych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> Rysunek 6. Neurony z zwojów korzeni grzbietowych rosnące na komórkach glejowych znakowanych przeciwciałem przeciwko neurofilamentom. Wzrost neurytów (zielone) został zahamowany w obrębie napromieniowanych komórek glejowych po lewej stronie i ograniczony po prawej stronie; wszystkie komórki glejowe zostały znakowane przeciwciałem anty-GFAP (czerwone).

<ol><li>Rossignol, S., Schwab, M., Schwartz, M., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury%3A+time+to+move%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury: time to move?</a> J Neurosci. 27 (44), 11782-11792 (2007).</li>
<li>Yiu, G., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+inhibition+of+CNS+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial inhibition of CNS axon regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li>
<li>Matyash, V., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+astrocyte+morphology+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology.</a> Brain Res Rev. , (2009).</li>
<li>Wanner, I. B., Deik, A., Torres, M., Rosendahl, A., Neary, J. T., Lemmon, V. P., Bixby, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro+model+of+the+glial+scar+inhibits+axon+growth.+Glia%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth. Glia.</a> 56 (15), 1691-1709 (2008).</li>
<li>Kuffler, D. P., Sosa, I. J., Reyes, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+chondroitin+sulfate+proteoglycan+inhibits+dorsal+root+ganglion+neuron+neurite+outgrowth+and+substrate+specificity+via+a+soma+and+not+a+growth+cone+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Schwann cell chondroitin sulfate proteoglycan inhibits dorsal root ganglion neuron neurite outgrowth and substrate specificity via a soma and not a growth cone mechanism.</a> J Neurosci Res. 87 (13), 2863-2871 (2009).</li>
<li>Kleitman, N., Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+culture+method+for+the+study+of+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Culturing+nerve+cells%22%5BJournal%5D)">Tissue culture method for the study of myelination.</a> Culturing nerve cells. , P559-P559 (1998).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Protokół tego eksperymentu został opracowany w celu realizacji dwóch założeń badawczych dotyczących komórek glejowych, a w szczególności wpływu heterogeniczności astrocytów na adhezję neuronów i wzrost neurytów. Pierwszym celem było maksymalne zachowanie heterogeniczności astrocytów; w tym eksperymencie konfluencyjna hodowla komórek glejowych wzbogacona w astrocyty stanowiła mieszaną hodowlę pierwotną, bez jakiejkolwiek obróbki chemicznej i pasażowania z trawieniem, co mogłoby dodatkowo uszkodzić komórki i wywołać odpowi...

<table><tbody><tr><td>DMEM(high glucose)</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>pożywka L15</td><td>Invitrogen</td><td>11415-114</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10437-077</td><td></td></tr><tr><td>pożywka Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>poli-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td>klasa hodowlana</td></tr><tr><td>NGF(2.5S)</td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>suplement B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>0.25% trypsyna-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało przeciwko neurofilamentom</td><td>Abcam</td><td>ab24575</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie wpływu heterogeniczności komórek glejowych na wzrost aksonów z wykorzystaniem nowej metody kokultury

Study Glial Cell Heterogeneity Influence on Axon Growth Using a New Coculture Method

W ośrodkowym układzie nerwowym wszystkich ssaków przerwane aksony po urazie nie są w stanie zregenerować się do swoich pierwotnych celów, a regeneracja funkcjonalna jest bardzo słaba 1. Niepowodzenie regeneracji aksonów jest wynikiem kombinacji kilku czynników, w tym wrogiego środowiska komórek glejowych, hamujących cząsteczek związanych z mieliną oraz zmniejszonej wewnętrznej zdolności regeneracyjnej neuronów 2. Astrocyty są najliczniejszym typem komórek glejowych w ośrodkowym układzie nerwowym i odgrywają istotną rolę w funkcjonowaniu aksonów w warunkach fizjologicznych i patologicznych 3. W przeciwieństwie do homologicznych oligodendrocytów, astrocyty stanowią heterogenną populację komórek złożoną z różnych subpopulacji astrocytów o zróżnicowanej morfologii i ekspresji genów 4. Znaczenie funkcjonalne tej heterogenności, na przykład w kontekście wpływu na wzrost aksonów, pozostaje w dużej mierze nieznane.
Aby zbadać komórki glejowe, a w szczególności wpływ heterogeniczności astrocytów na zachowanie neuronów, opracowaliśmy nową metodę polegającą na kokulturze wysoko oczyszczonych neuronów z zwojów korzeni grzbietowych z komórkami glejowymi uzyskanymi z kory szczura. Dzięki tej technice mogliśmy bezpośrednio porównać adhezję neuronów i wzrost aksonów na różnych subpopulacjach astrocytów w tych samych warunkach.
W niniejszym raporcie przedstawiamy szczegółowy protokół tej metody izolacji i hodowli astrocytów, izolacji i oczyszczania neuronów z zwojów korzeni grzbietowych oraz kokultury neuronów DRG z astrocytami. Metoda ta może zostać rozszerzona na inne obszary mózgu w celu badania specyficznych dla komórek lub regionów oddziaływań między neuronami a komórkami glejowymi.

W niniejszym protokole opisaliśmy nową metodę badania wpływu heterogeniczności komórek glejowych na wzrost aksonów z wykorzystaniem systemu kokultury in vitro. Glejowe komórki kory mózgu szczura hodowano do osiągnięcia konfluencji, a następnie kokultywowano z wysoko oczyszczonymi neuronami z zwojów korzeni grzbietowych szczura. Bezpośrednio w tej samej kulturze porównano wpływ różnych komórek glejowych na adhezję neuronów oraz wzrost aksonów. Metoda ta stanowi nowy sposób bezpośredniego badania wpływu heterogeniczności komórek glejowych na adhezję neuronów i wzrost aksonów.

Badanie wpływu heterogeniczności komórek glejowych na wzrost aksonów z wykorzystaniem nowej metody kokultury

W ośrodkowym układzie nerwowym wszystkich ssaków przerwane aksony po urazie nie są w stanie zregenerować się do swoich pierwotnych celów, a powrót funkcji jest...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie wpływu heterogeniczności glejowej na wzrost aksonów i przeżywalność komórek DRG. Jest to realizowane poprzez wstępne wyizolowanie komórek glejowych z kory mózgu noworodka szczura. Drugim krokiem procedury jest hodowla i oczyszczanie neuronów DRG z embrionu szczura.Trzecim krokiem procedury jest dodanie oczyszczonych neuronów DRG do komórek glio. Ostatnim etapem procedury jest obserwacja wzrostu aksonów w hodowli komórkowej oraz przeprowadzenie barwienia komórek i analizy ilościowej. W końcowym etapie można uzyskać wyniki.Wykazano, że wzrost neuronów z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) jest pod wpływem heterogenicznych komórek glejowych, co udowodniono za pomocą rejestracji time-lapse oraz mikroskopii immunofluorescencyjnej. Dzień dobry, reprezentuję laboratorium Neuro Imaging w Katedrze Neurologii na UCRA. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę badania heterogenicznego wpływu komórek glejowych na wzrost w nowej metodzie hodowli neuronów.W naszym laboratorium stosujemy tę nową metodę do badania interakcji między neuronami a komórkami glejowymi. Przejdźmy zatem do badania. Aby ustanowić kokulturę gleju i neuronów zwojów korzeni grzbietowych (DRG), rozpoczniemy od hodowli komórek glejowych w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Dno wysterylizowanych płytek hodowlanych z 24 dołkami wyścielamy wysterylizowanymi okrągłymi szkiełkami podstawkowymi, a następnie szkiełka w dołkach płytki hodowlanej z sześcioma dołkami pokrywamy polilizyną i inkubujemy przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.Opłucz szkiełka nakrywkowe i płytki hodowlane dwukrotnie wodą destylowaną, a następnie wysusz je na powietrzu. Następnie pipetuj 200 µL lub 2 mL zmodyfikowanej pożywki Eagle'a (DMEM) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do każdej studni płytki 24-dołkowej lub 6-dołkowej, odpowiednio. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 do następnego dnia.Zesterylizuj komorę do mikrodysekcji z pozytywnym przepływem powietrza. Włącz lampę UV na 20 minut, a następnie spryskaj wszystkie powierzchnie pod komorą 70% etanolem i odczekaj 15 minut przed użyciem. Rozpocznij pracę od głów dwóch szczurząt w wieku od P2 do P6, które zostały znieczulone metodą hipotermii.Następnie dokonuje się dekapitacji u podstawy otworu wielkiego (foramen magnum) za pomocą nożyczek chirurgicznych. Czaszkę otwiera się wzdłuż szwu strzałkowego, używając nożyczek irydowych, a następnie usuwa się sklepienie czaszki. Przedmózgowie należy wyjąć i umieścić w schłodzonym medium Levo's L 15, a następnie powtórzyć procedurę z drugą głową.Następnie, pracując pod mikroskopem stereoskopowym, ostrożnie usuń oponę twardą oraz błony i naczynia krwionośne pokrywające mózg. Wyizoluj korę i przemyj ją kilkukrotnie pożywką L 15.Za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych podziel korę na małe fragmenty. Następnie inkubuj w medium L 15 zawierającym 0,125% tripsyny w EDTA w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Następnie przenieś bloki tkankowe do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml DMEM z 20% FBS.Dodaj DS do stężenia końcowego 10 µg/mL. Następnie użyj pipety Pasteura wypalanej w ogniu, aby zamieszać roztwór tkankowy około 20 razy w celu rozdzielenia komórek. Na koniec przemyj komórki raz pożywką DMEM zawierającą 10% FBS i określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru.Następnie wysiej komórki w zagęszczeniu od 5, 000 do 10, 000 komórek na centymetr kwadratowy i inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Wymieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu, aby wyizolować, oczyścić i hodować DRGs. Najpierw przygotuj płytki 24-dołkowe z szklanymi szkiełkami podstawkowymi pokrytymi polilizyną, zgodnie z wcześniejszą instrukcją.Do każdego szkiełka podstawowego dodaj 100 µL pożywki NVF i inkubuj płytki w temperaturze 37 °C do następnego dnia. Zesterylizuj komorę z laminarnym przepływem powietrza w sposób opisany wcześniej. Następnie rozpocznij pracę z embrionami szczura w stadium od E 12 do E 15, które zostały wyizolowane pod mikroskopem stereo z macicy ciężarnej szczurzycy uśmierconej dwutlenkiem węgla.Wyizolować rdzenie kręgowe wraz z połączonymi z nimi zwojami korzeni grzbietowych i przenieść je do szalek 35 mm zawierających schłodzoną pożywkę L 15. Za pomocą pęsety mikrochirurgicznej ostrożnie oddzielić połączone zwoje korzeni grzbietowych od rdzeni kręgowych w schłodzonej pożywce L 15, odcinając połączone aksony w sposób nieuszkadzający zwojów.Zazwyczaj z jednego rdzenia kręgowego izoluje się od 20 do 30 zwojów rdzeniowych (DRG) po wyizolowaniu wszystkich DRG z rdzeni kręgowych. Wszystkie wyizolowane DRG należy inkubować w 0,125% trypsynie w EDTA przez 20 minut w temperaturze 37°C i 5% CO2. Komórki należy przepłukać raz w DMEM z 20% FBS, a następnie dodać DNA i kilkukrotnie pipetować za pomocą wypalanej pipety pasterskiej, aby utworzyć jednorodną zawiesinę komórkową, tak jak pokazano w przypadku komórek glejowych. Należy przeprowadzić drugie przemycie w medium MBF, policzyć komórki, a następnie wysiać je na przygotowane szkiełka podstawowe w płytkach 24-dołkowych w zagęszczeniu 5 000 komórek na dołek i inkubować przez noc w celu oczyszczenia neuronów DRG.Od 18 do 24 godzin po wysianiu. Po 72 godzinach wymienić medium na medium neurobasalne zawierające 20 µM 5-fluoro-2'-deoksyurydyny. Wymienić połowę medium na medium neurobasalne bez FUDR.Następnie medium wymienia się co drugi dzień. Około 20 dni po wysianiu komórek glejowych osiągną one konfluencję i będą gotowe do kokultury z neuronami na 24 godziny przed połączeniem obu typów komórek.Zastąp pożywkę dla komórek glejowych pożywką MBF. Przygotuj zawiesinę pojedynczych komórek z oczyszczonych zwojów korzeni grzbietowych (DRG) zgodnie z wcześniej zaprezentowaną metodą. Określ gęstość komórek.Następnie wysiej neurony na komórki glejowe w zagęszczeniu 500 komórek na centymetr kwadratowy. Przeżywalność neuronów i wzrost neurytów na komórkach glejowych można analizować w różnych punktach czasowych, wykorzystując oprogramowanie do analizy obrazu oraz immunochemię z użyciem przeciwciał specyficznych dla danego typu komórek. Oto przykłady komórek glejowych i neuronów z zwojów korzeniowych tylnych (DRG) hodowanych osobno oraz w ko-kulturze; komórki glejowe osiągają konfluencję po 20 dniach.W hodowli. Pod mikroskopem fazokontrastowym wyraźnie widać było, że różne subpopulacje komórek glejowych tworzą odmienne wzorce wzrostu i morfologie. Analiza immunocytochemiczna wykazała, że astrocyty wykazujące ekspresję GFAP stanowiły ponad 90% hodowli.Stosując naszą metodę traktowania FUDR przez 72 godziny, czystość neuronów z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) osiągnie poziom do 99% w ciągu sześciu dni; komórki te wykażą swoją charakterystyczną morfologię z wysoką gęstością wzrostu neurytów w kokulturze neuronów i komórek glejowych. Adhezja neuronów DRG oraz wzrost neurytów następowały sprawnie na komórkach glejowych w ciągu czterech godzin od wysiewu. Adhezja neuronów i wzrost neurytów były zależne od subpopulacji komórek glejowych, które tworzą specjalne podstruktury wzorców wzrostu, możliwe do łatwej identyfikacji pod mikroskopem fazowo-kontrastowym. Za pomocą immunocytochemii pokażę Państwu, jak prowadzić kokulturę neuronów DRG z komórkami glejowymi, aby zbadać wpływ heterogeniczności komórek glejowych na wzrost neuronów.Podczas przeprowadzania tej procedury bardzo ważne jest, aby obchodzić się z tkanką niezwykle delikatnie i utrzymywać komórki w medium. Nigdy nie wystawiaj ich na działanie powietrza i nie dopuszczaj do ich wyschnięcia. To wszystko.Dziękujemy za obejrzenie materiału i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

study-glial-cell-heterogeneity-influence-on-axon-growth-using-new

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Badanie wpływu niejednorodności komórek glejowych na wzrost aksonów przy użyciu nowej metody kokultury

Opracowaliśmy nowatorską wielokomorową platformę mikrosystemową do kokultury neuronów, przeznaczoną do badań nad oddziaływaniami aksonów i gleju w OUN in vitro. Platforma ta umożliwia prowadzenie do sześciu niezależnych eksperymentów równolegle i została wykonana przy użyciu nowo opracowanej hybrydowej metody fabrykacji makro/mikro.

Wielokomorowa mikrofluidyczna platforma do kokultury neuronów i gleju ośrodkowego układu nerwowego

Niniejsze badanie opisuje procedury tworzenia nowatorskiej platformy do kokultury aksonów neuronalnych i (astro)gleju. W tym systemie kokultury możliwa staje się manipulacja bezpośrednią interakcją między pojedynczym aksonem (i pojedynczą komórką glejową), co pozwala na analizę mechanistyczną wzajemnego sygnalizowania między neuronem a glejem.

Analiza obrazowa oddziaływań neuronów z glejem w systemie kokultury aksonów neuronowych i gleju opartym na mikrofluidycznej platformie hodowlanej (MCP)

Ten film ilustruje metodę ustanawiania pośredniej kokultury neuronów i astrocytów przy użyciu podejścia opartego na podziałach. W tej konfiguracji neurony i astrocyty są przestrzennie oddzielone, ale mają wspólne uwarunkowane podłoże. Czynniki neurotroficzne uwalniane przez astrocyty sprzyjają różnicowaniu neuronów i tworzeniu połączeń synaptycznych, co sugeruje interakcje neuron-glej.

Technika pośredniej kohodowli neuronów i astrocytów do badania interakcji neuron-glej

Ten film demonstruje model kokulturacyjny eksplantacji zwoju korzenia grzbietowego i komórek Schwanna. W warunkach kokultury kwas askorbinowy sprzyja różnicowaniu komórek Schwanna w formy mielinizujące. Mielinizujące się komórki Schwanna wielokrotnie owijają aksony, aby utworzyć osłonkę mielinową, która jest niezbędna do funkcjonowania nerwów.

Wspólna hodowla eksplantatu zwoju korzenia grzbietowego z komórkami Schwanna do mielinizacji neuronów

Zwoje korzenia grzbietowego (DRG) to struktury zawierające neurony czuciowe obwodowego układu nerwowego. Po dysocjacji mogą być hodowane wspólnie z komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej (ASC) podobnymi do SC, stanowiąc cenny model do badania regeneracji i mielinizacji nerwów in vitro, naśladując środowisko in vivo w miejscu urazu.

Neurony zwojów korzenia grzbietowego i zróżnicowane komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej: model wspólnej hodowli in vitro do badania regeneracji nerwów obwodowych

Ten protokół opisuje pośrednią kokulturę neuron-astrocyt do analizy interakcji neuron-glej.

Test pośredniej kokultury neuron-astrocyty: zestaw in vitro do szczegółowego badania interakcji neuron-glej

W tym protokole staramy się opisać powtarzalną metodę łączenia zdysocjowanych ludzkich neuronów i astrocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w kokultury sfer 3D, utrzymywania tych sfer w warunkach swobodnego pływania, a następnie mierzenia aktywności obwodów synaptycznych kul za pomocą immunoanalizy i zapisów z matrycy wieloelektrodowej.

Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy system mieszanych hodowli jednowarstwowych ex-vivo do badania migracji ludzkich komórek glejaka (hGC) w czasie rzeczywistym. Model ten zapewnia możliwość obserwowania interakcji między hGC a aksonami mielinizowanymi i niemielinizowanymi w obrębie komory z przedziałami.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym migracji komórek ludzkiego glejaka w kokulturach aksonów i oligodendrocytów w zwoju korzenia grzbietowego

Tutaj prezentujemy proste podejście wykorzystujące specyficzne podłoża hodowlane, które pozwala na tworzenie kultur wzbogaconych o neurony i astrocyty, lub kultur gleju neuronów z kory embrionalnej, o wysokiej wydajności i odtwarzalności.

Model hodowli komórkowej do badania roli interakcji neuron-glej w niedokrwieniu

Prezentujemy model in vitro do oceny zdolności neuroregeneracyjnej gleju otoczającego węch (OEG) po uszkodzeniu neuronalnym. Opiera się na kokulturze aksotomijnych dorosłych neuronów zwojowych siatkówki (RGN) na monowarstwach OEG, a następnie badaniu regeneracji aksonów, poprzez analizę markerów aksonalnych i somatodendrytycznych RGN.

Współkultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem otoczki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych

Tutaj prezentujemy łatwy w użyciu test do analizy migracji glejaka (GBM) na neuronach o wzorcach. Opracowaliśmy makro w oprogramowaniu FiJi do łatwego ilościowego określania migracji komórek GBM na neuronach i zaobserwowaliśmy, że neurony modyfikują zdolność inwazyjną komórek GBM.

Wspólna hodowla komórek macierzystych podobnych do glejaka na neuronach wzorcowych w celu zbadania migracji i interakcji komórkowych

Poznaj metodę kokultury do badania wpływu heterogeniczności komórek glejowych na wzrost aksonów neuronów DRG szczura. Technika ta pozwala analizować adhezję i wzrost neuritów w kontrolowanych warunkach in vitro.

Badanie wpływu heterogeniczności komórek glejowych na wzrost aksonów z wykorzystaniem nowej metody kokultury

Przeglądaj więcej filmów