Name: Mikroobrazowanie żywych gatunków metodą rezonansu spinowego elektronów do mapowania tlenu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj mikroobrazowanie ESR do mapowania tlenu wokół żywych komórek. Ta metoda wykorzystuje cyjanobakterie do analizy gradientów tlenu i aktywności metabolicznej w skali mikrometrycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była częściowo finansowana z grantu nr 213/09 z Israeli Science Foundation, grantu nr 2005258 z fundacji BSF, grantu nr 201665 z Europejskiej Rady ds. Badań (ERC) oraz przez Russell Berrie Nanotechnology Institute na Technionie. Dziękujemy prof. Noamowi Adirowi i Farisowi Salamie z Wydziału Chemii Schulich na Technionie za pomoc w dostarczeniu i obsłudze cyjanobakterii. Wyrażamy głęboką wdzięczność za pomoc i wsparcie Svetlany Yoffis z Jednostki Mikro- i Nanofabrykacji na Technionie.

1. Przegląd mikroobrazowania ESR
W pierwszej kolejności przedstawiamy zwięzłe wyjaśnienie zasad ESR, mikroskopii ESR oraz poszczególnych komponentów naszego systemu, a następnie opisujemy przebieg właściwych eksperymentów obrazowania.
Elektronowy rezonans spinowy jest techniką spektroskopową, w której promieniowanie elektromagnetyczne o określonej częstotliwości jest absorbowane przez cząsteczki z niesparowanymi spinami elektronowymi, umieszczone w zewnętrznym statycznym polu magnetycznym (Rysunek 1). ESR jest wykorzystywany w szerokich obszarach nauki, takich jak chemia, biologia, fizyka i inżynieria materiałowa, do detekcji i identyfikacji wolnych rodników oraz centrów paramagnetycznych. Jest to potężna metoda badania otoczenia cząsteczek paramagnetycznych w żywych organizmach, dostarczająca informacji o kwasowości (pH), lepkości oraz stężeniach tlenu i reaktywnych form tlenu3.
W przypadku próbek heterogenicznych informacje spektralne ESR można uzyskać w sposób rozdzielony przestrzennie (t.j. poprzez otrzymanie obrazu), dzięki zastosowaniu gradientów pola magnetycznego4. Jest to bardzo podobne do powszechniejszej metody obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI), która obserwuje głównie spiny protonowe. Do tej pory takie techniki obrazowania ESR stosowano w przypadku żywych okazów o stosunkowo dużym rozmiarze kilku centymetrów i rozdzielczości w skali mm. (Patrz na przykład Rysunek 2, pochodzący z odniesienia 5). Stosunkowo niedawnym osiągnięciem w obrazowaniu ESR jest rozszerzenie jego możliwości z badania małych zwierząt w rozdzielczości milimetrowej na pomiary próbek o rozmiarach milimetrowych i podmilimetrowych z rozdzielczością w skali mikronowej. Dziedzina ta jest znana jako mikroskopia ESR, która obecnie pozwala na uzyskanie trójwymiarowych obrazów ESR o rozdzielczości zbliżonej do 1 mikrona 2 (reprezentatywne przykłady przedstawiono na Rysunku 3).
Mikroskop ESR jest zasadniczo podobny do konwencjonalnego spektrometru ESR. Posiada magnes do wytwarzania pola statycznego, układ mikrofalowy do wzbudzania spinów i detekcji sygnału, sondę do trzymania próbki oraz komputerową konsolę do sterowania procesem akwizycji i przetwarzania danych. Innymi komponentami charakterystycznymi dla obrazowania ESR w ogóle, obecnymi również w mikroskopii ESR, są źródła gradientu pola magnetycznego, które stanowią część układu elektronicznego, oraz cewki gradientowe znajdujące się w sondzie obrazującej. Więcej szczegółów na temat naszego konkretnego systemu przedstawiono w filmie z protokołem oraz opisano w odniesieniu 2.
2.	Przygotowanie próbek do mikroobrazowania ESR
Ten etap opisuje metodę przygotowania próbek do eksperymentu mikroobrazowania ESR. Na koniec tego etapu komórki zostają umieszczone na dnie specjalnie przygotowanego szklanego pojemnika do mikroskopii ESR wraz z buforem zawierającym rodnik trytylowy6. Protokół ten opisuje pomiar komórek cyjanobakterii, dlatego w przypadku innych typów komórek na etapie przygotowania próbek mogą być wymagane odpowiednie korekty.
<ol>
<li>	Najpierw należy przygotować kilka kwadratów papieru chłonnego o rozmiarze ok. 400 400 μm pobiera się i umieszcza w probówce Eppendorfa, którą następnie napełnia się 1,2 ml zawiesiny cyjanobakterii (o stężeniu 40 mg/ml).</li>
<li>Zawiesinę wiruje się przez 2 minuty przy 6000 obr./min w mikrocentry fudze.</li>
<li>Następnie całkowicie usuwa się bufor z supernatantu, pozostawiając jedynie około50 μL które pozostawia się, aby zapobiec odwodnieniu cyjanobakterii. W wyniku tego procesu papier absorbujący zostaje nasycony komórkami cyjanobakterii.</li>
<li>Za pomocą precyzyjnej pęsety należy wyekstrahować kilka włókien z papieru i umieścić je na dnie specjalnie przygotowanego szklanego uchwytu na próbki w kształcie kielicha.7Następnie zastosowano 3 mM trytylu w roztworze BG-11.8, 9 (patrz Schemat 1) nanosi się do uchwytu próbki za pomocą cienkiej strzykawki. Następnie uchwyt uszczelnia się za pomocą kleju utwardzanego promieniami UV, pozostawiając otwarty niewielki otwór odprowadzający powietrze. 
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td> Roztwór zapasowy 4</td>
 <td>Zapas 3</td>
 <td>Roztwór zapasowy 2</td>
 <td>Roztwór stok 1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> H3BO3 2,86 g/l</td>
 <td>K2HPO (mikroskopia wysokorozdzielcza)4 :3H2O 4,0 g/l</td>
 <td>MgSO4 : 7H2O 7,5 g/l</td>
 <td>Na2Mg EDTA 0,1 g/l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MnCl22 :4H2O 1,81 g/l</td>
 <td> </td> 
 <td> </td> 
 <td>Cytrynian amonu i żelaza(III) 0,6 g/l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ZnSO₄4 7H2O 0,222 g/l</td>
 <td> </td> 
 <td> </td>
 <td>Kwas cytrynowy :1H2O 0,6 g/l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CuSO₄4 :5H2O 0,079 g/l</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>CaCl22 2H2O 3,6 g/l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>COCl2 :6H2O 0,050 g/l</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaMoO42H2O 0,391 g/l</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
 Schemat 1. Przygotowanie pożywki BG-11.
</li> 
</ol>
3. Eksperymenty mikroobrazowania ESR
<ol>
<li>Aby rozpocząć eksperyment obrazowania, należy włączyć system mikroobrazowania ESR i umieścić próbkę w rezonatorze znajdującym się wewnątrz sondy obrazującej.</li>
<li>Następnie, korzystając z oprogramowania sterującego komputerem, należy ustawić system w tryb „Tune” i wyznaczyć rezonansową częstotliwość mikrofal sondy, która będzie wykorzystywana do pomiarów ESR.</li>
<li>Po tym kroku należy ustawić statyczne pole magnetyczne na wartość odpowiadającą zastosowanej częstotliwości mikrofal, określić parametry czasowe sekwencji impulsów i zaobserwować sygnał ESR, aby upewnić się, że system działa prawidłowo, a próbka jest odpowiednio przygotowana.</li>
<li>Następnie należy ustawić parametry obrazowania, takie jak liczba pikseli, natężenie gradientów oraz czas trwania impulsów gradientowych, na wymagane wartości.</li>
<li>Po konfiguracji należy zebrać trzy trójwymiarowe obrazy ESR za pomocą sekwencji impulsów obrazowania echa Hana (Rysunek 4) z odstępami międzyimpulsowymi wynoszącymi 500, 600 i 700 ns.</li>
<li>Światło kierowane na próbkę jest włączane lub wyłączane w zależności od wymaganych warunków eksperymentalnych.</li>
<li>Podczas akwizycji dane są zapisywane automatycznie. Te surowe pliki danych są następnie przetwarzane za pomocą skryptu w programie Matlab w celu uzyskania obrazów stężenia rodników trytylowych oraz mapy czasu relaksacji T2, która jest przeliczana na obraz stężenia tlenu przy użyciu istniejącej kalibracji.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki 
Wynikami eksperymentu jest kilka trójwymiarowych mikroobrazów ESR zarejestrowanych dla różnych wartości τ. Typowe obrazy danych surowych przedstawiono na Rysunku 5. Trzy górne obrazy, wykonane w ciemności, są bardzo podobne, z wyjątkiem zmniejszenia intensywności sygnału. Z kolei wzór obrazu zmienia się pod wpływem naświetlania ze względu na różne czasy relaksacji w różnych częściach próbki. Dane te można przetworzyć1, aby uzyskać obraz amplitudy, jak pokazano na Rysunku 6, a także obrazy czasu relaksacji, T2 (Rysunek 7). Obrazy T2 są przeliczane na wartości stężenia tlenu za pomocą istniejącej krzywej kalibracyjnej, która wiąże stężenie tlenu z czasem relaksacji zgodnie z równaniem: <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="Równanie kinetyki chemicznej, schemat szybkości reakcji enzymatycznej, analiza kinetyczna zależna od T2(C,D)" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1">
Tutaj T20 to czas relaksacji spin-spin sondy w warunkach anoksycznych (zależny od stężenia sondy, C, oraz jej współczynnika dyfuzji, D), a k to stała proporcjonalności. W większości przypadków współczynnik dyfuzji nie zmienia się znacząco w przypadku żywych próbek (choć w razie potrzeby może on zostać w zasadzie bezpośrednio wyznaczony również za pomocą ESR 6, 10), a stężenie spinów jest wyznaczane podczas procesu obrazowania. Zatem zależność ta może być wykorzystana do bezpośredniego pomiaru stężenia tlenu.
Wracając do rysunku 6, z obrazu amplitudy wynika wyraźnie, że komórki cyjanobakterii znajdowały się głównie po prawej stronie uchwytu próbki. Ponadto, na podstawie rysunku 7 widać, że światło inicjuje produkcję O2 i powoduje znaczny wzrost stężenia O2 w roztworze, głównie w wokselach znajdujących się w pobliżu cyjanobakterii.
<img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="Diagram rezonansu spinowego elektronów, energia względem pola magnetycznego, pokazujący ΔE=hv z częstotliwością mikrofal" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Poziomy energetyczne w rezonansie spinowym elektronów.
 
<img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="Statyczny obraz MRI przedstawiający anatomię, z zaznaczonym guzkiem; schemat mapy pO2 wskazujący poziom tlenu (mmHg)." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Typowy obraz stężenia tlenu u myszy z guzkiem nowotworowym. Obraz po lewej stronie przedstawia informacje anatomiczne na podstawie obrazu MRI. Myszy wstrzyknięto stabilny wolny rodnik organiczny, a jego charakterystyka ESR pozwala określić stężenie tlenu w jego otoczeniu (po prawej). Wyniki oparte na ESR zostały nałożone na anatomiczny obraz MRI. Pole widzenia wynosi 32 mm.
<img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="Obrazy optyczne i ESR przedstawiające litery STU; obrazowanie i analiza elektronowego rezonansu spinowego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Dwa przykłady wysokorozdzielczych obrazów ESR w mikroskali z próbek wytworzonych fotolitograficznie z proszku N@C60 (lewo) oraz paramagnetycznych kryształów LiPc (prawo)
<img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="Schemat sekwencji impulsów, proces echa spinowego, impulsy MW, gradienty Gx, Gy, Gz, spektroskopia NMR." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Typowa sekwencja impulsów w obrazowaniu Hana, przedstawiająca impulsy mikrofalowe (MW) oraz gradienty Gx, Gy i Gz.
<img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="Spektroskopia absorpcyjna przejściowa; 6 zestawów danych wykazujących τ=500-700ns, w warunkach ciemności/oświetlenia; schemat." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Typowe mikroobrazy ESR z surowych danych: a, b i c to surowe dane z próbki Cyanobacterium bez oświetlenia, zmierzone odpowiednio dla τ = 500, 600, 700 ns. Elementy d, e i f są analogiczne do a, b i c, ale z oświetleniem. Intensywność przedstawiono w skali arbitralnej (jest ona jednak spójna w obrębie każdego zestawu trzech surowych obrazów w ciemności lub przy oświetleniu)
<img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="Mapa cieplna spektroskopowa; gradient stężenia od 0 do 25 µM; analiza rozkładu chemicznego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Obraz amplitudy odpowiadający stężeniu rodników w roztworze (skala dowolna).
<img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="Porównanie ciemności i światła w wynikach obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM); mapy zakodowane kolorami." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: T2 obrazy oraz odpowiadające im wartości [O2] w warunkach ciemności (lewo) i oświetlenia (prawo).

<ol><li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution%3A+methodology+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li>
<li>Gallez, B., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+EPR%3A+when%2C+how+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">In vivo EPR: when, how and why?</a> NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).</li>
<li>Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEaton%2C+GR+%22EPR+imaging+and+in+vivo+EPR%22">EPR imaging and in vivo EPR</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1991).</li>
<li>Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+tumor+oxygenation+and+microvascular+permeability+using+Overhauser+enhanced+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).</li>
<li>Talmon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Diffusion+in+Porous+Media+by+PGSE%5BTitle%5D)+AND+%22ESR.+J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE.</a> ESR. J Phys Chem. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolithographic+production+of+glass+sample+holders+for+improved+sensitivity+and+resolution+in+ESR+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy.</a> Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).</li>
<li>Allen, M. M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+Division+of+Some+Unicellular+Blue-Green+Algae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae.</a> J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).</li>
<li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generic+Assignments%2C+Strain+Histories+and+Properties+of+Pure+Cultures+of+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria.</a> J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li>
<li>Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+diffusion+in+liquid+phase+by+electron+spin+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance.</a> Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Niniejszy protokół pokazuje, w jaki sposób mikroobrazowanie ESR może zostać zastosowane do mapowania stężenia tlenu w pobliżu żywych, małych próbek. Wykazano rozdzielczość przestrzenną rzędu ~30 x 30 x 100 μm, przy czułości na stężenie tlenu w zakresie bliskim mikromolarnemu oraz bezwzględnej czułości na tlen poniżej femtomola na voksel. Zastosowanie mikroobrazowania ESR do mapowania tlenu w pobliżu komórek uzupełnia obecnie dostępne techniki oparte na mikroelektrodach lub fluorescencji/fosforescencji. Ponadto, przy zastosowaniu odpowiedniej sondy paramagnetycznej, metoda ta znajdzie bezpośrednie zastosowanie w wewnątrzkomórkowym mikroobrazowaniu tlenu – możliwości, którą innym metodom bardzo trudno jest osiągnąć. W najbliższej przyszłości planujemy dalsze udoskonalenie tej metodologii, aby uzyskać obrazy żywych próbek z rozdzielczością kilku mikronów, dostarczając parametry kontrastu, takie jak stężenie nadtlenku, kwasowość (pH), współczynnik dyfuzji sondy i, oczywiście, stężenie tlenu. Możliwości te są komplementarne względem obecnych metodologii opartych na optyce, zarówno pod względem rodzaju kontrastu, jak i charakterystyki próbek (np. nieprzezroczyste, grube próbki oraz w niektórych przypadkach pomiary wewnątrzkomórkowe w przeciwieństwie do zewnątrzkomórkowych).

<table><tbody><tr><td>Wirówka</td><td>Kendro</td><td>Heraus, 75003235</td><td></td></tr><tr><td>W pełni zdeutrowany rodnik triarylmetylowy (trytylowy)</td><td>Nowosybirsk</td><td></td><td>Zsyntetyzowany w Nowosybirsku metodą opisaną w referencji &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Bufor BG-11</td><td></td><td></td><td>Instrukcję przygotowania zawiera Schemat 1 oraz referencje 8, 9.</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Hamilton Co</td><td>Microliter 7000.5</td><td></td></tr><tr><td>Utwardzanie promieniami UV</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA63 lub NOA61.</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroobrazowanie za pomocą rezonansu spin-elektronowego żywych organizmów do mapowania tlenu

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Niniejszy protokół opisuje metodę mikroobrazowania za pomocą rezonansu spin-elektronowego (ESR) do trójwymiarowego mapowania poziomu tlenu w bezpośrednim otoczeniu żywych komórek z rozdzielczością w skali mikronowej1. Tlen jest jedną z najważniejszych cząsteczek w cyklu życia. Służy jako końcowy akceptor elektronów w fosforylacji oksydacyjnej w mitochondriach i jest wykorzystywany w produkcji reaktywnych form tlenu. Pomiary tlenu są istotne dla badania funkcji mitochondrialnych i metabolicznych, szlaków sygnalizacyjnych, efektów różnych bodźców, przepuszczalności błon oraz różnicowania chorób. Zużycie tlenu stanowi zatem informacyjny marker metabolizmu komórkowego, który znajduje szerokie zastosowanie w różnych systemach biologicznych – od mitochondriów i komórek po całe organizmy. Ze względu na jego znaczenie opracowano wiele metod pomiaru tlenu w żywych systemach. Obecne próby zapewnienia obrazowania tlenu o wysokiej rozdzielczości opierają się głównie na metodach fluorescencyjnych i fosforyzacyjnych, które nie dają satysfakcjonujących wyników, ponieważ wykorzystują sondy o wysokiej fototoksyczności i niskiej czułości na tlen. ESR, który mierzy sygnał z egzogennych sond paramagnetycznych w próbce, jest znany z zapewniania bardzo dokładnych pomiarów stężenia tlenu. W typowym przypadku pomiary ESR mapują poszerzenie kształtu linii i/lub skrócenie czasu relaksacji sondy, które są bezpośrednio powiązane z lokalnym stężeniem tlenu. (Tlen jest paramagnetyczny; w związku z tym, podczas kolizji z egzogenną sondą paramagnetyczną, skraca on jej czasy relaksacji). Tradycyjnie tego typu eksperymenty są przeprowadzane z niską rozdzielczością, w skali milimetrowej, w obrazowaniu ESR małych zwierząt. Tutaj pokazujemy, jak obrazowanie ESR może być prowadzone również w skali mikronowej w celu badania małych żywych próbek. Mikroobrazowanie ESR jest stosunkowo nową metodologią, która umożliwia pozyskiwanie sygnałów ESR z rozdzielczością przestrzenną zbliżoną do 1 μm w temperaturze pokojowej2. Głównym celem niniejszej publikacji protokołu jest pokazanie, w jaki sposób ta nowa metoda, wraz z nowo opracowanymi sondami czułymi na tlen, może być zastosowana do mapowania poziomu tlenu w małych żywych próbkach. Wykazano rozdzielczość przestrzenną rzędu ~30 x 30 x 100 μm, z czułością na stężenie tlenu w zakresie bliskim mikromolarnemu oraz bezwzględną czułością na tlen poniżej femtomola na woxel. Zastosowanie mikroobrazowania ESR do mapowania tlenu w pobliżu komórek uzupełnia obecnie dostępne techniki oparte na mikroelektrodach lub fluorescencji/fosforyzacji. Ponadto, przy zastosowaniu odpowiedniej sondy paramagnetycznej, metoda ta będzie łatwo przydatna do wewnątrzkomórkowego mikroobrazowania tlenu – możliwości, którą innym metodom bardzo trudno jest osiągnąć.

Niniejszy protokół opisuje metodę trójwymiarowego obrazowania stężenia tlenu w skali mikronowej w bezpośrednim otoczeniu żywych komórek z wykorzystaniem mikroskopii rezonansu spinowego elektronów.

Mikroobrazowanie za pomocą rezonansu spin-elektronowego żywych organizmów do mapowania tlenu

Niniejszy protokół opisuje metodę mikroobrazowania za pomocą rezonansu spinowo-elektronowego (ESR) do trójwymiarowego mapowania poziomów tlenu w bezpośrednim otoczeniu...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest uzyskanie trójwymiarowych obrazów stężenia tlenu w bezpośrednim otoczeniu żywych komórek w skali mikronowej za pomocą mikroskopii rezonansu spinowego elektronów (ESR). Protokół zostanie zaprezentowany na przykładzie cyjanobakterii, które są powszechnymi komórkami fotosyntetyzującymi. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie próbki komórek cyjanobakterii w uchwycie do próbek mikroskopii ESR.Zatopione w stabilnym roztworze rodników organicznych. Uchwyt próbki umieszcza się wewnątrz sondy obrazującej, która zostaje wprowadzona do statycznego elektromagnesu systemu mikroskopu ESR. Następnie za pomocą mikroskopu ESR pozyskuje się kilka trójwymiarowych obrazów ESR roztworu rodników organicznych.Procedurę tę przeprowadza się dla kilku wariantów sekwencji impulsów, często w różnych warunkach zewnętrznych, takich jak warunki oświetlenia i ciemności. Następnie surowe obrazy danych są przetwarzane przez komputer w celu wyodrębnienia trójwymiarowych, rozdzielczo przestrzennych czasów relaksacji rodnika. Czasy relaksacji te, dzięki wcześniejszej kalibracji, stanowią bezpośrednią miarę stężenia tlenu, co pozwala na uzyskanie pełnych trójwymiarowych map tlenu w badanych próbkach w różnych warunkach zewnętrznych.Otrzymane wyniki wyraźnie wskazują na brak produkcji tlenu przez cyjanobakterie w warunkach braku oświetlenia. Ponadto wykazano, że pod wpływem napromieniowania światłem w pobliżu komórek cyjanobakterii powstaje znaczący gradient tlenowy oraz heterogeniczność tlenowa. Cześć, jestem Al z laboratorium BLA na Wydziale Chemii w Technion, Izraelskim Instytucie Technologicznym w Hajfie.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę trójwymiarowego mapowania stężeń tlenu w pobliżu żywych komórek z wysoką rozdzielczością przestrzenną przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania tempa zużycia tlenu oraz aktywności metabolicznej komórek. Zacznijmy zatem.Elektronowy rezonans spinowy lub ESR jest techniką spektroskopową, w której promieniowanie elektromagnetyczne o określonej częstotliwości jest pochłaniane przez gatunki paramagnetyczne posiadające niesparowany spin elektronowy, umieszczone w zewnętrznym statycznym polu magnetycznym. Jest to potężna metoda badania środowiska cząsteczek paramagnetycznych w żywych organizmach, w tym stężeń tlenu i reaktywnych form tlenu. Poniżej przedstawiono typowy obraz stężenia tlenu w myszy z nowotworem dla próbek heterogenicznych.Informacje ze spektroskopii ESR można uzyskać w sposób rozdzielony przestrzennie dzięki zastosowaniu gradientów pola magnetycznego. Do myszy wstrzyknięto stabilny, wolny rodnik organiczny, którego charakterystyka ESR pozwala określić stężenie tlenu w jego otoczeniu. Wyniki oparte na metodzie ESR zostały nałożone na anatomiczny obraz MRI.Do tej pory tego typu techniki obrazowania ESR żywych okazów były przeprowadzane wyłącznie na stosunkowo dużych próbkach w skali milimetrowej. Mikroskopia ESR o wysokiej rozdzielczości umożliwia pomiary próbek o rozmiarach milimetrowych i submilimetrowych, dostarczając trójwymiarowych obrazów ESR o rozdzielczości zbliżonej do jednego mikrona.Oto dwa przykłady obrazowania ESR w skali mikronowej o wysokiej rozdzielczości, przedstawiające próbki przygotowane z proszku NNC 60 oraz paramagnetycznych kryształów cyjanku litu. Mikroskop ESR jest podobny do konwencjonalnego spektrometru ESR; posiada magnes do generowania pola statycznego, układ mikrofalowy do wzbudzania spinów i detekcji sygnału, sondę do mocowania próbki oraz komputerową konsolę do sterowania procesem akwizycji i przetwarzania danych. Pozostałe komponenty systemu obejmują sterowniki gradientu pola magnetycznego, które stanowią część układu elektronicznego, oraz cewki gradientowe znajdujące się w sondzie obrazującej.Cewki gradientowe posiadają również aperturę umożliwiającą naświetlanie próbki. Do próbki doprowadzane jest wilgotne powietrze o kontrolowanej temperaturze, aby zapewnić minimalne odwodnienie podczas eksperymentu. Głównymi unikalnymi cechami mikroskopii ESR są niewielki rozmiar sondy i cewek gradientowych, wyższa czułość spinowa systemu oraz wysoka moc sterowników gradientu pola magnetycznego. Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować zawiesinę sinic o stężeniu 40 mg/mL.Aby rozpocząć przygotowanie próbek do mikroobrazowania ESR, za pomocą precyzyjnej pincety pobierz kilka kwadratów papieru absorbującego o rozmiarze około 400 na 400 mikronów. Następnie umieść je w probówce typu einor. Po tym czasie napełnij probówkę 1,2 mililitra zawiesiny cyjanobakterii.Następnie odwiruj zawiesinę przez dwie minuty przy 6 000 RPM w mikrocentryfugrze; po wirowaniu całkowicie usuń nadosad, z wyjątkiem około 50 µL, które pozostawia się, aby uniknąć odwodnienia cyjanobakterii. Proces ten prowadzi do nasycenia papieru absorbującego komórkami cyjanobakterii. Następnie przygotuj specjalnie przystosowany uchwyt do próbek w kształcie kielicha, wyciągnij kilka włókien z papieru za pomocą precyzyjnej pęsety i umieść je na dnie uchwytu do próbek.Następnie, za pomocą strzykawki, dodaj 3 mM roztworu tridel oraz BG 11, przygotowanego zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Następnie uszczelnij uchwyt próbki za pomocą kleju utwardzanego promieniami UV, nakładając go pomiędzy krawędzie szklanego uchwytu i dopasowane do niego szkiełko przykrywowe, pozostawiając niewielki otwór odpływowy dla powietrza. Na koniec utwardź klej światłem UV przez 2 s.Aby rozpocząć eksperyment obrazowania, włącz system mikroobrazowania ESR i włóż próbkę do rezonatora znajdującego się wewnątrz sondy obrazującej. Następnie, korzystając z oprogramowania sterującego komputerem, ustaw system w trybie strojenia i wyznacz rezonansową częstotliwość mikrofal sondy, która będzie wykorzystywana do pomiarów ESR. Po tym kroku ustaw statyczne pole magnetyczne na wartość odpowiadającą zastosowanej częstotliwości mikrofal.Ustaw parametry czasowe sekwencji impulsów i obserwuj sygnał ESR, aby upewnić się, że system działa prawidłowo, a próbka jest odpowiednio przygotowana. Następnie ustaw parametry obrazowania, takie jak liczba pikseli, natężenie gradientów oraz długość impulsów gradientowych, na wymagane wartości. Po zakończeniu konfiguracji wykonaj trzy trójwymiarowe obrazy ESR za pomocą sekwencji impulsów Han Echo Imaging z wartościami odstępu międzyimpulsowego tau wynoszącymi 500 600 i 700 nanoseconds.W tym momencie, jeśli wymagają tego warunki eksperymentalne podczas całego procesu akwizycji, włącz projekcję światła na próbkę; dane są zapisywane automatycznie. Po procesie akwizycji danych, pliki z surowymi danymi są przetwarzane za pomocą skryptu w oprogramowaniu MATLAB. Przy użyciu oprogramowania wygeneruj obrazy stężenia rodników trill oraz czasu relaksacji.Następnie mapę T₂ przekształć w obraz stężenia tlenu, wykorzystując istniejącą krzywą kalibracyjną łączącą stężenie tlenu z czasem relaksacji. Tutaj T₂₀ to czas relaksacji spin-spin sondy w warunkach anoksycznych, zależny od stężenia sondy C oraz jej współczynnika dyfuzji D. Przedstawiono typowe surowe obrazy z kilku trójwymiarowych eksperymentów obrazowania ESR przeprowadzonych na cyjanobakteriach. Obrazy te uzyskano dla różnych wartości tau, zarówno w warunkach ciemności, jak i naświetlania.W warunkach ciemności wyniki są bardzo podobne, z wyjątkiem zmniejszonej intensywności dla większych wartości T ze względu na spin oraz czas relaksacji spinowej T dwa. Odwrotnie, podczas naświetlania wzór obrazu ulega zmianie ze względu na różne czasy relaksacji w całej próbce. Następnie dane te są przetwarzane w celu uzyskania obrazu amplitudy z tego obrazu.Widać wyraźnie, że sinice znajdują się głównie po prawej stronie uchwytu na próbkę. Dwa obrazy są przeliczane na wartości stężenia tlenu za pomocą istniejącej krzywej kalibracyjnej, która wiąże stężenie tlenu z czasem relaksacji. Wyniki przedstawiono dla sinic w obecności oraz w braku światła.Jasno widać, że produkcja tlenu jest inicjowana światłem i powoduje znaczny wzrost stężenia tlenu w roztworze. Prowadzi to do spadku ilości rodnika T2, głównie w wokselach znajdujących się w pobliżu włókien papieru absorbującego z cyjanobakteriami. Właśnie pokazaliśmy, jak przygotować próbkę zawierającą żywe komórki ze stabilnym wolnym rodnikiem do mapowania stężenia tlenu za pomocą mikroskopii EESR. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby była ona możliwie jak najkrótsza, aby zapewnić zmienność S i uniknąć degradacji próbki.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentu.

electron-spin-resonance-micro-imaging-live-species-for-oxygen

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikroskopowe badanie rezonansem elektronowy spinowym żywych organizmów w celu odwzorowania tlenu

Technika ta umożliwia zastosowanie wysokorozdzielczej spektroskopii protonowej MR z rotacją pod kątem magicznym (HRMAS 1H-MRS) do charakterystyki molekularnej żywych Drosophila melanogaster przy użyciu konwencjonalnego spektrometru o indukcji 14,1 tesla wyposażonego w sondę HRMAS.

Spektroskopia rezonansu magnetycznego żywych much Drosophila melanogaster z wykorzystaniem wiru pod magicznym kątem

Spektroskopię elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) zastosowano do wykrywania tlenku azotu z bydlęcych komórek śródbłonka aorty oraz anionorodnika ponadtlenkowego z ludzkich neutrofili, wykorzystując odpowiednio ditiokarbaminian żelaza (II)-N-metylu-D-glukaminy, Fe(MGD)2, oraz 5,5-dimetylo-1-pyrolino-N-tlenek, DMPO.

Wykrywanie tlenku azotu i anionoradykału ponadtlenkowego w komórkach za pomocą spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego z użyciem pułapek spinowych

Mikroskopia poklatkowa markerów autofagii znakowanych fluorescencyjnie umożliwia monitorowanie dynamicznej odpowiedzi autofagii z wysoką rozdzielczością czasową. Korzystając ze specyficznych markerów autofagii i organelli w kombinacji 3 różnych kolorów, możemy śledzić wkład białka w tworzenie autofagosomów w solidnym kontekście przestrzennym i czasowym.

Obrazowanie na żywych komórkach wczesnych zdarzeń autofagii: omegasomy i nie tylko

Nowa metoda elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR), rapid scan EPR (RS-EPR), została zademonstrowana do przestrzennego obrazowania spektralnego 2D, która jest lepsza od tradycyjnej techniki ciągłej fali (CW) i otwiera nowe możliwości obrazowania in vivo. Wyniki są demonstrowane na częstotliwości 250 MHz, ale technika ta ma zastosowanie na dowolnej częstotliwości.

Szybki skan elektronowy rezonansu paramagnetycznego otwiera nowe możliwości obrazowania fizjologicznie ważnych parametrów in vivo

Opisujemy użycie nowatorskiej kamery o żywotności luminescencji w dziedzinie częstotliwości do mapowania rozkładów 2D O2 za pomocą folii czujników optycznych. Opisano system kamer i procedury analizy obrazu wraz z przygotowaniem, kalibracją i aplikacją folii sensorycznych do wizualizacji mikrośrodowiskaO2 w ryzosferze roślin wodnych.

Obrazowanie żywotności luminescencjiO2 za pomocą systemu kamer opartego na domenie częstotliwości

Protokół opisuje wysokoprzepustowe generowanie sferoidów do biodruku przy użyciu wieloparametrycznej analizy ich natlenienia i śmierci komórki pod standardowym mikroskopem fluorescencyjnym. Podejście to można zastosować do kontrolowania żywotności sferoid i przeprowadzania standaryzacji, co jest ważne w modelowaniu tkanki 3D, mikrośrodowiska guza i udanej biofabrykacji (mikro)tkanek.

Przystępna cenowo biofabrykacja sferoid wielokomórkowych wspomagana mikroskopią tlenową

Ten artykuł opisuje użycie nowego, szybkiego imagera optycznego do makroskopowego obrazowania czasu życia fotoluminescencji próbek emitujących długie rozpady. Opisano procedury integracji, akwizycji i analizy obrazu, a także przygotowanie i charakterystykę materiałów sensorów do obrazowania oraz zastosowania imagera w badaniu próbek biologicznych.

Termoobrazownik o żywotności fluorescencji do zastosowań biomedycznych

Prezentujemy protokół do bezpośredniej wizualizacji aktywności metabolicznej w komórkach regulowanych przez aminokwasy za pomocą mikroskopii stymulowanego rozpraszania Ramana (DO-SRS) z tlenkiem deuteru (ciężka wodaD2O), która jest zintegrowana z mikroskopią fluorescencyjną wzbudzenia dwufotonowego (2PEF).

Bioortogonalne obrazowanie chemiczne metabolizmu komórkowego regulowanego przez aminokwasy aromatyczne

Ilościowe mapy tlenowe 3D mysich guzów zostały zobrazowane nieinwazyjnie za pomocą pulsacyjnego rezonansu paramagnetycznego. Ultrasonografia B-mode i Power Doppler zostały wykorzystane do anatomii i struktury naczyniowej. Obrazy z obu modalności nałożono na siebie, umożliwiając wieloparametryczną analizę guza.

Ocena niedotlenienia guza: obrazowanie tlenu in vivo 3D za pomocą elektronowego rezonansu paramagnetycznego

Korzystając z platformy multimodalnej łączącej metody obrazowania optycznego bez znaczników, opracowaliśmy protokół do wizualizacji i ilościowego określania dynamiki komórkowej i metabolizmu. Dzięki obrazowaniu za pomocą fluorescencji wielofotonowej, generowania drugiej harmonicznej i wymuszonej mikroskopii rozpraszania Ramana możemy uzyskać całościowy przegląd środowiska komórkowego i molekularnego.

Multimodalna platforma obrazowania optycznego do badania metabolizmu komórkowego

Wprowadziliśmy nowatorską technikę obrazowania zwaną Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), która umożliwia bezstronne obrazowanie wszystkich komórek w próbkach mózgu na mezoskali i może być płynnie zintegrowana z procesem obrazowania taśmowej szeregowej skaningowej mikroskopii elektronowej na tej samej próbce.

Metoda optycznego obrazowania zgodna z mikroskopią skaningową do mezoskopowego mapowania mózgu w całych komórkach

Poznaj mikroobrazowanie ESR do mapowania tlenu wokół żywych komórek. Ta metoda wykorzystuje cyjanobakterie do analizy gradientów tlenu i aktywności metabolicznej w skali mikrometrycznej.

Mikroobrazowanie za pomocą rezonansu spin-elektronowego żywych organizmów do mapowania tlenu

Przeglądaj więcej filmów