Mikroobrazowanie za pomocą rezonansu spin-elektronowego żywych organizmów do mapowania tlenu

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest uzyskanie trójwymiarowych obrazów stężenia tlenu w bezpośrednim otoczeniu żywych komórek w skali mikronowej za pomocą mikroskopii rezonansu spinowego elektronów (ESR). Protokół zostanie zaprezentowany na przykładzie cyjanobakterii, które są powszechnymi komórkami fotosyntetyzującymi. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie próbki komórek cyjanobakterii w uchwycie do próbek mikroskopii ESR.

Zatopione w stabilnym roztworze rodników organicznych. Uchwyt próbki umieszcza się wewnątrz sondy obrazującej, która zostaje wprowadzona do statycznego elektromagnesu systemu mikroskopu ESR. Następnie za pomocą mikroskopu ESR pozyskuje się kilka trójwymiarowych obrazów ESR roztworu rodników organicznych.

Procedurę tę przeprowadza się dla kilku wariantów sekwencji impulsów, często w różnych warunkach zewnętrznych, takich jak warunki oświetlenia i ciemności. Następnie surowe obrazy danych są przetwarzane przez komputer w celu wyodrębnienia trójwymiarowych, rozdzielczo przestrzennych czasów relaksacji rodnika. Czasy relaksacji te, dzięki wcześniejszej kalibracji, stanowią bezpośrednią miarę stężenia tlenu, co pozwala na uzyskanie pełnych trójwymiarowych map tlenu w badanych próbkach w różnych warunkach zewnętrznych.

Otrzymane wyniki wyraźnie wskazują na brak produkcji tlenu przez cyjanobakterie w warunkach braku oświetlenia. Ponadto wykazano, że pod wpływem napromieniowania światłem w pobliżu komórek cyjanobakterii powstaje znaczący gradient tlenowy oraz heterogeniczność tlenowa. Cześć, jestem Al z laboratorium BLA na Wydziale Chemii w Technion, Izraelskim Instytucie Technologicznym w Hajfie.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę trójwymiarowego mapowania stężeń tlenu w pobliżu żywych komórek z wysoką rozdzielczością przestrzenną przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania tempa zużycia tlenu oraz aktywności metabolicznej komórek. Zacznijmy zatem.

Elektronowy rezonans spinowy lub ESR jest techniką spektroskopową, w której promieniowanie elektromagnetyczne o określonej częstotliwości jest pochłaniane przez gatunki paramagnetyczne posiadające niesparowany spin elektronowy, umieszczone w zewnętrznym statycznym polu magnetycznym. Jest to potężna metoda badania środowiska cząsteczek paramagnetycznych w żywych organizmach, w tym stężeń tlenu i reaktywnych form tlenu. Poniżej przedstawiono typowy obraz stężenia tlenu w myszy z nowotworem dla próbek heterogenicznych.

Informacje ze spektroskopii ESR można uzyskać w sposób rozdzielony przestrzennie dzięki zastosowaniu gradientów pola magnetycznego. Do myszy wstrzyknięto stabilny, wolny rodnik organiczny, którego charakterystyka ESR pozwala określić stężenie tlenu w jego otoczeniu. Wyniki oparte na metodzie ESR zostały nałożone na anatomiczny obraz MRI.

Do tej pory tego typu techniki obrazowania ESR żywych okazów były przeprowadzane wyłącznie na stosunkowo dużych próbkach w skali milimetrowej. Mikroskopia ESR o wysokiej rozdzielczości umożliwia pomiary próbek o rozmiarach milimetrowych i submilimetrowych, dostarczając trójwymiarowych obrazów ESR o rozdzielczości zbliżonej do jednego mikrona.

Oto dwa przykłady obrazowania ESR w skali mikronowej o wysokiej rozdzielczości, przedstawiające próbki przygotowane z proszku NNC 60 oraz paramagnetycznych kryształów cyjanku litu. Mikroskop ESR jest podobny do konwencjonalnego spektrometru ESR; posiada magnes do generowania pola statycznego, układ mikrofalowy do wzbudzania spinów i detekcji sygnału, sondę do mocowania próbki oraz komputerową konsolę do sterowania procesem akwizycji i przetwarzania danych. Pozostałe komponenty systemu obejmują sterowniki gradientu pola magnetycznego, które stanowią część układu elektronicznego, oraz cewki gradientowe znajdujące się w sondzie obrazującej.

Cewki gradientowe posiadają również aperturę umożliwiającą naświetlanie próbki. Do próbki doprowadzane jest wilgotne powietrze o kontrolowanej temperaturze, aby zapewnić minimalne odwodnienie podczas eksperymentu. Głównymi unikalnymi cechami mikroskopii ESR są niewielki rozmiar sondy i cewek gradientowych, wyższa czułość spinowa systemu oraz wysoka moc sterowników gradientu pola magnetycznego. Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować zawiesinę sinic o stężeniu 40 mg/mL.

Aby rozpocząć przygotowanie próbek do mikroobrazowania ESR, za pomocą precyzyjnej pincety pobierz kilka kwadratów papieru absorbującego o rozmiarze około 400 na 400 mikronów. Następnie umieść je w probówce typu einor. Po tym czasie napełnij probówkę 1,2 mililitra zawiesiny cyjanobakterii.

Następnie odwiruj zawiesinę przez dwie minuty przy 6 000 RPM w mikrocentryfugrze; po wirowaniu całkowicie usuń nadosad, z wyjątkiem około 50 µL, które pozostawia się, aby uniknąć odwodnienia cyjanobakterii. Proces ten prowadzi do nasycenia papieru absorbującego komórkami cyjanobakterii. Następnie przygotuj specjalnie przystosowany uchwyt do próbek w kształcie kielicha, wyciągnij kilka włókien z papieru za pomocą precyzyjnej pęsety i umieść je na dnie uchwytu do próbek.

Następnie, za pomocą strzykawki, dodaj 3 mM roztworu tridel oraz BG 11, przygotowanego zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Następnie uszczelnij uchwyt próbki za pomocą kleju utwardzanego promieniami UV, nakładając go pomiędzy krawędzie szklanego uchwytu i dopasowane do niego szkiełko przykrywowe, pozostawiając niewielki otwór odpływowy dla powietrza. Na koniec utwardź klej światłem UV przez 2 s.

Aby rozpocząć eksperyment obrazowania, włącz system mikroobrazowania ESR i włóż próbkę do rezonatora znajdującego się wewnątrz sondy obrazującej. Następnie, korzystając z oprogramowania sterującego komputerem, ustaw system w trybie strojenia i wyznacz rezonansową częstotliwość mikrofal sondy, która będzie wykorzystywana do pomiarów ESR. Po tym kroku ustaw statyczne pole magnetyczne na wartość odpowiadającą zastosowanej częstotliwości mikrofal.

Ustaw parametry czasowe sekwencji impulsów i obserwuj sygnał ESR, aby upewnić się, że system działa prawidłowo, a próbka jest odpowiednio przygotowana. Następnie ustaw parametry obrazowania, takie jak liczba pikseli, natężenie gradientów oraz długość impulsów gradientowych, na wymagane wartości. Po zakończeniu konfiguracji wykonaj trzy trójwymiarowe obrazy ESR za pomocą sekwencji impulsów Han Echo Imaging z wartościami odstępu międzyimpulsowego tau wynoszącymi 500 600 i 700 nanoseconds.

W tym momencie, jeśli wymagają tego warunki eksperymentalne podczas całego procesu akwizycji, włącz projekcję światła na próbkę; dane są zapisywane automatycznie. Po procesie akwizycji danych, pliki z surowymi danymi są przetwarzane za pomocą skryptu w oprogramowaniu MATLAB. Przy użyciu oprogramowania wygeneruj obrazy stężenia rodników trill oraz czasu relaksacji.

Następnie mapę T₂ przekształć w obraz stężenia tlenu, wykorzystując istniejącą krzywą kalibracyjną łączącą stężenie tlenu z czasem relaksacji. Tutaj T₂₀ to czas relaksacji spin-spin sondy w warunkach anoksycznych, zależny od stężenia sondy C oraz jej współczynnika dyfuzji D. Przedstawiono typowe surowe obrazy z kilku trójwymiarowych eksperymentów obrazowania ESR przeprowadzonych na cyjanobakteriach. Obrazy te uzyskano dla różnych wartości tau, zarówno w warunkach ciemności, jak i naświetlania.

W warunkach ciemności wyniki są bardzo podobne, z wyjątkiem zmniejszonej intensywności dla większych wartości T ze względu na spin oraz czas relaksacji spinowej T dwa. Odwrotnie, podczas naświetlania wzór obrazu ulega zmianie ze względu na różne czasy relaksacji w całej próbce. Następnie dane te są przetwarzane w celu uzyskania obrazu amplitudy z tego obrazu.

Widać wyraźnie, że sinice znajdują się głównie po prawej stronie uchwytu na próbkę. Dwa obrazy są przeliczane na wartości stężenia tlenu za pomocą istniejącej krzywej kalibracyjnej, która wiąże stężenie tlenu z czasem relaksacji. Wyniki przedstawiono dla sinic w obecności oraz w braku światła.

Jasno widać, że produkcja tlenu jest inicjowana światłem i powoduje znaczny wzrost stężenia tlenu w roztworze. Prowadzi to do spadku ilości rodnika T2, głównie w wokselach znajdujących się w pobliżu włókien papieru absorbującego z cyjanobakteriami. Właśnie pokazaliśmy, jak przygotować próbkę zawierającą żywe komórki ze stabilnym wolnym rodnikiem do mapowania stężenia tlenu za pomocą mikroskopii EESR. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby była ona możliwie jak najkrótsza, aby zapewnić zmienność S i uniknąć degradacji próbki.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentu.