Name: Transfekcja pojedynczych komórek w zarodkach piskląt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj metodę mikroinjekcji DNA plazmidowego do pojedynczych komórek somitów i rurek nerwowych zarodków kurzych. Technika ta umożliwia generowanie klonalnych populacji komórek ekspresujących zielone białko fluorescencyjne do badań funkcji genów in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Shlomi Krispin za obraz cewy nerwowej. W szczególności dziękujemy Yuval Cinnamon za wprowadzenie techniki transfekcji GFP. Praca ta była wspierana przez granty z Israel Science Foundation, Association Francaise contre les Myopathies oraz Deutche Forschungsgemeinshaft, Collaborative Research Centre 488 dla C.K.

1. Przygotowanie mikropipet
Wytwarzamy pipety za pomocą standardowej wyciągarki do pipet Narishige pp-83 przy ustawieniu temperatury na 13,5. Precyzyjne ustawienie musi zostać skalibrowane tak, aby średnica końcówki pipety wynosiła od 8 do 10 mikronów. Stosujemy borokrzemianowe rurki szklane z włóknem o średnicy zewnętrznej 1,0 mm i średnicy wewnętrznej 0,75-0,78 mm. Pipety są następnie przechowywane w plastikowym naczyniu, w taki sposób, aby końcówki były chronione przed kontaktem z krawędziami naczynia.
2. Przygotowanie DNA
Plazmidy zainteresowania są transfekowane do DH5α E. coli zgodnie ze standardowymi procedurami. Hodowle nocne z pojedynczych kolonii są wykorzystywane do oczyszczania plazmidów przy użyciu zestawów do maxi-prep (można zastosować dowolny komercyjny zestaw). W przypadku wstrzyknięć nieklonalnych stosujemy stężenie plazmidu 1,0 μg/ μL. Wyższe stężenia zwiększają ryzyko zapychania końcówek pipet. W zastosowaniach klonalnych stężenia plazmidów są znacznie niższe i muszą zostać odpowiednio dostosowane (patrz poniżej). Dla pCAGG-GFP optymalne stężenie pozwalające na uzyskanie wyników klonalnych wyniosło około 0,05-0,1 μg/ μL. W jednym eksperymencie zazwyczaj zużywa się od 1 do 2 μL plazmidu, a przed rozpoczęciem procedury do plazmidu dodaje się minimalną ilość proszku fast-green (przylegającego do końcówki suchej, ostrej pipety szklanej). Następnie plazmid jest wirowany w wirówce stołowej przez 2 minuty z maksymalną prędkością. Ta procedura wydaje się ograniczać problemy z zapychaniem pipet.
3. Iniekcja embrionów
3.1 Przygotowanie embrionów
Do iniekcji wykorzystujemy jaja przepiórcze oraz kurze. Jaja są inkubowane w pozycji leżącej wzdłuż ich długiej osi aż do osiągnięcia pożądanego stadium rozwojowego. Jaja przecieramy 70% etanolem i pozostawiamy do wyschnięcia. Zaostrzony koniec jaja przebija się nożyczkami chirurgicznymi (jest to konieczne tylko w przypadku jaj kurzych), a następnie z jaja pobiera się za pomocą strzykawki 10 mL (igła 19G) 1 mL (u przepiórek) lub 2 mL (u kur) białka jaja. Otwory są następnie uszczelniane gorącą parafiną.
Przed właściwym wstrzyknięciem, za pomocą nożyczek chirurgicznych, w górnej części skorupy jaja otwiera się okienko. Przyklejenie taśmy klejącej do skorupy i przecięcie jej przez taśmę może pomóc w ograniczeniu powstawania odłamków skorupy. Do jaja natychmiast pipetuje się bufor PBS zawierający antybiotyki. Aby uzyskać dostęp do zarodka, błony witelinowe i/lub owodni przecina się i odsuwa za pomocą szpilek entomologicznych 0,14 mm zamocowanych w uchwycie do igieł. Pod blastodermę wstrzykuje się nietoksyczny atrament (Pelican #17), aby ułatwić wizualizację zarodka, używając kapilary wyciąganej nad ogniem zamocowanej w aspiratorze.
3.2 Napełnianie i montaż mikropipet
Mikropipety do zaciągania można napełnić plazmidem za pomocą kapilar wyciąganych termicznie o odpowiedniej średnicy, zamontowanych na aspiratorze. Minimalną ilość plazmidu pobiera się za pomocą kapilary i wprowadza do pipety przez otwór znajdujący się naprzeciwko zaostrzonego końcówki, zbliżając się wewnątrz jak najbliżej czubka. Następnie pipetę montuje się w manualnym iniektorze ciśnieniowym osadzonym na mikromanipulatorze. W razie potrzeby przykłada się minimalne ciśnienie, aby umożliwić roztworowi plazmidu dotarcie do końcówki pipety.
3.3 Iniekcja plazmidu
Pipetę wprowadza się do medium ciekłego jaja, stosując niewielki nadciśnienie powietrza, aby zapobiec zapchaniu końcówki pipety. Następnie przebija się odpowiednią domenę tkankową. Zmiana ciśnienia w momencie wnikania końcówki w tkankę często wystarcza do uwolnienia plazmidu z widocznym barwnikiem fast green. Jeśli tak się nie stanie, należy lekko nacisnąć strzykawkę, aż do momentu wtryśnięcia plazmidu/fast green. Proces ten można powtórzyć wzdłuż osi zarodka, na przykład w sąsiednich somytach lub wzdłuż całego cewy nerwowej. Po wykonaniu wstrzyknięć można dodać PBS. Okno zostaje uszczelnione za pomocą taśmy klejącej (nie zaleca się stosowania paraf filmu, zwłaszcza w przypadku jaj przepiórczych – zwiększa on śmiertelność zarodków, prawdopodobnie poprzez blokowanie wymiany tlenu przez skorupę). Potraktowane zarodki przenosi się z powrotem do inkubatora. Należy unikać wentylacji i umieścić w inkubatorze małe pojemniki z wodą, ponieważ pomagają one utrzymać wilgotność i zwiększają przeżywalność. 
4. Dostosowanie parametrów wstrzyknięcia i monitorowanie wskaźników sukcesu
Ocena i kalibracja różnych parametrów iniekcji ma kluczowe znaczenie dla zastosowań ukierunkowanych na analizę pojedynczych komórek. Nie każde zdarzenie iniekcyjne doprowadzi do pomyślnego znakowania pojedynczej komórki. Zbyt wysokie stężenie plazmidu może prowadzić do znakowania nieklonalnego, podczas gdy stężenia bardzo niskie skutkują wysokim odsetkiem niepowodzeń. Stężenie wstrzykiwanego plazmidu musi zostać zoptymalizowane pod kątem iniekcji klonalnych. Zalecamy rozcieńczanie całego oczyszczonego zapasu plazmidu zamiast rozcieńczania poszczególnych preparatów do ustalonego stężenia. To drugie podejście może wprowadzić pewną zmienność w odsetku sukcesów, co prawdopodobnie wynika z różnic w czystości i innych parametrów, takich jak proporcja plazmidu superzwiniętego.
4.1 Ocena wskaźników sukcesu poprzez obserwację całego preparatu
Wstępna ocena wstrzykniętych embrionów może być przeprowadzona poprzez obserwację całego preparatu pod binokularem fluorescencyjnym. Od sześciu do ośmiu godzin po wstrzyknięciu jest wystarczającym czasem, aby ocenić skuteczność przy użyciu konstruktu pCAGG-enhanced GFP. Warunkiem jest, aby miejsce docelowe znajdowało się wystarczająco powierzchownie, by było łatwo widoczne (np. grzbietowy somyt, grzbietowa część cewy nerwowej, ektoderma itd., patrz Rycina 1A-C.). Krok ten jest szczególnie pomocny przy ocenie serii eksperymentalnych wykazujących albo zbyt wiele znakowanych komórek, albo przeciwnie, całkowity brak komórek fluorescencyjnych. Jeśli planowana jest dalsza inkubacja, po oględzinach do jaja należy dodać roztwór PBS z antybiotykami, a taśmę uszczelniającą należy wymienić.
4.2 Ocena klonalności poprzez analizę seryjnych przekrojów
Najlepszą metodą oceny skuteczności wstrzyknięć jest seryjne cięcie wstrzykniętych embrionów i zastosowanie immunohistochemii w celu wizualizacji znakowanych komórek. W tych warunkach czas inkubacji może być tak krótki, jak 4 godziny po wstrzyknięciu. Embriony są utrwalane i przygotowywane do cięcia w parafinie (lub kriosekcji). Następnie sekcje zamontowane na szkiełkach są odparafinowane i barwione immunochemicznie w celu wizualizacji reportera. Wskazane może być zastosowanie metod amplifikacji, takich jak biotyna-streptawidyna. Na koniec wykonuje się skanowanie sekcji seryjnych w celu wykrycia znakowanych komórek wstrzykniętych segmentach. Jeśli w pierwszych próbach uzyskano wiele komórek zamiast pojedynczych, należy rozcieńczyć roztwór plazmidu i powtórzyć proces aż do uzyskania odpowiednich wyników. W przypadku zbyt wysokiej skuteczności może być konieczne zastosowanie rozcieńczeń roztworu plazmidu od 2- do 10-krotnych.
Dla każdego plazmidu do transfekcji należy powtórzyć dokładną kalibrację zapewniającą klonalność.
5. Reprezentatywne wyniki
Zazwyczaj wykonujemy pojedynczą injekcję pCAGG-GFP na jeden somity, celując w 6-12 segmentów na jeden embrion 1 2. W takich warunkach wyraźny sygnał można wykryć podczas obserwacji całego preparatu (whole mount) 8 godzin po injekcji, w co najmniej jednym segmencie u jednego z dziesięciu embrionów. W tych warunkach potwierdzono ponadto, że znakowanie ma charakter klonalny (Rycina 1B,C). Przy zastosowaniu wysokich stężeń DNA u większości embrionów może wystąpić co najmniej jedna udana injekcja, co zwiększa prawdopodobieństwo transfekcji wielu komórek.
Analiza seryjnych przekrojów wykazała, że transfekcje klonalne osiągnięto przy skuteczności na poziomie około 10%. Oznacza to, że w celu uzyskania klonalności technika ta jest z definicji wysoce nieefektywna. Z drugiej strony, w tych warunkach stwierdzono, że ponad 93% zdarzeń pozytywnego znakowania miało charakter klonalny 1.
<img src="/files/ftp_upload/2133/2133fig1.jpg" alt="Obrazy mikroskopowe tkanki nerwowej; obrazowanie fluorescencyjne; analiza struktury komórkowej; neurorozwój." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rysunek 1. Klonalne iniekcje pCAGGS-GFP do progenitorów neuronalnych i szkieletowych. (A-C) Przekroje poprzeczne ukazujące znakowanie grzbietowej części rurki nerwowej (NT) (A), brzuszzobocznego obszaru dermomiotomu (DM) (B) lub centralnego arkusza DM (C), 6 godzin po mikroiniekcji pCAGGS-GFP do pojedynczej komórki progenitorowej. (D) Dwa dni po klonalnej transfekcji centralnego DM, pojedyncze komórki progenitorowe wytworzyły pochodne zarówno w skórze właściwej (D), jak i w mięśniach (M) (patrz ref.1 po szczegóły).

<ol><li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+analysis+of+the+avian+dermomyotome+sheet+reveals+the+existence+of+single+cells+with+both+dermal+and+muscle+progenitor+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates.</a> Development. 132, 689-701 (2005).</li>
<li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+and+bone+morphogenetic+protein+differentially+act+on+dermomyotome+cells+to+generate+endothelium%2C+smooth%2C+and+striated+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle.</a> J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).</li>
<li>Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+early+development+of+specific+hypaxial+muscles+from+the+ventrolateral+myotome.+%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. </a> Development. 126, 4305-4315 (1999).</li>
<li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+green+fluorescent+protein+as+a+single-cell+marker+in+living+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos.</a> Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).</li>
<li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li>
<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
<li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Dev Biol. 305, 616-624 (2007).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Opisana powyżej metoda jest modyfikacją wcześniej przedstawionej techniki dostarczania barwników lipofilnych do małych podzbiorów komórek lub pojedynczych komórek progenitorowych 3. Posiada ona trzy główne zalety w porównaniu ze standardową techniką elektroporacji. Po pierwsze, umożliwia ona pewne znakowanie dyskretnych obszarów w tkankach docelowych, co pozwala na znacznie większą rozdzielczość przestrzenną niż w przypadku elektroporacji (patrz np. Rysunek 1B,C). Po drugie, pozwala na znakowanie pojedynczych ...

<table><tbody><tr><td>Probówki do pipetowania</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary</td><td>Drummond Scientific</td><td>2-000-100</td><td></td></tr><tr><td>Igły entomologiczne</td><td>Watkins Doncaster</td><td>E6871</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Pen-Strep</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

transfekcja pojedynczych komórek w zarodkach kurczęt

Single Cell Transfection in Chick Embryos

Centralnym motywem biologii rozwoju jest dywersyfikacja linii komórkowych oraz wyjaśnienie leżących u ich podstaw mechanizmów molekularnych. Wiąże się to z dokładną analizą losów pojedynczych komórek w warunkach prawidłowych i eksperymentalnych. W tym celu niezbędne są metody transfekcji ukierunkowane na pojedyncze komórki progenitorowe. Opisujemy tutaj technicznie prostą metodę transfekcji pojedynczych komórek w tkankach kurczaka in-ovo, która umożliwia wiarygodne śledzenie linii komórkowych oraz manipulacje genetyczne. Celowane są konkretne domeny tkankowe w obrębie somitu lub cewy nerwowej, a DNA jest wstrzykiwane bezpośrednio do interesującego nas nabłonka, co skutkuje sporadyczną transfekcją pojedynczych komórek. Dzięki zastosowaniu genów reporterowych można w konsekwencji śledzić populacje klonalne do trzech dni, a zachowanie genetycznie zmodyfikowanych populacji klonalnych można porównać z grupami kontrolnymi. Metoda ta wykorzystuje dostępność zarodka kury oraz rozwijające się narzędzia do manipulacji genetycznych. Porównujemy i omawiamy jej zalety w stosunku do powszechnie stosowanej metody elektroporacji, a także sugerujemy możliwe zastosowania i użycie w dodatkowych modelach in-vivo. Rekomendujemy stosowanie tej metody jako istotnego uzupełnienia dla istniejących narzędzi do śledzenia linii komórkowych i interferencji genetycznej.

Za pomocą mikropipet z cienkimi końcówkami wstrzykujemy plazmidowe DNA do poddomen somitów lub cewek nerwowych kurczaka. Stężenie plazmidu jest tak dostosowane, aby uzyskać pojedyncze transfekowane komórki. Następnie pozwalamy komórkom przekształcić się w populacje klonalne.

Transfekcja pojedynczych komórek w zarodkach kurczęt

Centralnym motywem w biologii rozwoju jest dywersyfikacja linii komórkowych oraz wyjaśnianie leżących im u podstaw mechanizmów molekularnych. Wiąże się to z...

Ogólnym celem tej procedury jest wstrzyknięcie do pojedynczych komórek somytów lub cewek nerwowych piskląt plazmidu kodującego zielone białko fluorescencyjne. Jest to realizowane poprzez wstępne wyciągnięcie pipet do mikroiniekcji o odpowiedniej średnicy otworu końcówki. Drugim krokiem procedury jest przygotowanie zapasu plazmidu do iniekcji.Trzecim krokiem procedury jest przygotowanie embrionów do wstrzyknięcia. Czwartym krokiem procedury jest napełnienie mikropipet plazmidowym DNA. Ostatnim krokiem procedury jest wstrzyknięcie materiału do wybranych tkanek.Ostatecznie, za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej można uzyskać wyniki wykazujące zakres pochodnych w liczbie komórek wytworzonych przez pojedynczo znakowane komórki progenitorowe w wybranych poddomenach somytów i cewy nerwowej. Cześć, jestem Rael z laboratorium profesora Heima w Departamencie Neurobiologii Medycznej na Uniwersytecie Hebrajskim w Jerozolimie. Dzisiaj przedstawimy procedurę wstrzykiwania pojedynczych komórek do somytów i cewek nerwowych kurczaka.Stosujemy tę procedurę w laboratorium do badania segregacji linii komórek grzebienia neuronalnego i rurki nerwowej. Przejdźmy zatem do realizacji. Aby uzyskać pojedyncze przetransfekowane komórki w embrionach kurczaka, należy rozpocząć od dociągnięcia mikropipet. Pipety dociągamy za pomocą standardowego dociągacza do pipet Naga PP 83 przy ustawieniu temperatury na 13,5.Precyzyjne ustawienie musi zostać skalibrowane, aby uzyskać średnicę końcówki pipety od 8 do 10 mikronów. Stosujemy filament zawierający rurki z borokrzemianowego szkła o średnicy zewnętrznej 1 mm i średnicy wewnętrznej od 0,75 do 0,78 mm. Można również użyć dostępnych w handlu mikropipet, pozbawionych filamentu o średnicy zewnętrznej 1 mm i średnicy wewnętrznej 0,75 mm.Przygotowane pipety przechowuje się w plastikowym pojemniku w taki sposób, aby końcówki były chronione przed kontaktem z krawędzią naczynia. W celu przygotowania DNA do mikroiniekcji, interesujący nas plazmid jest transfekowany do szczepu DH5α E. coli. Następnego dnia, stosując standardowe procedury, plazmid jest oczyszczany za pomocą zestawu do Maxi prep; w przypadku iniekcji nieklonalnych stosujemy stężenie DNA wynoszące 1 µg/µL.W przypadku eksperymentów, w których pożądane jest uzyskanie pojedynczych klonów, stężenie plazmidu będzie znacznie niższe i będzie wymagało dostosowania. Dla P-C-A-G-G-F-P-A dobrze sprawdza się stężenie od 0,05 do 0,1 microgram per microliter. Po ustaleniu optymalnego stężenia zalecamy rozcieńczenie całego zapasu oczyszczonego plazmidu do określonego stężenia, zamiast przygotowywania poszczególnych porcji.To drugie może wprowadzić pewną zmienność w stopniu sukcesu, prawdopodobnie ze względu na różnice w czystości i innych parametrach, takich jak proporcja plazmidu superzwiniętego. Aby przygotować jaja kurzych do mikroiniekcji, jaja inkubowane w pozycji poziomej aż do osiągnięcia pożądanego etapu rozwoju przeciera się 70% ethanol i pozostawia do wyschnięcia. Następnie, za pomocą nożyczek chirurgicznych, przebija się ostry koniec jaja. Używając strzykawki o pojemności 10 mililitrów i igły o rozmiarze 19 gauge, odsysa się dwa mililitry albuminy z jaja, a następnie przed iniekcją uszczelnia otwory gorącą parafiną.Użyj nożyczek chirurgicznych, aby wyciąć okno w górnej części skorupki jaja, co zapobiegnie przedostaniu się zanieczyszczeń do otworu. Naklej kawałek taśmy na okno i wytnij w niej otwór. Aby ułatwić wizualizację zarodka, użyj kapilary wyciąganej ogniowo zamocowanej w aspiratorze, aby wstrzyknąć nietoksyczny atrament, taki jak pelican 17, pod usuniętą warstwę skóry.Następnie uzyskaj dostęp do zarodka, przecinając i odsuwając błony szyjne i/lub łożyskowe za pomocą szpilek entomologicznych 0,14 mm zamocowanych w uchwycie do igieł, aby wprowadzić DNA do wypalanej pipety Eloqua, a następnie za pomocą kapilary dodaj niewielką ilość proszku fast green. Pobierz minimalną ilość plazmidu do kapilary o odpowiedniej średnicy za pomocą aspiratora. Następnie wprowadź ją do końca pipety przeciwległego do zaostrzonej końcówki i wprowadź DNA jak najbliżej zaostrzonego końca.Następnie przymocuj pipetę do ręcznego wtryskiwacza ciśnieniowego zamontowanego na mikromanipulatorze. W razie potrzeby przyłóż minimalne ciśnienie, aby roztwór plazmidu dotarł do końcówki pipety. Wprowadź pipetę do cieczy jajowej, stosując niewielkie ciśnienie powietrza, aby zapobiec zapchaniu się końcówki pipety.Po przebiciu odpowiedniego obszaru tkanki zmiana ciśnienia jest często wystarczająca, aby uwolnić plazmid z widocznym fast green. Jeśli tak się nie stanie, należy wywrzeć lekki nacisk na strzykawkę, aż do momentu wydalenia mieszaniny plazmidu z fast green. Powtórz tę procedurę wzdłuż osi zarodka; po wstrzyknięciu można dodać PBS.Na koniec zaklej okno taśmą klejącą i umieść jaja z powrotem w inkubatorze. Unikaj wietrzenia i umieść w inkubatorze małe pojemniki z wodą, aby pomóc w utrzymaniu wilgotności i zwiększyć wydajność. Jeśli miejsce wstrzyknięcia było wystarczająco powierzchowne, aby było łatwo widoczne, np. w obrębie cewy nerwowej somity grzbietowej lub ektodermy, można zmierzyć skuteczność eksperymentu, wykonując obserwację całego preparatu przy użyciu fluorescencyjnego mikroskopu binokularnego.Ten krok jest szczególnie przydatny do oceny, czy oznakowano zbyt wiele lub zbyt mało komórek. Jeśli po oględzinach planowana jest dalsza inkubacja, należy dodać do jaja roztwór antybiotyków w PBS i ponownie nakleić taśmę uszczelniającą. Ponadto stopień powodzenia iniekcji można ocenić poprzez seryjne cięcie embrionów i wykonanie immunohistochemii.Po czterech lub więcej godzinach od wstrzyknięcia embriony są utrwalane i przygotowywane do cięcia w parafinie. Następnie preparaty zamontowane na szkiełkach są deparafinizowane i poddawane immunobarwieniu w celu wizualizacji reportera; pożądane może być zastosowanie metod amplifikacji, takich jak biotyna-streptawidyna. Na koniec seryjne przekroje są skanowane w celu wykrycia znakowanych komórek w wstrzykniętych segmentach.Jeśli podczas pierwszych prób uzyskuje się wiele komórek zamiast pojedynczych, należy rozcieńczyć zapas plazmidu i powtórzyć proces aż do uzyskania odpowiednich wyników. Zazwyczaj wykonujemy jedną iniekcję P-C-A-G-G-F-P na jeden somit, celując w sześć do 12 segmentów w każdym embrionie. Przy takich ustawieniach wyraźny sygnał można wykryć podczas obserwacji całego preparatu (whole mount) osiem godzin po iniekcji w co najmniej jednym segmencie w jednym z 10 embrionów.W tym przykładzie do segmentu so roztocza wstrzyknięto plazmid kodujący GFP, a pięć godzin później w widoku całego zarodka przedstawionym tutaj zaobserwowano pojedynczą fluorescencyjną komórkę. Po 24 godzinach od wstrzyknięcia do centralnego segmentu so, w widoku całego zarodka dwa dni po iniekcji klonalnej zaobserwowano klon komórek fluorescencyjnych. Wykonanie przekrojów tego segmentu ujawnia obecność potomstwa klonalnego zarówno w skórze właściwej, jak i w mięśniach, co dowodzi, że pojedyncze komórki progenitorowe generują obie te pochodne.Podobnie jak w przypadku somytów, pojedyncze neuroepithelialne komórki progenitorowe w grzbietowej części rurki nerwowej mogą zostać nakłute, co zilustrowano na tym przekroju poprzecznym, wykonanym fotograficznie pięć godzin po wstrzyknięciu. Analiza seryjnych przekrojów wykazała, że transfekcje klonalne osiągnięto przy skuteczności wynoszącej około 10%. Oznacza to, że w celu uzyskania klonalności technika ta jest z definicji wysoce nieefektywna. Z drugiej strony, w tych warunkach stwierdzono, że ponad 93% zdarzeń pozytywnego znakowania miało charakter klonalny.Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić mikroiniekcje pojedynczych komórek embrionów kurzych podczas realizacji tej procedury. Należy pamiętać o rozcieńczeniu dużej ilości zapasowego plazmidu do optymalnego stężenia dla infekcji pojedynczych komórek, a następnie stosowaniu go w trakcie wszystkich eksperymentów. To wszystko.Dziękujemy za obejrzenie i powodzenia w Państwa eksperymentach.

single-cell-transfection-in-chick-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Transfekcja pojedynczych komórek w zarodkach kurczaka

Elektroporacja in ovo zarodka kurczaka jest techniką pozwalającą na manipulacje genetyczne w embrionie ptaka. Typowe zastosowania tej metody obejmują analizę funkcjonalną genów oraz domniemanych elementów wzmacniających. Niniejszy film prezentuje elektroporację cewy nerwowej w embrionach kurczaka w stadium HH 10. Omówiono technikę iniekcji oraz prawidłową obsługę jaj.

Elektroporacja in ovo embrionów kurzych w stadium 10 według HH

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę transplantacji ludzkich komórek macierzystych do różnych obszarów ośrodkowego układu nerwowego zarodka kurczaka. Stanowi to model in vivo do oceny proliferacji i różnicowania różnych typów ludzkich komórek macierzystych w środowisku tkanki embrionalnej.

Ksenotransplantacja ludzkich komórek macierzystych do zarodka kurczaka

Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić celowaną iniekcję do siatkówki oraz elektroporację konstruktów DNA/RNA in ovo do siatkówki zarodka kurczaka w stadium 22-23 według skali Hamburgera i Hamiltona, co odpowiada około 4. dniu inkubacji (E4). Technika ta jest bardzo użyteczna w badaniu ekspresji genów, regulacji genów oraz zmian morfologicznych w rozwijającej się siatkówce kurczaka.

Elektroporacja in ovo siatkówki zarodka kurczaka

W celu oceny funkcji i regulacji genów podczas rozwoju dopaminergicznych neuronów śródmózgowia opisujemy metodę obejmującą elektroporację in ovo konstruktów plazmidowego DNA do embrionalnych progenitorów dopaminergicznych neuronów brzusznej części śródmózgowia kurczaka. Technika ta może być wykorzystana do uzyskania wydajnej ekspresji genów zainteresowania w celu zbadania różnych aspektów rozwoju śródmózgowia i różnicowania neuronów dopaminergicznych.

In ovo elektroporacja śródmózgowia kurczaka w celu badania funkcji genów w rozwoju neuronów dopaminergicznych

Ekspresja ektopowa to jedna z technik wyjaśniających rolę mikroRNA w rozwoju mózgu. Jednak celowanie w określone obszary za pomocą elektroporacji in ovo jest trudne. Tutaj pokazujemy skuteczny sposób selektywnego elektroportowania brzusznych i grzbietowych obszarów śródmózgowia.

In ovo Ekspresja mikroRNA w brzusznym śródmózgowiu piskląt

Hodowle embrionalnych komórek siatkówki kurcząt stanowią cenne narzędzia do badania biologii fotoreceptorów. Opracowaliśmy skuteczną technikę transferu genów opartą na elektroporacji plazmidowej siatkówki ex ovo przed hodowlą. Technika ta znacznie zwiększa wydajność transfekcji w porównaniu z obecnie dostępnymi protokołami, dzięki czemu manipulacja genetyczna jest możliwa dla tego systemu.

Efektywny transfer genów w siatkówkach piskląt w badaniach pierwotnych hodowli komórkowych: podejście do elektroporacji ex-ovo

Opisujemy metody fluorescencyjnego znakowania stycznie migrujących komórek za pomocą elektroporacji, oraz obrazowania poklatkowego ruchu oznaczonej komórki w hodowli płaskiej w celu wizualizacji zachowania migrujących komórek w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt.

Wizualizacja migracji komórek stycznych w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt

Opracowaliśmy nowatorskie podejście do utraty funkcji, które polega na wprowadzeniu i genomowej integracji sztucznych sekwencji mikro-RNA w zarodkach piskląt za pomocą elektroporacji in ovo i systemu transpozonów Tol2. Technika ta zapewnia solidną i stabilną metodologię knockdownu genów do badań funkcji genów podczas rozwoju.

Podejście do utraty funkcji w embrionalnej siatkówce pisklęcia przy użyciu transgenicznej ekspresji sztucznych mikroRNA za pośrednictwem transpozonu Tol2

Ogólnym celem tego artykułu jest opisanie, jak przeprowadzić wewnątrzkomórkową iniekcję in ovo materiałów egzogennych do zarodków kurcząt. Takie podejście jest bardzo przydatne do badania biologii rozwoju zarodków kurczaków.

In Ovo Iniekcja donaczyniowa w zarodkach kurczaka

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

Poznaj metodę mikroinjekcji DNA plazmidowego do pojedynczych komórek somitów i rurek nerwowych zarodków kurzych. Technika ta umożliwia generowanie klonalnych populacji komórek ekspresujących zielone białko fluorescencyjne do badań funkcji genów in vivo.

Transfekcja pojedynczych komórek w zarodkach kurczęt

Przeglądaj więcej filmów