Transfekcja pojedynczych komórek w zarodkach piskląt
25 września 2010
Za pomocą mikropipet z cienką końcówką wstrzykujemy plazmidowe DNA do subdomen kurzych somitów lub cew neuronowych. Stężenie plazmidu jest dostosowywane do generowania pojedynczych transfekowanych komórek. Następnie pozwalamy komórkom rozwinąć się w populacje klonalne.
Ogólnym celem tej procedury jest wstrzyknięcie pojedynczych komórek eleganckich somitów lub cew nerwowych z plazmidem kodującym białko zielonej fluorescencji. W tym celu należy najpierw wyciągnąć pipety do mikroiniekcji o odpowiedniej średnicy otworu końcówki. Drugim etapem zabiegu jest przygotowanie zapasu plazmidu do iniekcji.
Trzecim etapem zabiegu jest przygotowanie zarodków do wstrzyknięcia. Czwartym etapem procedury jest nałożenie na mikropipety plazmidowego DNA. Ostatnim etapem zabiegu jest wstrzyknięcie pożądanych tkanek.
Ostatecznie za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej można uzyskać wyniki, które pokazują zakres pochodnych w liczbie komórek wytwarzanych przez pojedynczo znakowane komórki progenitorowe w wybranych subdomenach som i cewy nerwowej. Cześć, nazywam się Rael i pracuję w laboratorium profesora Heima na Wydziale Neurobiologii Medycznej Uniwersytetu Hebrajskiego w Jerozolimie. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę wstrzykiwania pojedynczych komórek kurzych somitów i cew nerwowych.
Używamy tej procedury w laboratorium do badania segregacji liniowej komórek roztoczy i cewy nerwowej. Więc zacznijmy: Aby wygenerować pojedyncze transfekowane komórki w zarodkach piskląt, zacznij od wyciągnięcia mikropipet. Wyciągamy nasze pipety na standardowym ściągaczu do pipet Naga PP 83 o ustawieniu grzania 13,5.
Precyzyjne ustawienie musi być skalibrowane, aby uzyskać średnicę końcówki pipety od 8 do 10 mikronów. Używamy żarnika zawierającego rurki ze szkła krzemianowego Boris o średnicy zewnętrznej jednego milimetra i średnicy wewnętrznej od 0,75 do 0,78 milimetra. Można również użyć dostępnych na rynku mikropipet, bez filamentu o średnicy zewnętrznej jednego milimetra i średnicy wewnętrznej 0,75 milimetra.
Przygotowane pipety są przechowywane w plastikowym naczyniu z końcówkami zabezpieczonymi przed kontaktem z krawędzią naczynia. Aby przygotować DNA do mikroiniekcji, plazmid będący przedmiotem zainteresowania jest transfekowany do DH pięć alfa e coli. Stosując standardowe procedury następnego dnia, plazmid jest oczyszczany za pomocą zestawu przygotowawczego Maxi do zastrzyków nieklonalnych, używamy stężenia DNA jednego mikrograma na mikrolitr.
W przypadku eksperymentów, w których pożądane są indywidualne klony, stężenie plazmidu będzie znacznie niższe i będzie musiało zostać dostosowane. W przypadku P-C-A-G-G-F-P-A dobrze sprawdza się stężenie od 0,05 do 0,1 mikrograma na mikrolitr. Po ustaleniu optymalnego stężenia zalecamy rozcieńczenie całego oczyszczonego plazmidu, a nie poszczególnych preparatów do wcześniej określonego stężenia.
To ostatnie może wprowadzać pewne różnice we wskaźnikach sukcesu, prawdopodobnie ze względu na różnice w czystości i innych parametrach, takich jak proporcja plazmidu supercoil do przygotowania jaj do mikroiniekcji jaj kurzych, które były inkubowane, leżąc na długich osiach, aż do pożądanego stadium rozwojowego zostaną przetarte 70% etanolem i pozostawione do wyschnięcia. Następnie przebij spiczasty koniec jajka nożyczkami chirurgicznymi. Za pomocą 10-mililitrowej strzykawki i igły o rozmiarze 19 należy pobrać z jajka dwa mililitry albuminy, przed wstrzyknięciem uszczelnić otwory gorącą parafiną.
Użyj nożyczek chirurgicznych, aby otworzyć okienko w górnej części skorupki jajka, aby zapobiec przedostawaniu się zanieczyszczeń do otworu. Umieść kawałek taśmy na oknie i wytnij w nim otwór. Aby pomóc w wizualizacji zarodka, użyj ognistej kapilary zamontowanej na aspiratorze, aby wstrzyknąć nietoksyczny tusz, taki jak pelican 17, pod wysadzaną skórę właściwą.
Następnie uzyskaj dostęp do zarodka, przecinając i przekierowując błony życiowe i/lub owodniowe za pomocą 0,14 milimetrowych szpilek przeciw owadom zamontowanych na uchwycie igły, aby załadować DNA do wyciągniętej pipety Eloqua i dodać niewielką ilość szybkiego zielonego proszku za pomocą naczynia włosowatego. Narysuj minimalną ilość naczyń włosowatych zamontowanych na plazmidzie o odpowiedniej średnicy na aspiratorze. Następnie włóż go do końcówki pipety przeciwnej do zaostrzonej końcówki i załaduj DNA jak najbliżej zaostrzonego końca.
Następnie podłącz pipetę do ręcznego wtryskiwacza ciśnienia powietrza zamontowanego na mikromanipulatorze. W razie potrzeby należy zastosować minimalny nacisk, aby roztwór plazmidu dotarł do końcówki pipety. Manipuluj pipetą w płynnym podłożu jaja, wywierając pewne ciśnienie powietrza, aby zapobiec zatkaniu końcówki pipety.
Po przekłuciu odpowiedniej domeny tkankowej zmiana ciśnienia jest często wystarczająca, aby uwolnić plazmid z widoczną szybką zielenią. Jeśli tak się nie stanie, należy lekko docisnąć strzykawkę, aż do wyrzucenia szybko zielonej mieszaniny plazmidu. Powtórzyć tę procedurę wzdłuż osi zarodka po wstrzyknięciu, można dodać PBS.
Na koniec uszczelnij okno taśmą klejącą i włóż jaja z powrotem do inkubatora. Unikaj wentylacji i umieść w inkubatorze małe pojemniki z wodą, aby utrzymać wilgoć i zwiększyć plony. Jeśli miejsce docelowe wstrzyknięcia było na tyle powierzchowne, że było łatwo widoczne, na przykład w cewie nerwowej somitów grzbietowych lub ektodermie, można zmierzyć wskaźnik powodzenia eksperymentu, wykonując całą obserwację wierzchowca za pomocą lornetki fluorescencyjnej.
Ten krok jest szczególnie przydatny do oceny, czy oznaczono zbyt wiele lub zbyt mało komórek. Jeśli pożądana jest dalsza inkubacja, po obejrzeniu dodaj do jaja antybiotyki zawierające roztwór PBS i wymień taśmę sufitową. Ponadto można ocenić powodzenie wstrzyknięcia, seryjnie dzieląc zarodki i przeprowadzając immunohistochemię.
Po czterech godzinach lub dłużej zarodki po wstrzyknięciu są utrwalane i przetwarzane do sekcji parafinowej. Szklane sekcje są następnie finalizowane i pożądane może być barwienie immunologiczne do metody amplifikacji wizualizacji reporterowej, takie jak biotyna streptawidyna. Na koniec sekcje szeregowe są skanowane w celu wykrycia oznakowanych komórek w wstrzykniętych segmentach.
Jeżeli w początkowych próbach otrzyma się więcej niż pojedyncze komórki, zapas plazmidu musi zostać rozcieńczony w procesie powtarzanym aż do osiągnięcia odpowiednich wyników. Zazwyczaj przeprowadzamy pojedyncze wstrzyknięcie P-C-A-G-G-F-P na roztocza, celując w sześć do 12 segmentów na zarodek. W tym ustawieniu wyraźny sygnał może być wykryty przez obserwację całego wierzchowca, osiem godzin po wstrzyknięciu w co najmniej jednym segmencie w jednym zarodku na 10.
W tym przykładzie roztoczowi wstrzyknięto plazmid kodujący GFP, a pięć godzin później zaobserwowano pojedynczą komórkę fluorescencyjną w całym widoku zarodka pokazanego tutaj. Obserwowany 24 godziny po wstrzyknięciu do centralnego roztocza, klon komórek fluorescencyjnych obserwuje się w całym zamontowanym zarodku dwa dni po wstrzyknięciu klonalnym. Przekrój tego segmentu ujawnia obecność klonalnego potomstwa zarówno w skórze właściwej, jak i mięśniach, wykazując, że pojedyncze przodki generują obie pochodne.
Jeśli chodzi o somity, pojedyncze przodki nabłonka nerwowego w grzbietowej cewie nerwowej mogą być również przebite, jak pokazano w tym przekroju poprzecznym, sfotografowanym pięć godzin po wstrzyknięciu tutaj. Analiza przekroju szeregowego wykazała, że transfekt klonalny został osiągnięty, gdy wskaźnik sukcesu wynosił około 10%Oznacza to, że aby osiągnąć klonalność, technika ta jest z definicji wysoce nieefektywna. Z drugiej strony, w tych warunkach, ponad 93% pozytywnych zdarzeń oznaczania okazało się klonalnych.
Właśnie pokazaliśmy, jak wstrzykiwać pojedyncze komórki zarodków kurczaka podczas wykonywania tej procedury. Ważne jest, aby pamiętać o rozcieńczeniu dużej ilości plazmidu podstawowego do idealnego stężenia dla infekcji pojedynczych komórek, a następnie używać go podczas eksperymentów. Więc to wszystko.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę wstrzyknięcia DNA plazmidowego do pojedynczych komórek somitów lub kanałów nerwowych kurcząt za pomocą mikropipet z drobnymi końcówkami. Celem jest stworzenie klonalnych populacji transfektowanych komórek ekspresujących zieloną fluorescencyjną białko.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Inżynieria genetyczna
Tło
- Techniki mikroiniekcji są niezbędne do badania funkcji genów.
- Zarodki kurcząt są powszechnie używane jako organizm modelowy.
- DNA plazmidowe może być używane do ekspresji białek fluorescencyjnych w celu wizualizacji.
- Transfekcja pojedynczych komórek umożliwia analizę klonalnych populacji komórek.
Cel badania
- Rozwój niezawodnej metody wstrzyknięcia DNA plazmidowego do określonych tkanek.
- Generowanie pojedynczych transfektowanych komórek do dalszych badań.
- Ułatwienie obserwacji ekspresji genów w żywych zarodkach.
Stosowane metody
- Przygotowanie mikropipet z odpowiednimi średnicami końcówek.
- Przygotowanie roztworów macierzystych plazmidów do wstrzyknięcia.
- Przygotowanie zarodków kurcząt do mikroiniekcji.
- Wstrzyknięcie DNA plazmidowego do somitów lub kanałów nerwowych.
Główne wyniki
- Udane wstrzyknięcie DNA plazmidowego do docelowych tkanek.
- Generowanie pojedynczych transfektowanych komórek, które rozwijają się w klonalne populacje.
- Wizualizacja ekspresji genów za pomocą zielonej fluorescencyjnej białka.
- Ustanowienie protokołu dla przyszłych badań nad funkcją genów.
Wnioski
- Technika mikroiniekcji jest skuteczna w transfekcjonowaniu pojedynczych komórek.
- Ta metoda może być stosowana w różnych badaniach w biologii rozwoju.
- Przyszły badania mogą opierać się na tych wynikach, aby zbadać funkcję genów in vivo.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Single-cell transfection in chick embryos enables precise lineage tracing and genetic manipulation, supporting target validation in developmental pathways. This method provides mechanistic de-risking by linking progenitor behavior to phenotypic outcomes, informing early discovery decisions. Its reproducibility and quantitative clonal analysis enhance predictive confidence in preclinical model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking clonal progeny from single progenitors in somite and neural tube subdomains.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of derivative cell types (e.g., dermis and muscle) from labeled precursors.
- Strategic Value: Facilitates portfolio triage by comparing genetically manipulated clonal populations to controls for functional target assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows via sporadic transfection of single cells in defined tissue domains.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled plasmid concentration (0.05–0.1 µg/µl for clonal labeling) and consistent microinjection parameters.
- Strategic Value: Enhances screening readiness by enabling scalable, platform-compatible lineage tracing across multiple embryo segments (6–12 per embryo).
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling clonal dynamics in vertebrate embryogenesis, relevant to congenital disorder research.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation via immunohistochemistry and serial section analysis of transfected segments.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying clonal success rates (~10% transfection, >93% clonality among positives) to inform experimental scaling.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to lead identification via clonal functional analysis, and preclinical work through longitudinal phenotype tracking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling lineage tracing of single progenitors to elucidate fate diversification in somite and neural tube lineages.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible micropipette preparation (8–10 µm tip diameter) and standardized DNA loading protocols.
- Analytics: Provides quantitative outputs via immunofluorescent microscopy and section scanning to measure clonal expansion and derivative contribution over time.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing comparison of manipulated clonal populations to controls for up to three days post-injection.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across studies due to standardized embryo preparation, pipette calibration, and plasmid dilution workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in lineage relationships.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of single-cell transfection across developmental timepoints.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early clonal phenotyping.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative clonal derivation metrics.
Implementation Considerations
- Required expertise in micropipette pulling and embryo handling to achieve 8–10 µm tip diameters and successful tissue penetration.
- Instrumentation needs include micro manipulator, air pressure injector, and fluorescence microscopy for clonal tracking.
- Cross-team standardization requires consistent plasmid dilution (e.g., 0.05–0.1 µg/µl) and embryo staging protocols to ensure reproducible transfection rates.
- Adaptation considerations across model systems involve adjusting injection pressure and DNA concentration based on tissue accessibility and embryonic geometry.
- Practical limitations include low transfection efficiency (~10%), necessitating stock dilution and repeat injections to achieve single-cell resolution.
