Name: Bezpośrednia analiza pojedynczych komórek za pomocą spektrometrii mas pod ciśnieniem atmosferycznym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Poznaj metodę LAESI do bezpośredniej analizy pojedynczych żywych komórek roślinnych i zwierzęcych przy ciśnieniu atmosferycznym. Technika ta umożliwia badanie metabolitów i lipidów z minimalnym przygotowaniem próbki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe następującym instytucjom: National Science Foundation (Grant 0719232), Department of Energy (Grant DEFG02-01ER15129), W. M. Keck Foundation (Grant 041904) oraz George Washington University Research Enhancement Fund. Autorzy są wdzięczni firmie Infrared Fiber Systems (Silver Spring, MD) za hojne dostarczenie włókien optycznych na bazie GeO2, a także Markowi E. Reevesowi i Joan A. Hoffmann z George Washington University za wstępne dyskusje dotyczące protokołu trawienia włókien. Autorzy chcieliby również podziękować Jessice A. Stolee za pomoc podczas nagrywania wideo z procedury.

1. Komponenty optyczne
<ol>
<li>	Ablacja laserowa dla spektrometrii mas (MS) z jonizacją przez laserową ablację i rozpylanie elektrosprayowe (LAESI) jest realizowana za pomocą impulsu laserowego o czasie trwania 5 ns i długości fali 2,94 μm. Do ablacji w niniejszym badaniu wykorzystano strojony oscylator parametryczny sterowany laserem Nd:YAG (Opolette 10, Opotek Inc., Carlsbad, CA). Częstotliwość repetycji wybrano w zakresie od 5 do 100 Hz. Jest to laser klasy IV, który w przypadku bezpośredniej ekspozycji może spowodować poważne i trwałe uszkodzenia oczu lub skóry. Rozproszone odbicie wiązki laserowej może również stanowić zagrożenie dla skóry lub oczu. Należy używać odpowiednich gogli ochronnych do laserów. </li>
<li>	Włókno optyczne wykonane ze szkła na bazie dwutlenku germanu pozyskano z Infrared Fiber Systems, Inc. (Silver Spring, MD). Jeśli włókno posiada powłoki z Hytrelu i poliimidu, należy postępować zgodnie z poniższymi instrukcjami w celu ich usunięcia z końców. Podgrzać 1-metylu-2-pirolidynon do temperatury 130-150 °C w dygestorium. Zanurzyć końce włókna przeznaczone do zdjęcia powłoki w tym cieczu przez około 1 min lub do momentu, aż powłoka zacznie mięknąć i odklejać się. Zanurzyć zmiękczoną powłokę w metanolu lub izopropanolu na minutę, a następnie wytrzeć pozostałości powłoki niezrzucającą kłaczków chusteczką. Po usunięciu powłoki przeciąć oba końce włókna ostrzem szafirowym (KITCO Fiber Optics, Virginia Beach, VA) poprzez nacięcie i delikatne przełamanie.</li>
<li>	Aby uzyskać pożądaną ostrość, należy poddać jeden koniec końcówki włókna trawieniu chemicznemu w 1% (v/v) roztworze kwasu azotowego (czystości reagentowej). Zanurzyć pionowo wybrany koniec włókna w roztworze kwasu na głębokość od 300 do 50 μm po początkowym kontakcie. Po około 15 minutach trawienia końcówka samoistnie oddzieli się od powierzchni kwasu. W rezultacie powstanie zaostrzona końcówka włókna o promieniu krzywizny ~15 μm. Przepłukać wodą dejonizowaną, aby usunąć wszelkie pozostałości kwasu. </li>
<li>	Zamocować trawiony koniec włókna w mikromanipulatorze (MN-151, Narishige, Tokyo, Japan) i zbliżyć go do powierzchni komórki (odległość ~20 μm) w celu efektywnego dostarczenia energii.</li>
<li>	Nieutrawiony koniec włókna optycznego należy uchwycić w uchwycie do gołego włókna (BFC30, Siskiyou Corporation, Grants Pass, OR). W celu ustawienia optycznego uchwyt włókna zamontowano na translatorku pięcioosiowym (BFT-5, Siskiyou Corporation, Grants Pass, OR). Energię laserową (0,5 do 1 mJ) wprowadza się do włókna poprzez skupienie wiązki za pomocą soczewki plano-konweksnej z fluorku wapnia lub soczewki ZnSe z powłoką antyrefleksyjną (Infrared Optical Products, Farmingdale, NY) na jego nieutrawionym końcu. Do kierowania wiązką lasera średniofalowego IR na soczewkę skupiającą wykorzystuje się chronione lustra złote (PF10-03-M01, Thorlabs, Newton, NJ).</li>
</ol>
2. Konfiguracja elektrosprayu
<ol>
<li>	System do elektrorsikowania można zbudować, wykorzystując następujące komponenty: metalowe złącze z przewodzącą przelotką z perfluoroelastomeru, kształtki, tulejkę rurki, port igłowy (np. U-435, M215, F-31Nx, F-242x, 9013, odpowiednio IDEX Health &amp; Sciences, Oak Harbor, WA) oraz kapilary z topionego kwarcu (np. CT360-10-50-5, New Objective Inc., Woburn, MA). Zalecany emiter wykonany jest ze stali nierdzewnej i posiada stożkową końcówkę o średnicy wewnętrznej 50 μm (np. MT320-50-5-5, New Objective Inc., Woburn, MA).</li>
<li>	Do elektrorsikowania przygotować 50% roztwór metanolu z 0,1% kwasem octowym (v/v). Roztwór jest pompowany z prędkością od 200 do 30 nl/min za pomocą pompy strzykawkowej (Harvard Apparatus, Holliston, MA), używając np. strzykawki 50 μl (812, Hamilton Company, Reno, NV).</li>
<li>	Do metalowego złącza przyłożyć wysokie napięcie w zakresie od 2 80 do 3 0 V za pomocą regulowanego zasilacza (PS350, Stanford Research Systems Inc, Sunnyvale, CA), aby uzyskać stabilny prąd elektrorsikowania. Należy upewnić się, że wszystkie połączenia elektryczne są bezpieczne i ekranowane, a ekran jest odpowiednio uziemiony. Bezpośredni kontakt z odsłoniętym wysokim napięciem może doprowadzić do porażenia prądem.</li>
</ol>
3. Obsługa próbek
<ol>
<li>	Pobierz żywą próbkę tkanki lub komórek z odpowiedniego źródła i przechowuj je zgodnie z zaleceniami przed przeprowadzeniem analizy. Cebulki Allium cepa do niniejszej demonstracji zostały zakupione w lokalnym sklepie. Przetnij cebulkę wzdłuż za pomocą skalpela chirurgicznego. Odetnij fragment łuski o długości kilku centymetrów w postaci paska. Zdejmij nienaruszoną jednowarstwę wewnętrznej tkanki epidermy. </li>
<li>	Wykorzystaj wilgotną powierzchnię epidermy, aby zamocować tkankę na uprzednio oczyszczonym szklanym przedmioty szkiełku mikroskopowym. Przytrzymaj szkiełko za pomocą uniwersalnego uchwytu do płytek (FP01, Thorlabs Inc., Newton, NJ) zamontowanego na trójosiowej stole translacyjnej w celu pozycjonowania. Wykonaj pomiar widma masowego natychmiast po zamocowaniu próbki, aby zapobiec degradacji komórek.</li>
</ol>
4. System wizualizacji
<ol>
<li>	Do wyboru komórek do analizy oraz utrzymania odległości między zaostrzonym końcem włókna a powierzchnią komórki stosuje się dwa mikroskopy dalekiego zasięgu. Ten drugi jest zamontowany pod kątem 15°-30° mierzonym od powierzchni. System ten składa się z wideo-mikroskopu dalekiego zasięgu (optyka precyzyjnego zoomu 7x, Edmund Optics, Barrington, NJ) z korygowanym w nieskończoność obiektywem 5x (M Plan Apo 5x, Mitutoyo Co., Kanagawa, Japan) wyposażonym w kamerę CCD (Marlin F131, Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany) do monitorowania i przechwytywania obrazu.</li>
<li>	Drugi wideo-mikroskop jest zamontowany prostopadle do powierzchni próbki w celu wizualizacji komórek z góry. System ten zapewnia sprzężenie zwrotne wizualne, pozwalające na ustawienie końcówki włókna nad komórką wybraną do ablacji i analizy. Składa się on z optyki precyzyjnego zoomu 7x (Edmund Optics, Barrington, NJ), wyposażonej w korygowany w nieskończoność obiektyw 10x z długą odległością roboczą (M Plan Apo 10x, Mitutoyo Co., Kanagawa, Japan) oraz kamerę CCD.</li>
</ol>
5. Pozyskiwanie widm masowych
<ol>
<li>	Włącz laser, elektrospray oraz spektrometr mas, np. system kwadrupolowo-czasowy (Q-TOF Premier, Waters, Milford, MA). Zoptymalizuj geometrię źródła jonów LAESI, dostosowując wzajemne położenie punktu ablacji i emitera elektrosprayu względem siebie oraz wlotu spektrometru mas, aby uzyskać maksymalną intensywność jonów.</li> 
<li>	Wybierz analizowaną komórkę, korzystając z systemu wizualizacji z widokiem z góry. Po wyborze przesuń stół z próbką tak, aby wybrana komórka znalazła się bezpośrednio pod zaostrzonym końcem światłowodu. Za pomocą mikroskopu z widokiem z boku ponownie ustaw odległość końcówki od powierzchni komórki na ~20 μm.</li>
<li>	Kieruj impulsy laserowe na wybraną komórkę poprzez trawioną końcówkę światłowodu. Prowadzi to do perforacji ściany komórkowej i wyrzutu cytoplazmy w postaci cząsteczek materii. Po pojonizacji przez elektrospray powstałe jony są zbierane przez spektrometr mas, a następnie rejestrowane są widma masowe.</li>
<li>	Po akwizycji danych przełącz laser, elektrospray i spektrometr mas w tryb czuwania lub wyłącz je. Przechowuj ablowaną próbkę tkanki A. cepa do ewentualnej obserwacji pod mikroskopem świetlnym.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Pomyślna ablacja pojedynczej komórki skutkuje przerwaniem ściany komórkowej i zarejestrowaniem widma masy LAESI. Nieudany eksperyment zazwyczaj objawia się brakiem ablacji i/lub brakiem widma masy. W celach demonstracyjnych przedstawiamy wyniki analizy LAESI-MS pojedynczej, zatopionej komórki epidermy cebuli A. cepa. Rysunek 2a przedstawia reprezentatywny obraz z mikroskopii optycznej po pobraniu próbki z komórki. Ściana komórkowa jest perforowana, a zakres perforacji jest ograniczony przez granice z sąsiednimi komórkami. Komórki przyległe wydają się być nienaruszone. Rysunek 2b przedstawia reprezentatywne widmo masy LAESI uzyskane z komórki. Wykryto szeroką gamę jonów z komórki A. cepa, które na podstawie ich dokładnych mas, rozkładów izotopowych, a w niektórych przypadkach tandemowych widm mas, zostały wstępnie przypisane do endogennych metabolitów. Jony wykryte w pojedynczej komórce były podobne do tych zaobserwowanych podczas analizy tej samej tkanki metodą konwencjonalnego LAESI-MS wielu komórek.13
<img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig1.jpg" alt="Schemat spektrometrii mas: układ lasera IR, mikroskopia, pompa strzykawkowa, ESI do analizy próbek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat analizy pojedynczych komórek metodą LAESI-MSImpuls lasera średniej podczerwieni (mid-IR) jest wprowadzany do światłowodu i dostarczany do próbki umieszczonej na szkiełku przedmiotowym. Zaostrzony koniec światłowodu skupia światło w docelowej komórce, a dostarczona energia powoduje jej rozerwanie. Powstała chmura ablacyjna (czerwone kropki) łączy się z chmurą elektrosprayową (czarne kropki), a kroplami ulegają koalescencji (zielone kropki), co prowadzi do powstania jonów specyficznych dla próbki. Jony te są analizowane i wykrywane przez spektrometr mas (MS). Dwa mikroskopy wideo do obserwacji z dużej odległości, Mikroskop 1 i Mikroskop 2, służą odpowiednio do monitorowania odległości między końcem światłowodu a powierzchnią komórki oraz do wyboru komórki do analizy. 
<img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig2a.jpg" alt="Obraz mikroskopowy struktury komórki roślinnej, z podkreśleniem ściany komórkowej i wakuoli, skala 50 μm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2a"> 
Rysunek 2a. Ślad ablacji na pojedynczej komórce naskórka A. cepa żarówki. Sąsiednie komórki nie wykazują widocznych uszkodzeń i w konsekwencji mogą być analizowane osobno.
<img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig2b.jpg" alt="Wykres spektrometrii mas, analiza stosunku masy do ładunku (m/z), rozkład intensywności piku." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2b"> 
Rycina 2b. Widmo masowe odpowiadające ablacji pojedynczej A. cepa komórka epidermy wykazuje obecność metabolitów pierwotnych i wtórnych.

<ol><li>Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ambient Mass Spectrometry.</a> Science. 311, 1566-1570 (2006).</li>
<li>Chen, Z. Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+plume+expansion+in+atmospheric+pressure+midinfrared+laser+ablation+of+water-rich+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Early plume expansion in atmospheric pressure midinfrared laser ablation of water-rich targets.</a> Physical Review E. E77, 036316-036316 (2008).</li>
<li>Li, Y., Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+Pressure+Molecular+Imaging+by+Infrared+MALDI%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry.+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Atmospheric Pressure Molecular Imaging by Infrared MALDI.</a> Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 79, 523-532 (2006).</li>
<li>Li, Y., Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+Pressure+Infrared+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+for+Plant+Metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Atmospheric Pressure Infrared MALDI Imaging Mass Spectrometry for Plant Metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 80, 407-420 (2007).</li>
<li>Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+for+Atmospheric+Pressure+in+Vivo%2C+and+Imaging+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Laser Ablation Electrospray Ionization for Atmospheric Pressure in Vivo, and Imaging Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 79, 8098-8106 (2007).</li>
<li>Shrestha, B., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+pharmaceuticals+and+excreted+xenobiotic+and+endogenous+metabolites+with+atmospheric+pressure+infrared+MALDI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of pharmaceuticals and excreted xenobiotic and endogenous metabolites with atmospheric pressure infrared MALDI mass spectrometry.</a> Metabolomics. 4, 297-311 (2008).</li>
<li>Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+Molecular+Imaging+and+Depth+Profiling+of+Live+Tissue+by+Infrared+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ambient Molecular Imaging and Depth Profiling of Live Tissue by Infrared Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 80, 4575-4582 (2008).</li>
<li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Imaging+of+Metabolites+in+Tissues+under+Ambient+Conditions+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Imaging of Metabolites in Tissues under Ambient Conditions by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81, 6668-6675 (2009).</li>
<li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Imaging+of+Small+Metabolites+and+Lipids+in+Rat+Brain+Tissues+at+Atmospheric+Pressure+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82, 982-988 (2010).</li>
<li>Shrestha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+analysis+of+lipids+and+small+metabolites+in+mouse+brain+tissue+by+AP+IR-MALDI+and+reactive+LAESI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry.</a> Analyst. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sripadi, P., Nazarian, J., Hathout, Y., Hoffman, E., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+metabolites+from+the+untreated+tissue+of+Torpedo+californica+electric+organ+by+mid-infrared+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of metabolites from the untreated tissue of Torpedo californica electric organ by mid-infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Metabolomics. 5, 263-276 (2009).</li>
<li>Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Metabolic+Profiling+of+Single+Cells+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In Situ Metabolic Profiling of Single Cells by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81, 8265-8271 (2009).</li>
<li>Shrestha, B., Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+and+Analysis+of+a+Single+Cell+by+Consecutive+Laser+Pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+A%22%5BJournal%5D)">Ablation and Analysis of a Single Cell by Consecutive Laser Pulses.</a> Applied Physics A. , (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Zawartość wody w cytoplazmie komórki oraz wytrzymałość na rozciąganie ściany lub błony komórkowej są kluczowymi czynnikami warunkującymi ablację pojedynczych komórek podczas analizy LAESI-MS. Fluencję lasera należy dostosować tak, aby osiągnąć progi ablacji dla różnych typów komórek. Dostarczona fluencja lasera zależy od energii impulsu laserowego oraz od odległości między końcówką światłowodu a powierzchnią komórki. Kluczowe jest zminimalizowanie zaburzeń komórek sąsiednich podczas analizy pojedynczej komórki. Utrzymywanie energii lasera na poziomie progu ablacji ogranicza wpływ analizy na komórki przyległe.
Jednym z potencjalnych zastosowań jest wykorzystanie pojedynczych komórek jako naturalnych pikseli objętościowych (wokseli) w obrazowaniu chemicznym metodą MS. W porównaniu z gromadzeniem danych na sztucznej, często prostokątnej siatce, obrazowanie chemiczne tkanki w skali jednej komórki z większą dokładnością zachowuje organizację przestrzenną oddziaływań biochemicznych między komórkami.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy</td><td>Fluka</td><td>45727</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fluka</td><td>65548</td><td></td></tr><tr><td>1-metylu-2-pirolidynon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M79603</td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td>Fluka</td><td>39259</td><td></td></tr></tbody></table>

bezpośrednia analiza pojedynczych komórek za pomocą spektrometrii mas przy ciśnieniu atmosferycznym

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analiza substancji biochemicznych w pojedynczych komórkach jest istotna dla zrozumienia metabolizmu komórkowego, cyklu komórkowego, adaptacji, stanów chorobowych i innych procesów. Nawet komórki tego samego typu wykazują heterogeniczny skład biochemiczny w zależności od ich warunków fizjologicznych i interakcji z otoczeniem. Konwencjonalne metody spektrometrii mas (MS) stosowane do analizy biomolekuł w pojedynczych komórkach opierają się na rozbudowanym przygotowaniu próbek. Usunięcie komórek z ich naturalnego środowiska oraz intensywne przetwarzanie próbek mogą prowadzić do zmian w składzie komórkowym. Metody jonizacji w warunkach otoczenia umożliwiają analizę próbek w ich naturalnym środowisku i bez konieczności rozbudowanego przygotowania.1 Techniki oparte na ablacji laserowej materiałów biologicznych w średniej podczerwieni (mid-IR) przy długości fali 2,94 μm wykorzystują gwałtowną ekscytację wody, która prowadzi do eksplozji fazowej.2 Techniki jonizacji w warunkach otoczenia oparte na promieniowaniu laserowym mid-IR, takie jak jonizacja przez rozpylanie elektrosprayowe z ablacji laserowej (LAESI) oraz desorpcja laserowa wspomagana matrycą w podczerwieni przy ciśnieniu atmosferycznym (AP IR-MALDI), skutecznie wykazały zdolność do bezpośredniej analizy bogatych w wodę tkanek i płynów biologicznych pod ciśnieniem atmosferycznym.3-11 W LAESI pióropusz ablacji laserowej mid-IR, składający się głównie z neutralnej materii cząsteczkowej z próbki, łączy się z silnie naładowanymi kroplami elektrosprayu w celu wytworzenia jonów. Niedawno przeprowadzono ablację pojedynczych komórek mid-IR poprzez dostarczenie promieniowania mid-IR za pomocą trawionego włókna. Pióropusz wygenerowany podczas tej ablacji został poddany post-jonizacji przez elektrospray, co umożliwiło analizę różnorodnych metabolitów w pojedynczych komórkach za pomocą LAESI-MS.12 Niniejszy artykuł opisuje szczegółowy protokół analizy pojedynczych komórek z wykorzystaniem LAESI-MS. Przedstawiony film demonstruje analizę pojedynczej komórki naskórka z cebulki Allium cepa. Schemat systemu przedstawiono na Rysunku 1. Reprezentatywny przykład ablacji pojedynczej komórki oraz widmo masy LAESI z komórki znajdują się na Rysunku 2.

Analiza pojedynczych komórek jest przeprowadzana za pomocą spektrometrii mas w komórkach roślinnych i zwierzęcych pod ciśnieniem atmosferycznym, wykorzystując zaostrzony światłowód do pobierania próbek komórek w celu przeprowadzenia spektrometrii mas z jonizacją przez rozpylanie wspomaganą ablacją laserową (LAESI).

Bezpośrednia analiza pojedynczych komórek za pomocą spektrometrii mas przy ciśnieniu atmosferycznym

Analiza substancji biochemicznych w pojedynczych komórkach jest istotna dla zrozumienia metabolizmu komórkowego, cyklu komórkowego, adaptacji, stanów chorobowych itp. Nawet w przypadku tej samej komórki ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest usunięcie zawartości pojedynczej żywej komórki i jonizacja uwolnionych biomolekuł w celu ich analizy za pomocą spektrometru mas w ciśnieniu atmosferycznym. Jest to realizowane poprzez wybór pojedynczej komórki za pomocą mikroskopu dalekiego zasięgu i ablację wybranej komórki impulsem lasera o długości fali 2,94 µm dostarczanym przez zaostrzone światłowód. Ablacja pojedynczej komórki doprowadzi do powstania mikroskopijnego pióropusza neutralnej materii cząsteczkowej, który zostanie poddany jonizacji.Jest on przechwytywany przez rozpylacz elektrosprayowy. Naładowane kropelki z rozpylacza łączą się z cząsteczkami pióropusza ablacyjnego pochodzącego z komórki. Powstałe kropelki zostają nasycone cząsteczkami z komórki, co prowadzi do powstania odpowiednich jonów.Uzyskane wyniki przedstawiają widmo mas pojedynczej komórki. Widmo zawiera liczne piki związane z metabolitami i lipidami komórki. Dzień dobry, jestem dr Bin Drester z Laboratorium Verese w Katedrze Chemii na George Washington University.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę bezpośredniej analizy pojedynczych żywych komórek za pomocą spektrometrii mas pod ciśnieniem atmosferycznym. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania metabolitów i lipidów z pojedynczych komórek roślinnych i zwierzęcych. Zapraszamy do rozpoczęcia.Ablacja laserowa dla laserowej ablacji, jonizacji z rozpylania elektrostatycznego i spektrometrii mas, czyli tzw. LAESI MS, jest realizowana za pomocą pięciosekundowych impulsów laserowych o długości fali 2,94 µm. Do ablacji w niniejszym badaniu wykorzystano strojowalny oscylator parametryczny sterowany laserem Nd:YAG.Aby rozpocząć, zamocuj trawiony koniec światłowodu w mikromanipulatorze i zbliż go do powierzchni komórki. Dla efektywnego dostarczania energii przytrzymaj nietrawiony koniec światłowodu za pomocą uchwytu do gołych włókien w celu wyrównania optycznego. Uchwyt światłowodowy jest zamontowany na translatorze pięcioosiowym.Wprowadź energię lasera do włókna, skupiając wiązkę za pomocą soczewki plano-konweksowej z fluorku wapnia lub soczewki z selenku cynku z powłoką antyrefleksyjną na jego nie trawionym końcu; użyj zabezpieczonych luster złotych, aby skierować średniofalową podczerwoną wiązkę lasera na soczewkę skupiającą. Aby zachować odległość między zaostrzoną końcówką włókna a powierzchnią komórki, użyj długodystansowego mikroskopu wideo zamontowanego pod kątem od 15 do 30 stopni względem powierzchni. System ten składa się również z obiektywu z korekcją w nieskończoność o powiększeniu pięciokrotnym, wyposażonego w kamerę CCD do monitorowania i przechwytywania obrazów.Drugi mikroskop wideo jest zamontowany pod kątem prostym do powierzchni próbki, aby umożliwić wizualizację komórek od góry i ich wybór do analizy. System ten zapewnia sprzężenie zwrotne w postaci obrazu, co pozwala na precyzyjne ustawienie końcówki światłowodu nad wybraną komórką w celu przeprowadzenia ablacji i analizy. Składa się on z optyki z siedmiokrotnym precyzyjnym zoomem, obiektywu z korekcją nieskończoności o 10-krotnym powiększeniu i dużej odległości roboczej oraz kamery CCD.System elektrosprayu został zbudowany przy użyciu metalowej złączki z przewodzącymi elementami z perfluoroelastomeru, przymocowaniami typu feral, rurek, portu igłowego z tuleją oraz rurek FU z krzemionki. Rekomendowany emiter jest wykonany ze stali nierdzewnej i posiada stożkową końcówkę o średnicy 50 mikrometrów. Przygotuj 50% roztwór metanolu z 0,1% kwasem octowym do elektrosprayu. Pompuj roztwór z szybkością od 200 do 300 nanolitrów na minutę za pomocą pompy strzykawkowej.Za pomocą strzykawki o pojemności 500 µL, przy użyciu regulowanego zasilacza, do metalowego złącza zostanie przyłożone wysokie napięcie w zakresie od 2 do 803 000 V. Aby uzyskać stabilny elektrospray, należy upewnić się, że wszystkie połączenia elektryczne są zabezpieczone i osłonięte ekranem oraz odpowiednio uziemione, ponieważ bezpośredni kontakt z odsłoniętym wysokim napięciem może doprowadzić do porażenia prądem. Należy pobrać próbkę żywej tkanki lub komórek z odpowiedniego źródła i przechowywać je zgodnie z zaleceniami przed przeprowadzeniem analizy.Cebulki szczypiorku do tej demonstracji zostały zakupione w lokalnym skleży; w celu przygotowania próbki cebulki szczypiorku, należy przeciąć cebulkę wzdłuż za pomocą skalpela chirurgicznego i wyciąć fragment łuski o powierzchni około dwóch centymetrów kwadratowych. Następnie należy oddzielić nienaruszoną monowarstwę wewnętrznej tkanki epidermy. Wykorzystując wilgotną powierzchnię epidermy, należy zamocować tkankę na wcześniej oczyszczonym szkiełku przedmiotowym mikroskopu.Przedmioty szkiełko należy utrzymać za pomocą uniwersalnego uchwytu do płytek, zamontowanego na trójosiowym stole pozycjonującym. Widma masowe należy pozyskać bezpośrednio po zamontowaniu próbki, aby zapobiec degradacji komórek. Należy rozpocząć od włączenia lasera, rozpylacza elektrosprayowego oraz spektrometru mas.Zoptymalizuj geometrię źródła jonów LAESI, dostosowując położenie punktu ablacji i emitera elektrosprayu względem siebie oraz otworu spektrometru mas. Aby uzyskać maksymalną intensywność jonów, wybierz analizowaną komórkę, korzystając z systemu wizualizacji z widokiem z góry. Po dokonaniu wyboru przesuń stolik z próbką tak, aby wybrana komórka znalazła się bezpośrednio pod zaostrzonym końcem światłowodu.Korzystając z mikroskopu z widokiem bocznym, ponownie dostosuj odległość końcówki od powierzchni komórki do około 20 mikronów. Po ustawieniu prawidłowej pozycji, wyślij impulsy laserowe do wybranej komórki poprzez trawioną końcówkę włókna. Prowadzi to do perforacji ściany komórkowej i wyrzucenia cytoplazmy w postaci materii cząsteczkowej.Po jonizacji w elektrosprayu powstałe jony są zbierane przez spektrometr mas, a następnie rejestrowane są widma masowe. Po pobraniu danych należy przełączyć laser, elektrospray oraz spektrometr mas w tryb czuwania lub je wyłączyć. Próbkę tkanki allium cper po ablacji należy zachować do opcjonalnej obserwacji pod mikroskopem świetlnym; pomyślna ablacja pojedynczej komórki skutkuje rozerwaniem ściany komórkowej i uzyskaniem widma masowego typu „lazy mass spectrum”.Poniżej przedstawiono wyniki analizy lazy MS pojedynczej wbudowanej komórki epidermy cebuli allium SEPA, wraz z reprezentatywnym obrazem z mikroskopii optycznej. Po pobraniu próbki z komórki, jej ściana zostaje przebita, a zakres perforacji jest ograniczony granicami z sąsiednimi komórkami. Komórki przyległe wydają się być nienaruszone.Tutaj przedstawiono reprezentatywne widmo masowe LAESI uzyskane z komórki. Z każdej komórki cebuli wykryto szeroką gamę jonów, a na podstawie ich dokładnych mas, rozkładów izotopowych i tandemowych widm masowych jony zostały starannie przypisane do metabolitów endogennych. Jony wykryte z pojedynczej komórki były podobne do tych zaobserwowanych w analizie tej samej tkanki za pomocą konwencjonalnej metody LAESI MS z wielu komórek.Właśnie pokazaliśmy, jak analizować pojedyncze żywe komórki za pomocą spektrometrii mas pod ciśnieniem atmosferycznym. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o noszeniu okularów ochronnych, aby uniknąć przypadkowej ekspozycji na działanie laserów podczerwonych klasy czwartej. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

direct-analysis-single-cells-mass-spectrometry-at-atmospheric

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Bezpośrednia analiza pojedynczych komórek przez spektrometrę masową w ciśnieniu atmosferycznym

Laserowa ablacja z jonizacją elektrosprayową (LAESI) jest źródłem jonów dla spektrometrii mas pracującym pod ciśnieniem atmosferycznym. W trybie obrazowania laser średniofalowy w podczerwieni bada rozkład cząsteczek w przekroju tkanki lub biofilmie. Technika ta stanowi nowe podejście do różnorodnych badań bioanalitycznych prowadzonych w natywnych warunkach doświadczalnych.

Obrazowanie molekularne tkanek biologicznych i biofilmów w ciśnieniu atmosferycznym przy użyciu spektrometrii mas LAESI

Tutaj prezentujemy protokoły do wykonywania zarówno obrazowania tkanek za pomocą spektrometrii mas otoczenia (MSI), jak i analizy MS na żywo (SCMS) in situ przy użyciu pojedynczej sondy, która jest zminiaturyzowanym wielofunkcyjnym urządzeniem do analizy MS.

Zastosowania pojedynczej sondy: obrazowanie spektrometrią mas i analiza pojedynczych komórek w warunkach otoczenia

Przedstawiono metodę identyfikacji gatunków materiału botanicznego poprzez bezpośrednią analizę w czasie rzeczywistym - spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości i wielowymiarowa analiza statystyczna.

Szybka, wysokoprzepustowa identyfikacja gatunków materiału botanicznego za pomocą bezpośredniej analizy w czasie rzeczywistym Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości

Opisujemy kroki, które umożliwiają szybkie pobieranie próbek in situ małej części pojedynczej komórki z dużą precyzją i minimalną inwazją, przy użyciu mikropróbkowania opartego na kapilarach, aby ułatwić chemiczną charakterystykę migawki aktywności metabolicznej w żywych zarodkach przy użyciu specjalnie zbudowanej platformy do elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas z pojedynczą komórką.

Elektroforeza kapilarna z mikrosondą Spektrometria mas do metabolomiki pojedynczych komórek w żywych zarodkach żab (Xenopus laevis)

Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami została opracowana do użytku w połączeniu z jednosondowym zestawem spektrometrii mas do analizy on-line pojedynczych komórek zawiesinowych w warunkach otoczenia.

Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami w połączeniu z pojedynczą sondą do analizy spektrometrii mas leków i metabolitów w pojedynczych komórkach zawiesinowych

Ten protokół przedstawia zintegrowaną platformę spektroskopii Ramana i spektrometrii mas (MS), która jest w stanie osiągnąć rozdzielczość pojedynczej komórki. Spektroskopia Ramana może być stosowana do badania odpowiedzi komórkowej na leki, podczas gdy stwardnienie rozsiane może być wykorzystywane do ukierunkowanej i ilościowej analizy wychwytu i metabolizmu leków.

Zintegrowana platforma spektroskopii Ramana i spektrometrii mas do badania wychwytu, metabolizmu i efektów stosowania leków w pojedynczych komórkach

W tym protokole opisujemy, jak przygotować komórki ssaków do analizy proteomicznej pojedynczej komórki za pomocą spektrometrii mas przy użyciu dostępnych na rynku odczynników i sprzętu, z opcjami zarówno ręcznego, jak i automatycznego pipetowania.

Przygotowanie proteomiki jednokomórkowej do analizy spektrometrii mas z wykorzystaniem lizy cieplno-zamrażalniczej i nośnika izobarycznego

Protokół ten ma na celu zachowanie metabolitów komórkowych dla jednokomórkowej spektrometrii mas (SCMS) poprzez połączenie płukania lotnego roztworu soli, szybkiego hartowania ciekłym azotem, liofilizacji i przechowywania w temperaturze -8 °C. Wykazano, że hartowanie ciekłym azotem jest niezbędne do utrzymania profili metabolitów, podczas gdy długotrwałe przechowywanie w chłodni powinno być zminimalizowane, aby zapobiec zmianom metabolicznym.

Przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek

Ten protokół opisuje spektrometrię masową pojedynczych komórek obrazowania komórek OVCAR-8 z wykorzystaniem jonizacji z desorpcji i elektrozrygowania połączonych ze spektrometrami masowymi Orbitrap do metabolomiki wysokiej rozdzielczości przestrzennej.

Obrazowanie spektrometrii masowej pojedynczych komórek z wykorzystaniem jonizacji z dezorpcją za pomocą elektrycznej emisji rozpyłowej połączonej ze spektrometrami masy Orbitrap

Niniejszy film prezentuje przygotowanie ultrascienistej warstwy matrycy/analitu do analizy peptydów i białek za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-MS).

Przygotowanie próbek do analizy MALDI: metoda ultracienkiej warstwy

Poznaj metodę LAESI do bezpośredniej analizy pojedynczych żywych komórek roślinnych i zwierzęcych przy ciśnieniu atmosferycznym. Technika ta umożliwia badanie metabolitów i lipidów z minimalnym przygotowaniem próbki.

Bezpośrednia analiza pojedynczych komórek za pomocą spektrometrii mas przy ciśnieniu atmosferycznym

Przeglądaj więcej filmów