Bezpośrednia analiza pojedynczych komórek za pomocą spektrometrii mas przy ciśnieniu atmosferycznym

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest usunięcie zawartości pojedynczej żywej komórki i jonizacja uwolnionych biomolekuł w celu ich analizy za pomocą spektrometru mas w ciśnieniu atmosferycznym. Jest to realizowane poprzez wybór pojedynczej komórki za pomocą mikroskopu dalekiego zasięgu i ablację wybranej komórki impulsem lasera o długości fali 2,94 µm dostarczanym przez zaostrzone światłowód. Ablacja pojedynczej komórki doprowadzi do powstania mikroskopijnego pióropusza neutralnej materii cząsteczkowej, który zostanie poddany jonizacji.

Jest on przechwytywany przez rozpylacz elektrosprayowy. Naładowane kropelki z rozpylacza łączą się z cząsteczkami pióropusza ablacyjnego pochodzącego z komórki. Powstałe kropelki zostają nasycone cząsteczkami z komórki, co prowadzi do powstania odpowiednich jonów.

Uzyskane wyniki przedstawiają widmo mas pojedynczej komórki. Widmo zawiera liczne piki związane z metabolitami i lipidami komórki. Dzień dobry, jestem dr Bin Drester z Laboratorium Verese w Katedrze Chemii na George Washington University.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę bezpośredniej analizy pojedynczych żywych komórek za pomocą spektrometrii mas pod ciśnieniem atmosferycznym. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania metabolitów i lipidów z pojedynczych komórek roślinnych i zwierzęcych. Zapraszamy do rozpoczęcia.

Ablacja laserowa dla laserowej ablacji, jonizacji z rozpylania elektrostatycznego i spektrometrii mas, czyli tzw. LAESI MS, jest realizowana za pomocą pięciosekundowych impulsów laserowych o długości fali 2,94 µm. Do ablacji w niniejszym badaniu wykorzystano strojowalny oscylator parametryczny sterowany laserem Nd:YAG.

Aby rozpocząć, zamocuj trawiony koniec światłowodu w mikromanipulatorze i zbliż go do powierzchni komórki. Dla efektywnego dostarczania energii przytrzymaj nietrawiony koniec światłowodu za pomocą uchwytu do gołych włókien w celu wyrównania optycznego. Uchwyt światłowodowy jest zamontowany na translatorze pięcioosiowym.

Wprowadź energię lasera do włókna, skupiając wiązkę za pomocą soczewki plano-konweksowej z fluorku wapnia lub soczewki z selenku cynku z powłoką antyrefleksyjną na jego nie trawionym końcu; użyj zabezpieczonych luster złotych, aby skierować średniofalową podczerwoną wiązkę lasera na soczewkę skupiającą. Aby zachować odległość między zaostrzoną końcówką włókna a powierzchnią komórki, użyj długodystansowego mikroskopu wideo zamontowanego pod kątem od 15 do 30 stopni względem powierzchni. System ten składa się również z obiektywu z korekcją w nieskończoność o powiększeniu pięciokrotnym, wyposażonego w kamerę CCD do monitorowania i przechwytywania obrazów.

Drugi mikroskop wideo jest zamontowany pod kątem prostym do powierzchni próbki, aby umożliwić wizualizację komórek od góry i ich wybór do analizy. System ten zapewnia sprzężenie zwrotne w postaci obrazu, co pozwala na precyzyjne ustawienie końcówki światłowodu nad wybraną komórką w celu przeprowadzenia ablacji i analizy. Składa się on z optyki z siedmiokrotnym precyzyjnym zoomem, obiektywu z korekcją nieskończoności o 10-krotnym powiększeniu i dużej odległości roboczej oraz kamery CCD.

System elektrosprayu został zbudowany przy użyciu metalowej złączki z przewodzącymi elementami z perfluoroelastomeru, przymocowaniami typu feral, rurek, portu igłowego z tuleją oraz rurek FU z krzemionki. Rekomendowany emiter jest wykonany ze stali nierdzewnej i posiada stożkową końcówkę o średnicy 50 mikrometrów. Przygotuj 50% roztwór metanolu z 0,1% kwasem octowym do elektrosprayu. Pompuj roztwór z szybkością od 200 do 300 nanolitrów na minutę za pomocą pompy strzykawkowej.

Za pomocą strzykawki o pojemności 500 µL, przy użyciu regulowanego zasilacza, do metalowego złącza zostanie przyłożone wysokie napięcie w zakresie od 2 do 803 000 V. Aby uzyskać stabilny elektrospray, należy upewnić się, że wszystkie połączenia elektryczne są zabezpieczone i osłonięte ekranem oraz odpowiednio uziemione, ponieważ bezpośredni kontakt z odsłoniętym wysokim napięciem może doprowadzić do porażenia prądem. Należy pobrać próbkę żywej tkanki lub komórek z odpowiedniego źródła i przechowywać je zgodnie z zaleceniami przed przeprowadzeniem analizy.

Cebulki szczypiorku do tej demonstracji zostały zakupione w lokalnym skleży; w celu przygotowania próbki cebulki szczypiorku, należy przeciąć cebulkę wzdłuż za pomocą skalpela chirurgicznego i wyciąć fragment łuski o powierzchni około dwóch centymetrów kwadratowych. Następnie należy oddzielić nienaruszoną monowarstwę wewnętrznej tkanki epidermy. Wykorzystując wilgotną powierzchnię epidermy, należy zamocować tkankę na wcześniej oczyszczonym szkiełku przedmiotowym mikroskopu.

Przedmioty szkiełko należy utrzymać za pomocą uniwersalnego uchwytu do płytek, zamontowanego na trójosiowym stole pozycjonującym. Widma masowe należy pozyskać bezpośrednio po zamontowaniu próbki, aby zapobiec degradacji komórek. Należy rozpocząć od włączenia lasera, rozpylacza elektrosprayowego oraz spektrometru mas.

Zoptymalizuj geometrię źródła jonów LAESI, dostosowując położenie punktu ablacji i emitera elektrosprayu względem siebie oraz otworu spektrometru mas. Aby uzyskać maksymalną intensywność jonów, wybierz analizowaną komórkę, korzystając z systemu wizualizacji z widokiem z góry. Po dokonaniu wyboru przesuń stolik z próbką tak, aby wybrana komórka znalazła się bezpośrednio pod zaostrzonym końcem światłowodu.

Korzystając z mikroskopu z widokiem bocznym, ponownie dostosuj odległość końcówki od powierzchni komórki do około 20 mikronów. Po ustawieniu prawidłowej pozycji, wyślij impulsy laserowe do wybranej komórki poprzez trawioną końcówkę włókna. Prowadzi to do perforacji ściany komórkowej i wyrzucenia cytoplazmy w postaci materii cząsteczkowej.

Po jonizacji w elektrosprayu powstałe jony są zbierane przez spektrometr mas, a następnie rejestrowane są widma masowe. Po pobraniu danych należy przełączyć laser, elektrospray oraz spektrometr mas w tryb czuwania lub je wyłączyć. Próbkę tkanki allium cper po ablacji należy zachować do opcjonalnej obserwacji pod mikroskopem świetlnym; pomyślna ablacja pojedynczej komórki skutkuje rozerwaniem ściany komórkowej i uzyskaniem widma masowego typu „lazy mass spectrum”.

Poniżej przedstawiono wyniki analizy lazy MS pojedynczej wbudowanej komórki epidermy cebuli allium SEPA, wraz z reprezentatywnym obrazem z mikroskopii optycznej. Po pobraniu próbki z komórki, jej ściana zostaje przebita, a zakres perforacji jest ograniczony granicami z sąsiednimi komórkami. Komórki przyległe wydają się być nienaruszone.

Tutaj przedstawiono reprezentatywne widmo masowe LAESI uzyskane z komórki. Z każdej komórki cebuli wykryto szeroką gamę jonów, a na podstawie ich dokładnych mas, rozkładów izotopowych i tandemowych widm masowych jony zostały starannie przypisane do metabolitów endogennych. Jony wykryte z pojedynczej komórki były podobne do tych zaobserwowanych w analizie tej samej tkanki za pomocą konwencjonalnej metody LAESI MS z wielu komórek.

Właśnie pokazaliśmy, jak analizować pojedyncze żywe komórki za pomocą spektrometrii mas pod ciśnieniem atmosferycznym. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o noszeniu okularów ochronnych, aby uniknąć przypadkowej ekspozycji na działanie laserów podczerwonych klasy czwartej. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.