Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena występowania oddziaływań białko-białko na powierzchni komórki. Osiąga się to poprzez klonowanie dwóch interesujących receptorów, przy czym w drugim kroku końcowe fragmenty są łączone z dwoma fluoroforami o nakładających się widmach emisji. Oba wektory są jednocześnie transfekowane do komórek śródbłonka w celu ekspresji receptorów.

Na tym etapie fluorofory pomagają w ocenie ogólnego poziomu ekspresji oraz lokalizacji receptorów. Następnie, wykorzystując pojedynczą transfekcję jako kontrolę, ustala się parametry obrazowania na mikroskopie konfokalnym. Pojedyncze, transfektowane komórki są wybierane na podstawie względnych poziomów ekspresji i lokalizacji receptorów.

Następnie obrazowane są obszary wewnątrz tych komórek, aby ocenić zakres uzyskanych wyników FRET. Wykazują one oddziaływania Tie1 i Tie2 na powierzchni komórek śródbłonka na podstawie FRET i mikroskopii konfokalnej. Cześć, jestem Tom Seger z laboratorium dr. Williama Bartona w Katedrze Biochemii i Biologii Molekularnej na Virginia Commonwealth University.

Dzisiaj przedstawimy procedurę oceny oddziaływań białko-białko w komórkach śródbłonka za pomocą konfokalnej mikroskopii opartej na metodzie FRET. W naszym laboratorium wykorzystujemy tę metodę do badania oddziaływań receptorowych podczas angiogenezy. Zacznijmy zatem.

Aby zobrazować oddziaływania białko-białko przy użyciu testu zbliżenia opartego na FRET, należy rozpocząć od sklonowania interesujących receptorów do miejsc NHE I oraz Eco R I wektora pCDA3.1 hydro lub neo zawierającego monomer CFP lub YFP. Wyznaczenie wartości FRET ma charakter empiryczny i jest krytycznie zależne od długości łącznika między regionem transbłonowym a początkiem fluoroforu. W związku z tym dla każdej nowej badanej pary receptorów należy przetestować kilka różnych długości łączników. Wektory należy transformować i namnażać zgodnie z towarzyszącym protokołem.

Następnie należy przygotować DNA klasy transfekcyjnej, a wektory przekształcić i namnożyć zgodnie z dołączonym protokołem. Następnie przygotowujemy DNA klasy transfekcyjnej i rozcieńczamy je do stężenia roboczego 1 µg/µL. Aby przygotować komórki do transfekcji, w komorze z laminarnym przepływem powietrza należy przesiać komórki EAHY 92 6 hodowane w pełnej pożywce DMEM do szalek 35 mm z szkiełkami podstawowymi, zawierających 2 mL pożywki. Należy przygotować jedną szalkę do oceny ekspresji każdego pojedynczego receptora, a także jedną szalkę dla każdej pary receptorów.

Pozostawić komórki do inkubacji w atmosferze 95% dwutlenku węgla w temperaturze 37°C do następnego dnia. W dniu transfekcji kultura powinna osiągnąć około 70 do 90% konfluencji. Przygotować kompleksy nukleolipidowe, mieszając 2 µg DNA wektora chimerycznego receptora z 8 µl Fuji N HD w 200 µl uprzednio ogrzanego medium Opti-MEM. W przypadku par receptorów przeprowadzić transfekcję z użyciem 1 µg każdego receptora (łącznie 2 µg); wymieszać delikatnie przez odwracanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

W czasie inkubacji przygotuj komórki do transfekcji: odessaj świeżą pożywkę i delikatnie oraz krótko przemyj każdą płytkę ciepłym PBS przed dodaniem dwóch mililitrów podgrzanej, pełnej pożywki DMEM bez antybiotyków. Ważne jest, aby uniknąć obecności penicyliny i streptomycyny, ponieważ są one znacznie bardziej toksyczne dla komórek podczas traktowania kompleksami FU gene HD. Dodawaj kompleksy kroplowo do komórek i inkubuj przez kolejne 20 do 24 godzin. Po 24 godzinach ostrożnie odessaj pożywkę z komórek i pipetuj świeżą, pełną pożywkę DMEM z antybiotykami po transfekcji.

Żywotność komórek powinna pozostać na stosunkowo wysokim poziomie. Należy zaobserwować niewiele lub żadnych komórek pływających. Do obrazowania żywych komórek wykorzystujemy konfokalny skaningowy mikroskop laserowy A-T-C-S-P two A OBS wyposażony w niebieską diodę argonową oraz zielone, pomarańczowe i czerwone lasery helowo-neonowe, obiektyw H-C-X-P-I-A-O 63 x 1.3 NA z imersją glicerynową, zmotoryzowany stolik XY oraz inkubator stolikowy z kontrolą temperatury, wilgotności i poziomu dwutlenku węgla.

Kontrole eksperymentalne są kluczowe dla wyeliminowania przesłuchów fluorochromów między kanałami emisji, a także dla oceny problemów z ekspresją i niespecyficznej fluorescencji. W związku z tym, w celu konfiguracji każdej sesji obrazowania, wykorzystuje się transfekcje pojedynczym fluorochromem, aby wyeliminować przesłuchy między kanałami emisji dla CFP i YFP. Umieść kontrolę ekspresji CFP w inkubatorze stolika pod światłem białym.

Dostosuj położenie płytki Z, aby ustawić ostrość na komórkach. W oknie ustawień SP ustaw zakres detekcji emisji dla CFP od 465 do 505 nm oraz dla YFP od 525 do 600 nm; monitorując oba kanały emisji, wzbudzaj CFP przy 458 nm. Korzystając z A OTF, ustaw moc lasera tak, aby wyeliminować znaczący przeskok sygnału (bleed-over) z CFP do kanału emisji YFP.

Zapisz to ustawienie. Przeprowadź analogiczną kontrolę przesłuchu (crosstalk) YFP w kanale CFP, regulując moc wzbudzenia przy 514 nanometrach. Zapisz to ustawienie dla komórek wykazujących ekspresję wyłącznie YFP.

Następnie umieść komórki koekspresujące CFP i YFP w inkubatorze przedmiotowym. Korzystając z ustawień sekwencyjnych oprogramowania konfokalnego LICO, zlokalizuj komórki wykazujące podobne poziomy ekspresji CFP i YFP z prawidłową lokalizacją błonową, używając oprogramowania LICO oraz programu do fotobleachingu akceptora.

Ustaw parametry donora i akceptora zgodnie z zapisanymi ustawieniami dla CFP i YFP odpowiednio. Po przybliżeniu obrazu na komórkę, zaznacz obszar zainteresowania (ROI), w którym ma nastąpić fotodestrukcja YFP na błonie komórkowej, a następnie uruchom program fotodestrukcji akceptora. Ustaw A OTF na 100% dla 514 nanometrów i kontynuuj fotowybielanie laserowe do momentu, aż ulegnie wyczerpaniu 70% emisji YFP.

Aby przyspieszyć blaknięcie, podczas fotowybleszania zazwyczaj wybiera się ROI w osi rastrowej lasera. Należy monitorować ruch komórek i odrzucić pomiary uzyskane przy znacznym przemieszczeniu w płaszczyźnie XY. Ponieważ pomiary te mogą wykazywać fałszywe wartości wydajności FRET, rejestruje się obrazy przed i po blaknięciu zarówno dla donora, jak i akceptora, a wydajność FRET oblicza się według wzoru: wydajność FRET równa się (post - DLO) podzielone przez depost dla wszystkich depost większych niż D pre, gdzie D pre i D post to odpowiednio intensywności donora przed i po fotowybleszaniem.

Program JMP jest wykorzystywany do określenia zakresu zmienności eksperymentalnej. Poszczególne receptory powinny zostać połączone zarówno z CFP, jak i YFP, stosując sekwencje przybłonowe o różnej długości. Aby zidentyfikować optymalną parę partnerów FRET dla receptorów, wydajność transfekcji zazwyczaj mieści się w przedziale od 30 do 40%, pomimo wcześniejszych wyników uzyskanych przez innych badaczy.

Nie zaobserwowaliśmy, aby transfekcja i ekspresja jednego wektora sprzyjała ekspresji drugiego. W rzeczywistości często obserwujemy wyłączną ekspresję jednej z dwóch form. Te reprezentatywne obrazy przedstawiają analizę fotoblaknięcia akceptora w procesie FRET zachodzącym pomiędzy CFP a YFP w komórce EAHY 9 26.

Kanały emisji CFP i YFP monitorowano oddzielnie przed i po fotowybielaniu, a obliczenia ograniczono do wyznaczonego obszaru. Wewnątrz czerwonej ramki wydajność FRET przedstawiono w zakresie bezwzględnym od wysokiej wartości 1,0 (kolor czerwony) do niskiej wartości zero (kolor fioletowy) na powiększonym nałożeniu połączonego obrazu CFP i YFP, wyłącznie w celu orientacji dla układu receptora T. Typowe wartości wydajności FRET wynoszą od 20 do 28% dla komórek nabłonkowych oraz od 19 do 23% dla komórek śródbłonka, jak pokazano tutaj.

Po opanowaniu, technika ta zazwyczaj zajmuje od trzech do czterech dni, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że długość łącznika między białkiem docelowym a fuzyjnym białkiem fluorescencyjnym, a także poziomy ich ekspresji i ruch wewnątrzkomórkowy bezpośrednio wpływają na pomiar FRET po zakończeniu procedury. Ponadto, w celu uzyskania wglądu w szlaki transdukcji sygnału po ich opracowaniu, można przeprowadzić biochemiczne testy aktywacji sygnału.

Technika ta umożliwia przeprowadzenie analizy, w której można badać oddziaływania białko-białko o charakterze słabym lub przejściowym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania własnych analiz bliskości opartych na metodzie FRET w żywych komórkach. Prosimy pamiętać, że podczas pracy z hodowlami komórkowymi należy zawsze przestrzegać odpowiednich zasad bezpieczeństwa.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przyszłych eksperymentach z fretami.