Name: Obrazowanie interakcji białko-białko in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Poznaj metodę FRET do obrazowania interakcji białko-białko na powierzchni komórek śródbłonka. Technika ta pozwala badać interakcje receptorów podczas angiogenezy z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować dr. Scottowi Hendersonowi za pomoc w zakresie mikroskopii konfokalnej. Badania te były wspierane przez granty z National Institutes of Health 1RO1CA127501 dla W.A.B., a także przez fundusze na projekt pilotażowy z Massey Cancer Center oraz School of Medicine (VCU) dla W.A.B. Mikroskopia została przeprowadzona w VCU-Dept. of Neurobiology &amp; Anatomy Microscopy Facility, wspieranej częściowo funduszami z grantu rdzeniowego NIHNINDS Center 5P30NS047463.

Protokół składa się z trzech głównych etapów. Pierwszy krok, polegający na klonowaniu genu zainteresowania do ssaczego wektora ekspresyjnego na N-końcu monomerycznych wersji CFP i/lub YFP, zostanie omówiony jedynie krótko. Drugi i trzeci etap, czyli transfekcja DNA wektorowego do komórek śródbłonka EA.hy926 oraz obrazowanie konfokalne z wykorzystaniem FRET, zostały opisane poniżej bardziej szczegółowo.
1. Konstrukcja chimerycznych receptorów CFP i YFP
Badane receptory należy sklonować na N-końcu monomerycznych, ulepszonych wersji CFP i YFP. Wyznaczenie FRET ma charakter empiryczny i jest krytycznie zależne od długości łącznika między regionem transbłonowym a początkiem fluoroforu1. W związku z tym dla każdej nowej badanej pary receptorów należy przetestować kilka różnych długości łącznika.
<ol>
<li> Do wektora pcDNA3.1 hygroR lub neoR zawierającego monomeryczny C- lub YFP (wektor ten można uzyskać z naszego laboratorium), sklonować wybrany receptor do miejsc NheI/EcoRI. *Uwaga: W razie potrzeby NheI jest kompatybilny z kilkoma innymi enzymami, w tym SpeI i XbaI.</li>
<li> Przenieść produkt reakcji ligacji poprzez transformację do odpowiedniej linii kompetentnych komórek endA1 recA (my rutynowo stosujemy Mach1). Przesiać kolonie w celu sprawdzenia obecności insertu, a następnie przeprowadzić sekwencjonowanie DNA, aby zweryfikować brak mutacji.</li>
<li> Po potwierdzeniu sukcesu klonowania molekularnego, przygotować DNA wektora o jakości do transfekcji w wodzie sterylnej lub buforze TE, korzystając z zestawów do izolacji DNA firmy Qiagen lub podobnych. Ocenić stężenie i czystość za pomocą spektroskopii UV. Typowe wydajności DNA powinny mieścić się w zakresie 100-200 μg, co rutynowo rozcieńcza się do stężenia roboczego 1 μg/μL.</li>
</ol>
2. Transfekcja komórek EA.hy 926
<ol>
<li> Przesiej komórki EA.hy 9264, hodowane w pełnym medium DMEM (DMEM+10% płodowa surowica bydlęca+Pen./Strep.), do szalek 35 mm z nakrywkami MatTek (No. 0) zawierających 2 mL medium. Z jednej konfluentnej szalki 15 cm można konserwatywnie uzyskać ~15 szalek (~90% konfluencji następnego dnia). Przygotuj jedną szalkę do oceny ekspresji każdego pojedynczego receptora, a także jedną szalkę dla każdej pary receptorów.</li>
<li> Inkubuj komórki przez noc w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37°C. Następnego dnia hodowle powinny osiągnąć konfluencję ~70-90%.</li>
<li> W dniu transfekcji przygotuj kompleksy nukleolipidowe, mieszając 2 μg DNA wektora chimerycznego receptora (2 μL) z 8 μL Fugene6 w 200 μL uprzednio ogrzanego OptiMEM. W przypadku par receptorów wykonaj transfekcję przy użyciu 1 μg każdego receptora, co daje łącznie 2 μg (zob. również dyskusję poniżej).</li>
<li> Wymieszaj delikatnie poprzez odwracanie probówki.</li>
<li> Kontynuuj inkubację w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
<li> W czasie inkubacji przygotuj komórki do transfekcji. Odessaj świeże medium i delikatnie oraz krótko przemyj każdą płytkę ciepłym PBS, a następnie dodaj 2 mL uprzednio ogrzanego pełnego DMEM bez antybiotyków (DMEM+FBS). Ważne jest, aby uniknąć obecności penicyliny i streptomycyny, ponieważ są one znacznie bardziej toksyczne dla komórek podczas traktowania Fugene6.</li>
<li> Dodaj kompleks kroplami do komórek i inkubuj przez kolejne 20-24 godziny w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2.</li>
<li> Po 24 godzinach ostrożnie odessaj medium z komórek i pipetuj świeże pełne DMEM z antybiotykami. Po transfekcji żywotność komórek powinna pozostać stosunkowo wysoka, tzn. nie powinno być obserwowanych prawie żadnych komórek pływających.</li>
<li> Ekspresja genów jest zazwyczaj maksymalna po kolejnych 48-60 godzinach od transfekcji. Jednak obrazowanie jest zazwyczaj możliwe już po 24 godzinach. Należy przeprowadzić eksperymenty z analizą przebiegu czasowego w celu optymalizacji ekspresji genów.</li>
</ol>
3. Obrazowanie konfokalne i analiza FRET
Obrazowanie żywych komórek jest wykonywane przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego Leica TCS-SP2 AOBS wyposażonego w lasery: niebieską diodę (405 nm), argonowy (458, 476, 488, 514 nm), zielony HeNe (543 nm), pomarańczowy HeNe (594 nm) i czerwony HeNe (633 nm), obiektyw HCX PI Apo 63x/1.3 n.a. z imersją glicerynową, zmotoryzowany stół XY (Märzhäuser) oraz inkubator stołowy z kontrolą parametrów środowiskowych (temperatury, wilgotności i CO2) (PeCon). Kontrole eksperymentalne są niezbędne w celu wyeliminowania przesłuchów między kanałami emisji fluoroforów, a także oceny problemów z ekspresją i nieswoistej multimeryzacji fluoroforów. W związku z tym, do konfiguracji każdej sesji obrazowania wykorzystuje się transfekcje pojedynczym fluoroforem. Należy przeprowadzić negatywne kontrole FRET (z użyciem znanych receptorów nieoddziałujących), aby określić poziom tła FRET wynikający z nadekspresji.
<ol>
<li>Aby wyeliminować przesłuchy (crosstalk) między kanałami emisji CFP i YFP, umieść kontrolę ekspresji CFP w inkubatorze stolika. Korzystając ze światła białego, dostosuj płytkę Z, aby ustawić ostrość na komórkach.</li>
<li>Ustaw zakresy okna SP dla detekcji emisji CFP na 465-505 nm oraz YFP na 525-600 nm.</li>
<li>Monitorując oba kanały emisji, wzbudź CFP przy 458 nm. Za pomocą AOTF ustaw moc lasera tak, aby wyeliminować znaczące przenikanie (bleed over) CFP do kanału emisji YFP. Zapisz to ustawienie.</li>
<li>Przeprowadź analogiczną kontrolę przesłuchów YFP (używając kontroli ekspresji YFP) w kanale CFP, dostosowując moc wzbudzenia przy 514 nm dla komórek wykazujących ekspresję wyłącznie YFP. Zapisz to ustawienie.</li>
<li>Następnie umieść w inkubatorze stolika komórki koekspresujące CFP i YFP. Korzystając z ustawień sekwencji w oprogramowaniu konfokalnym Leica, zlokalizuj komórki wykazujące podobne poziomy CFP i YFP z prawidłową lokalizacją błonową.</li>
<li>Używając programu fotowybielania akceptora w oprogramowaniu Leica, ustaw parametry donora i akceptora zgodnie z wcześniej zapisanymi ustawieniami dla CFP i YFP odpowiednio.</li>
<li>Po powiększeniu obrazu komórki, zaznacz ROI (region zainteresowania), w którym ma nastąpić fotodestrukcja YFP na błonie komórkowej, i uruchom program.</li>
<li>W celu fotodestrukcji akceptora ustaw AOTF na 100% przy 514 nm i kontynuuj wybielanie laserowe, aż do momentu utraty 70% emisji YFP. Aby przyspieszyć wybielanie, ROI zazwyczaj wybiera się w osi rastra lasera (oś X).</li>
<li>Podczas fotowybielania monitoruj ruch komórkowy i odrzuć pomiary uzyskane przy znacznym ruchu w płaszczyźnie XY, ponieważ mogą one wykazać fałszywą wydajność FRET.</li>
<li>Obrazy przed i po wybielaniu są rejestrowane zarówno dla donora (CFP), jak i akceptora (YFP), a wydajność FRET obliczana jest jako: FRETEff=(Dpost-Dpre)/Dpost dla wszystkich Dpost &gt; Dpre, gdzie Dpre i Dpost to odpowiednio natężenie donora przed i po fotowybielaniu.</li>
<li>Oprogramowanie JMP (SAS) jest wykorzystywane do określenia zakresu zmienności eksperymentalnej.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Wydajność transfekcji zazwyczaj mieści się w przedziale od 30 do 40%. W przeciwieństwie do wcześniejszych doniesień innych autorów, nie zaobserwowaliśmy, aby transfekcja i ekspresja jednego wektora sprzyjała drugiemu. W rzeczywistości często obserwujemy wyłączną ekspresję jednej lub drugiej chimery fluoroforu. Typowe wydajności FRET różnią się w zależności od systemów receptorowych. Dla systemu receptorów Tie typowe wartości wynoszą 20-28% w komórkach nabłonkowych i 19-23% w komórkach śródbłonkowej. W przypadku kontroli negatywnych typowe wydajności są niższe niż 2-3%. Zakres zmienności znacznie zmniejszy się wraz z nabywanym doświadczeniem.
<img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig1.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna komórek; A-C przedstawiają strukturę komórkową i znakowanie fluorescencyjne, wyniki eksperymentu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Reprezentatywne obrazy transfekowanych komórek EA.hy 926. A) Obraz DIC monowarstwy komórek EA.hy 926. B) Obraz fluorescencyjny komórek przedstawionych na (A). C) Nałożenie obrazów (A) i (B) wykazujące wydajność transfekcji na poziomie ~20-30%.
<img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig2.jpg" alt="Schemat fluorescencyjnego odzyskiwania po fotowybielaniu (FRAP) z wynikami analizy CFP i YFP." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywna analiza fotowybielania akceptora dla FRET zachodzącego między CFP a YFP w komórce EA.hy926. Kanał emisji CFP (panele górne) oraz kanał emisji YFP (dwa panele dolne) były monitorowane oddzielnie przed i po fotowybielaniu akceptora. Eksperymenty z fotowybielaniem były ograniczone do obszaru wewnątrz zielonej ramki, z którego obliczono wartości FRET. Efektywność FRET została przedstawiona jako zakres bezwzględny od wysokiej (czerwony-1.0) do niskiej (fioletowy-0.0) na powiększonym nałożeniu zmergedowanego obrazu CFP/YFP wyłącznie w celu orientacji.

<ol><li>Kim, M., Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+transmembrane+signaling+by+cytoplasmic+domain+separation+in+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins.</a> Science. 301, 1720-1725 (2003).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipidmodified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipidmodified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li>
<li>Seegar, T. C. M., Eller, B., Tzvetkova-Robev, D., Kolev, M., Henderson, S. C., Nikolov, D. B., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie1-Tie2+interactions+mediate+functional+differences+between+angiopoietin+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Tie1-Tie2 interactions mediate functional differences between angiopoietin ligands.</a> Molecular Cell. 37 (5), 643-655 (2010).</li>
<li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (12), 3734-3737 (1983).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Istnieje kilka kroków krytycznych dla sukcesu procedury. Najważniejszym z nich są względne poziomy ekspresji dwóch receptorów chimerycznych. Aby rozwiązać ten problem, można stworzyć stabilne linie komórkowe wykazujące ekspresję obu białek zainteresowania lub określić optymalne proporcje DNA wektora, aby umożliwić równoważną ekspresję. Podobnie, ze względu na nierównomierną transfekcję w obrębie szalki, poziomy białek rzadko będą jednakowe we wszystkich komórkach. Dlatego należy zwrócić uwagę na rozróżnienie komórek o „wysokiej” ekspresji od tych o „niskiej”. Komórki wykazujące „przeciętne” poziomy białka zazwyczaj dają wiarygodne i powtarzalne wartości wydajności FRET. Jedną z metod, którą nasze laboratorium zastosowało w celu zniwelowania tego problemu, jest użycie wirusów adenowirusowych i lentiwirusowych w celu „wyrównania” ekspresji genów. Ponadto alternatywną metodą dla fotowybielania akceptora w określaniu wydajności FRET jest emisja sensybilizowana. Jednak pomimo potencjału emisji sensybilizowanej do monitorowania pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym, stwierdziliśmy, że fotowybielanie akceptora jest bardziej czułe i bardziej niezawodne.
Wreszcie, wykorzystanie FRET do monitorowania oddziaływań białkowych może być problematyczne i wymaga starannego doboru długości łączników dla receptorów związanych z błoną. Co więcej, dodanie C/YFP często znacząco wpływa na poziomy ekspresji białek i prowadzi do ich agregacji w siateczce śródplazmatycznej oraz aparacie Golgiego. Niemniej jednak, w przypadku oddziaływań przejściowych lub niestabilnych, FRET jest idealną metodologią do zastosowania.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960-069</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Hyclone</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE 6</td><td>Roche Group</td><td>11814443001</td><td></td></tr><tr><td>Szalki z zakrywek</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G014C</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1(+)</td><td>Invitrogen</td><td>V790&amp;#8208;20</td><td></td></tr><tr><td>Komórki kompetentne Mach 1</td><td>Invitrogen</td><td>C862003</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Interakcje białko-białko są cechą charakterystyczną wszystkich kluczowych procesów komórkowych. Jednak wiele z tych oddziaływań ma charakter przejściowy lub jest energetycznie słabe, co uniemożliwia ich identyfikację i analizę za pomocą tradycyjnych metod biochemicznych, takich jak koimmunoprecypitacja. W związku z tym genetycznie kodowane białka fluorescencyjne (GFP, RFP itp.) oraz związane z nimi nakładające się widma fluorescencji zrewolucjonizowały naszą zdolność do monitorowania słabych interakcji in vivo z wykorzystaniem transferu energii rezonansowej Förstera (FRET)1-3. W niniejszym materiale szczegółowo opisujemy zastosowanie testu zbliżenia opartego na FRET do monitorowania interakcji receptor-receptor na powierzchni komórek śródbłonka.

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Oddziaływania białko-białko są charakterystyczną cechą wszystkich kluczowych procesów komórkowych. Jednak wiele z tych oddziaływań ma charakter przejściowy lub jest słabych energetycznie, ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena występowania oddziaływań białko-białko na powierzchni komórki. Osiąga się to poprzez klonowanie dwóch interesujących receptorów, przy czym w drugim kroku końcowe fragmenty są łączone z dwoma fluoroforami o nakładających się widmach emisji. Oba wektory są jednocześnie transfekowane do komórek śródbłonka w celu ekspresji receptorów.Na tym etapie fluorofory pomagają w ocenie ogólnego poziomu ekspresji oraz lokalizacji receptorów. Następnie, wykorzystując pojedynczą transfekcję jako kontrolę, ustala się parametry obrazowania na mikroskopie konfokalnym. Pojedyncze, transfektowane komórki są wybierane na podstawie względnych poziomów ekspresji i lokalizacji receptorów.Następnie obrazowane są obszary wewnątrz tych komórek, aby ocenić zakres uzyskanych wyników FRET. Wykazują one oddziaływania Tie1 i Tie2 na powierzchni komórek śródbłonka na podstawie FRET i mikroskopii konfokalnej. Cześć, jestem Tom Seger z laboratorium dr. Williama Bartona w Katedrze Biochemii i Biologii Molekularnej na Virginia Commonwealth University.Dzisiaj przedstawimy procedurę oceny oddziaływań białko-białko w komórkach śródbłonka za pomocą konfokalnej mikroskopii opartej na metodzie FRET. W naszym laboratorium wykorzystujemy tę metodę do badania oddziaływań receptorowych podczas angiogenezy. Zacznijmy zatem.Aby zobrazować oddziaływania białko-białko przy użyciu testu zbliżenia opartego na FRET, należy rozpocząć od sklonowania interesujących receptorów do miejsc NHE I oraz Eco R I wektora pCDA3.1 hydro lub neo zawierającego monomer CFP lub YFP. Wyznaczenie wartości FRET ma charakter empiryczny i jest krytycznie zależne od długości łącznika między regionem transbłonowym a początkiem fluoroforu. W związku z tym dla każdej nowej badanej pary receptorów należy przetestować kilka różnych długości łączników. Wektory należy transformować i namnażać zgodnie z towarzyszącym protokołem.Następnie należy przygotować DNA klasy transfekcyjnej, a wektory przekształcić i namnożyć zgodnie z dołączonym protokołem. Następnie przygotowujemy DNA klasy transfekcyjnej i rozcieńczamy je do stężenia roboczego 1 µg/µL. Aby przygotować komórki do transfekcji, w komorze z laminarnym przepływem powietrza należy przesiać komórki EAHY 92 6 hodowane w pełnej pożywce DMEM do szalek 35 mm z szkiełkami podstawowymi, zawierających 2 mL pożywki. Należy przygotować jedną szalkę do oceny ekspresji każdego pojedynczego receptora, a także jedną szalkę dla każdej pary receptorów.Pozostawić komórki do inkubacji w atmosferze 95% dwutlenku węgla w temperaturze 37°C do następnego dnia. W dniu transfekcji kultura powinna osiągnąć około 70 do 90% konfluencji. Przygotować kompleksy nukleolipidowe, mieszając 2 µg DNA wektora chimerycznego receptora z 8 µl Fuji N HD w 200 µl uprzednio ogrzanego medium Opti-MEM. W przypadku par receptorów przeprowadzić transfekcję z użyciem 1 µg każdego receptora (łącznie 2 µg); wymieszać delikatnie przez odwracanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.W czasie inkubacji przygotuj komórki do transfekcji: odessaj świeżą pożywkę i delikatnie oraz krótko przemyj każdą płytkę ciepłym PBS przed dodaniem dwóch mililitrów podgrzanej, pełnej pożywki DMEM bez antybiotyków. Ważne jest, aby uniknąć obecności penicyliny i streptomycyny, ponieważ są one znacznie bardziej toksyczne dla komórek podczas traktowania kompleksami FU gene HD. Dodawaj kompleksy kroplowo do komórek i inkubuj przez kolejne 20 do 24 godzin. Po 24 godzinach ostrożnie odessaj pożywkę z komórek i pipetuj świeżą, pełną pożywkę DMEM z antybiotykami po transfekcji.Żywotność komórek powinna pozostać na stosunkowo wysokim poziomie. Należy zaobserwować niewiele lub żadnych komórek pływających. Do obrazowania żywych komórek wykorzystujemy konfokalny skaningowy mikroskop laserowy A-T-C-S-P two A OBS wyposażony w niebieską diodę argonową oraz zielone, pomarańczowe i czerwone lasery helowo-neonowe, obiektyw H-C-X-P-I-A-O 63 x 1.3 NA z imersją glicerynową, zmotoryzowany stolik XY oraz inkubator stolikowy z kontrolą temperatury, wilgotności i poziomu dwutlenku węgla.Kontrole eksperymentalne są kluczowe dla wyeliminowania przesłuchów fluorochromów między kanałami emisji, a także dla oceny problemów z ekspresją i niespecyficznej fluorescencji. W związku z tym, w celu konfiguracji każdej sesji obrazowania, wykorzystuje się transfekcje pojedynczym fluorochromem, aby wyeliminować przesłuchy między kanałami emisji dla CFP i YFP. Umieść kontrolę ekspresji CFP w inkubatorze stolika pod światłem białym.Dostosuj położenie płytki Z, aby ustawić ostrość na komórkach. W oknie ustawień SP ustaw zakres detekcji emisji dla CFP od 465 do 505 nm oraz dla YFP od 525 do 600 nm; monitorując oba kanały emisji, wzbudzaj CFP przy 458 nm. Korzystając z A OTF, ustaw moc lasera tak, aby wyeliminować znaczący przeskok sygnału (bleed-over) z CFP do kanału emisji YFP.Zapisz to ustawienie. Przeprowadź analogiczną kontrolę przesłuchu (crosstalk) YFP w kanale CFP, regulując moc wzbudzenia przy 514 nanometrach. Zapisz to ustawienie dla komórek wykazujących ekspresję wyłącznie YFP.Następnie umieść komórki koekspresujące CFP i YFP w inkubatorze przedmiotowym. Korzystając z ustawień sekwencyjnych oprogramowania konfokalnego LICO, zlokalizuj komórki wykazujące podobne poziomy ekspresji CFP i YFP z prawidłową lokalizacją błonową, używając oprogramowania LICO oraz programu do fotobleachingu akceptora.Ustaw parametry donora i akceptora zgodnie z zapisanymi ustawieniami dla CFP i YFP odpowiednio. Po przybliżeniu obrazu na komórkę, zaznacz obszar zainteresowania (ROI), w którym ma nastąpić fotodestrukcja YFP na błonie komórkowej, a następnie uruchom program fotodestrukcji akceptora. Ustaw A OTF na 100% dla 514 nanometrów i kontynuuj fotowybielanie laserowe do momentu, aż ulegnie wyczerpaniu 70% emisji YFP.Aby przyspieszyć blaknięcie, podczas fotowybleszania zazwyczaj wybiera się ROI w osi rastrowej lasera. Należy monitorować ruch komórek i odrzucić pomiary uzyskane przy znacznym przemieszczeniu w płaszczyźnie XY. Ponieważ pomiary te mogą wykazywać fałszywe wartości wydajności FRET, rejestruje się obrazy przed i po blaknięciu zarówno dla donora, jak i akceptora, a wydajność FRET oblicza się według wzoru: wydajność FRET równa się (post - DLO) podzielone przez depost dla wszystkich depost większych niż D pre, gdzie D pre i D post to odpowiednio intensywności donora przed i po fotowybleszaniem.Program JMP jest wykorzystywany do określenia zakresu zmienności eksperymentalnej. Poszczególne receptory powinny zostać połączone zarówno z CFP, jak i YFP, stosując sekwencje przybłonowe o różnej długości. Aby zidentyfikować optymalną parę partnerów FRET dla receptorów, wydajność transfekcji zazwyczaj mieści się w przedziale od 30 do 40%, pomimo wcześniejszych wyników uzyskanych przez innych badaczy.Nie zaobserwowaliśmy, aby transfekcja i ekspresja jednego wektora sprzyjała ekspresji drugiego. W rzeczywistości często obserwujemy wyłączną ekspresję jednej z dwóch form. Te reprezentatywne obrazy przedstawiają analizę fotoblaknięcia akceptora w procesie FRET zachodzącym pomiędzy CFP a YFP w komórce EAHY 9 26.Kanały emisji CFP i YFP monitorowano oddzielnie przed i po fotowybielaniu, a obliczenia ograniczono do wyznaczonego obszaru. Wewnątrz czerwonej ramki wydajność FRET przedstawiono w zakresie bezwzględnym od wysokiej wartości 1,0 (kolor czerwony) do niskiej wartości zero (kolor fioletowy) na powiększonym nałożeniu połączonego obrazu CFP i YFP, wyłącznie w celu orientacji dla układu receptora T. Typowe wartości wydajności FRET wynoszą od 20 do 28% dla komórek nabłonkowych oraz od 19 do 23% dla komórek śródbłonka, jak pokazano tutaj.Po opanowaniu, technika ta zazwyczaj zajmuje od trzech do czterech dni, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że długość łącznika między białkiem docelowym a fuzyjnym białkiem fluorescencyjnym, a także poziomy ich ekspresji i ruch wewnątrzkomórkowy bezpośrednio wpływają na pomiar FRET po zakończeniu procedury. Ponadto, w celu uzyskania wglądu w szlaki transdukcji sygnału po ich opracowaniu, można przeprowadzić biochemiczne testy aktywacji sygnału.Technika ta umożliwia przeprowadzenie analizy, w której można badać oddziaływania białko-białko o charakterze słabym lub przejściowym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania własnych analiz bliskości opartych na metodzie FRET w żywych komórkach. Prosimy pamiętać, że podczas pracy z hodowlami komórkowymi należy zawsze przestrzegać odpowiednich zasad bezpieczeństwa.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przyszłych eksperymentach z fretami.

imaging-protein-protein-interactions-in-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie interakcji białko-białko in vivo

Niniejszy materiał wideo przedstawia eksperymenty wraz z późniejszą analizą oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem powierzchni mikrowzorowanych. Podejście to umożliwia wykrywanie oddziaływań białkowych w żywych komórkach, łącząc wysoką przepustowość z możliwością uzyskania informacji ilościowych.

In-vivo detekcja oddziaływań białko-białko na powierzchniach mikrowzorowanych

Wykorzystując system obrazowania z dwufotonową mikroskopią o rozdzielczości spektralnej, uzyskano mapy wydajności transferu energii rezonansowej Förstera (FRET) na poziomie pikseli dla komórek ekspresujących receptory błonowe, w których przypuszcza się tworzenie kompleksów homo-oligomerycznych. Na podstawie map wydajności FRET możliwe jest oszacowanie informacji stechiometrycznych dotyczących badanego kompleksu oligomeru.

In vivo ilościowe oznaczanie oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G z wykorzystaniem spektroskopowo rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej

Badanie oddziaływań białko-białko jest niezbędne do analizy funkcjonalności białek. W niniejszym materiale przedstawiamy test wiązania białko-białko in vitro, służący do badania interakcji między białkiem unieruchomionym w błonie a białkiem rozpuszczalnym. Test ten stanowi niezawodną metodę sprawdzania oddziaływań pomiędzy białkiem nierozpuszczalnym a białkiem w roztworze.

Analiza nakładkowa białek błonowych: protokół badania interakcji między białkami rozpuszczalnymi a nierozpuszczalnymi in vitro

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Interakcje białko-białko mogą zachodzić zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie komórki. Aby zbadać te interakcje, stosuje się tradycyjną koimmunoprecypitację i nowoczesny test ligacji zbliżeniowej. W tym badaniu porównujemy te dwie metody wizualizacji rozkładu oddziaływań NF90-RBM3 w jądrze i cytoplazmie.

Wizualizacja interakcji białko-białko we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych za pomocą koimmunoprecypitacji i testu ligacji zbliżeniowej in situ

Ten manuskrypt opisuje łatwą i szybką procedurę eksperymentalną do określania interakcji białko-białko na podstawie pomiaru aktywności lucyferazy.

Test obrazowania komplementacji lucyferazy w liściach Nicotiana benthamiana do przejściowego określania dynamiki interakcji białko-białko

Tutaj prezentujemy protokół techniki trawienia na błonie do przygotowania próbek do spektrometrii mas. Technika ta ułatwia wygodną analizę oddziaływań białko-białko.

Ocena interakcji białko-białko przy użyciu techniki trawienia na błonie

Ilościowe Multiplex Immunoprecipitation (QMI) wykorzystuje cytometrię przepływową do czułego wykrywania różnic w obfitości docelowych interakcji białko-białko między dwiema próbkami. QMI można wykonać przy użyciu niewielkiej ilości biomateriału, nie wymaga genetycznie modyfikowanych znaczników i może być dostosowany do dowolnej wcześniej zdefiniowanej sieci interakcji białek.

Kwantyfikacja dynamiki sieci interakcji białek za pomocą multipleksowanej koimmunoprecypitacji

Potrzeba nowych podejść do badania miejsc kontaktu z błoną (MCS) wzrosła ze względu na rosnące zainteresowanie badaniem tych struktur komórkowych i ich składników. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który integruje wcześniej dostępne technologie mikroskopowe w celu identyfikacji i ilościowego określenia kompleksów białkowych wewnątrz organelli i między organellami, które znajdują się w MCS.

Wizualizacja i kwantyfikacja endogennych interakcji białek wewnątrz organelli w miejscach kontaktu ER-mitochondria za pomocą testów ligacji zbliżeniowej

W protokole przedstawiono metodę kowalencyjnego przyłączania biotyny do białek in vivo w oparciu o ich bliskość do ligazy biotyny połączonej z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Modyfikacja ta pozwala na selektywne wzbogacanie białek za pomocą kulek streptawidyny, zgodnie z potrzebami w badaniach interakcji białkowych.

In vivo (in vivo ) Biotynylacja zbliżeniowa w badaniach interakcji białkowych w Pantofelku czworobocznym

Poznaj metodę FRET do obrazowania interakcji białko-białko na powierzchni komórek śródbłonka. Technika ta pozwala badać interakcje receptorów podczas angiogenezy z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Przeglądaj więcej filmów