Oznaczanie aktywności lokomotorycznej w celu badania rytmów okołodobowych i parametrów snu u Drosophila

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest charakterystyka fenotypów okołodobowych i związanych ze snem u drosophila poprzez analizę dobowych rytmów aktywności lokomotorycznej. Jest to realizowane poprzez generowanie much transgenicznych, pozyskiwanie konkretnych mutantów lub przeprowadzanie niezbędnych krzyżówek w celu przygotowania zwierząt doświadczalnych. W drugim kroku należy przygotować szklane probówki do pomiaru aktywności zawierające pożywkę, które będą służyć jako siedlisko much podczas eksperymentu.

Następnie much w wieku od jednego do pięciu dni umieszcza się w probówkach do badania aktywności, które następnie wprowadza się do monitorów aktywności DAM w celu monitorowania rytmów aktywności lokomotorycznej. Z wykorzystaniem systemu DAM uzyskuje się wyniki wykazujące defekty i wariacje w parametrach okołodobowych oraz snu, na podstawie analizy dziennych rytmów aktywności lokomotorycznej z użyciem oprogramowania takiego jak far sex i insomniac. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rytmów okołodobowych, takie jak to, jakie białka i mechanizmy regulacyjne są zaangażowane w generowanie prawidłowych rytmów oraz na przykład, w jaki sposób czynniki środowiskowe, takie jak światło i temperatura, modulują rytmy behawioralne poprzez specyficzne szlaki molekularne.

System monitorowania aktywności lokomocyjnej obejmuje liczne elementy wyposażenia, takie jak specjalistyczne urządzenia monitorujące, inkubatory środowiskowe z możliwością dobowej kontroli oświetlenia, urządzenia do zbierania danych, komputery oraz materiały pomocnicze, takie jak okablowanie. W celu uniknięcia nadmiernego obciążenia inkubatorów i potencjalnych problemów z utrzymaniem temperatury, system monitorowania aktywności lokomocyjnej należy umieścić w dobrze wentylowanym pomieszczeniu z kontrolą temperatury i zaciemnionym pokoju. Pomieszczenie to należy odizolować od zewnętrznych źródeł światła. Praca w całkowitej ciemności nie jest konieczna, ponieważ system okołodobowy muszek owocowych nie jest wrażliwy na światło podczerwone.

W związku z tym w sytuacjach, gdy konieczna jest widoczność w ciemni, używamy zwykłej latarki z nałożonym czerwonym filtrem oraz zasilacza awaryjnego UPS o wystarczającej mocy, aby zasilić komponenty systemu monitorowania aktywności. W przypadku skoku napięcia lub awarii zasilania w budynku, należy podłączyć zasilacz awaryjny UPS do obwodu zasilania awaryjnego budynku, jeżeli taki jest dostępny. Jeśli system sterujący oświetleniem w inkubatorze nie jest regulowany bezpośrednio przez urządzenie, wystarczy podłączyć inkubator do zasilania awaryjnego bez użycia UPS, ponieważ kilkusekundowy zanik napięcia nie wpłynie na temperaturę w komorze.

Następnie należy przygotować komputer PC lub Macintosh, w pełni dedykowany do zbierania danych i/lub kontroli inkubatorów. Ręcznie i starannie ułóż sieć linii telefonicznych wokół półek inkubatorów z kontrolowaną atmosferą, aby umożliwić łatwe podłączanie i odłączanie urządzeń. Ustaw monitory tak, aby wiele linii telefonicznych zbiegało się w jedną linię główną i wychodziło z inkubatora w celu podłączenia do komputera; podłącz urządzenia monitorujące wewnątrz inkubatorów do komputera za pomocą jednostki interfejsu zasilacza, która służy do zasilania monitora aktywności poprzez linię telefoniczną.

Na koniec, za pomocą taśmy klejącej lub czarnej tkaniny, zamaskuj potencjalne źródła światła, takie jak diody LED w urządzeniach elektronicznych lub nieszczelne drzwi inkubatora. Ma to na celu zapewnienie pomiaru rytmów swobodnie biegłych w warunkach braku niepożądanego światła. Kluczowe jest ocenienie tych fenotypów z wykorzystaniem odpowiednich zwierząt kontrolnych, które są hodowane w tych samych warunkach środowiskowych i są w tym samym wieku.

Ponadto występuje dymorfizm płciowy w rytmice okołodobowej. Powszechną praktyką w tych badaniach jest wykorzystywanie dorosłych samców much hodowanych w temperaturze 25 °C, w wieku od jednego do pięciu dni, ponieważ aktywność składania jaj u samic wpływałaby na rzetelny pomiar aktywności lokomotorycznej. Podczas badania parametrów okołodobowych oraz cyklu sen-czuwanie u konkretnych mutantów, wskazane jest skrzyżowanie szczepu mutantów ze szczepem typu dzikiego o tym samym tle genetycznym.

Na przykład W 1118 lub yw. Ponieważ u samców drosofil nie zachodzi crossing-over, lepiej jest przeprowadzić krzyżowanie zwrotne, krzyżując samice mutantów z samcami typu dzikiego. Zarówno muchy kontrolne typu dzikiego, jak i mutanty należy wysiać w tym samym czasie na standardowej pożywce dla drosofil na około 10 do 14 dni przed eksperymentem dotyczącym rytmu aktywności lokomotorycznej. Po wykluciu się potomstwa należy zebrać samce w wieku od jednego do pięciu dni i odstawić je do wykorzystania w doświadczeniach.

Probówki do badania aktywności reprezentują siedlisko much. Podczas eksperymentu są to cienkie, pięciomilimetrowe szklane rurki, które na jednym końcu zawierają pożywkę, a na drugim są zamknięte za pomocą włóczki lub plastikowego korka. Zaleca się stosowanie świeżo przygotowanych probówek do badania aktywności.

Przygotowuje się je zazwyczaj od kilku dni do tygodnia przed rozpoczęciem eksperymentu. Ponieważ szklane probówki do pomiaru aktywności mogą być wielokrotnie wykorzystywane, poniższe procedury przygotowawcze opisują proces z wykorzystaniem wcześniej używanych i nieczystych probówek jako punktu wyjścia. W przypadku użycia nowych probówek należy przejść bezpośrednio do etapu autoklawowania probówek, który zostanie przedstawiony w dalszej części.

Usuń korki z użytych probówek do aktywności i umieść je w dużym szklanym zlewce. Probówki powinny wypełniać zlewkę maksymalnie do połowy. Napełnij zlewkę wodą z kranu, upewniając się, że probówki są całkowicie zanurzone.

Podgrzewaj zlewkę z rurkami szklanymi w kuchence mikrofalowej, aż woda zacznie gwałtownie wrzeć. Należy zachować ostrożność podczas topienia wosku i pożywki agarowej, ponieważ woda jest gorąca. Wyjmij zlewkę z kuchenki mikrofalowej i zamieszaj zawartość rurek za pomocą szpatułki lub plastikowego mieszadła.

pipetą 10 mm, aby uwięziony wosk wypłynął na powierzchnię. Następnie powtórz etap mikrofalowania. Wyjmij zlewkę z mikrofalówki i odczekaj, aż ostygnie.

Umieszczenie zlewki w chłodni przyspieszy ten proces. W miarę chłodzenia wody wosk będzie gromadzić się na jej powierzchni i stopniowo krzepnąć. Usunąć stężały wosk ręcznie.

Powinno to usunąć większość wosku z probówek. Przenieś probówki z aktywnością do nowego zlewki ze świeżą wodą z kranu i powtórz proces mikrofalowania oraz usuwania wosku. Ponieważ większość wosku została usunięta w poprzednim kroku, nie ma konieczności oczekiwania na jego zestalenie.

Po prostu wylej wodę z zlewki i przełóż probówki do nowej zlewki. Zachowaj ostrożność, ponieważ woda jest nadal gorąca. Powtórz proces mikrofalowania po raz ostatni.

Wylać wodę z zlewki i odczekać, aż probówki z reakcjami ostygną. Następnie umieścić probówki pionowo w szklanych zlewkach o pojemności 250 ml lub 500 ml. Należy upewnić się, że nie są one zbyt ciasno ułożone.

Sterylizuj je w autoklawie w cyklu suchym lub po prostu wysusz probówki w suszarce laboratoryjnej, aby przygotować pożywkę do wprowadzenia do probówek z aktywnością. Przygotuj roztwór 5% sacharozy i 2% agaru w wodzie destylowanej lub wodzie z kranu, a następnie wysterylizuj roztwór w autoklawie. Wyautoklawowana pożywka może być użyta natychmiast lub przechowywana w temperaturze 4°C przez dłuższy czas.

W idealnych warunkach pożywka powinna mieć temperaturę około 65 °C podczas napełniania probówek do badań aktywności. Za pomocą pipety 10 ml nalać płynną pożywkę wzdłuż wewnętrznej ścianki zlewki szklanej, wypełniając probówki do 1/3 ich wysokości, licząc od dna. Delikatnie zakręcić zlewką, aby upewnić się, że wszystkie probówki zostały równomiernie wypełnione roztworem pożywki.

Należy odczekać do całkowitego zestalenia się pożywki, w temperaturze pokojowej lub w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza. Po ustąpieniu kondensacji wewnątrz szklanych probówek można je wyjąć z zlewki. Aby wyjąć probówki z badaniem aktywności ze zlewki, należy docisnąć je do dna zlewki i jednocześnie przekręcić, tak aby zestalona pożywka wewnątrz probówek oddzieliła się od dna zlewki.

Wyjmij probówki z zlewki, najlepiej w jednej grupie. Następnie oczyść każdą probówkę z osobna za pomocą ręczników papierowych, aby usunąć nadmiar pożywki z ich powierzchni zewnętrznych. Odstaw probówki do czystego pojemnika.

Należy użyć ogólnego laboratoryjnego grzejnika blokowego bez uchwytu na probówki i ostrożnie zakryć otwór grzewczy. Wykładając otwór grzewczy kilkoma warstwami mocnej folii aluminiowej, należy wsypać do niego granulki parafiny i roztopić je. Trzymając probówki za koniec niekontaktujący się z próbką, należy zanurzyć koniec kontaktujący się z próbką w roztopionym wosku. Następnie część pokrytą woskiem należy zanurzyć w zlewce z zimną wodą, aby przyspieszyć krzepnięcie wosku. Czynność należy powtórzyć.

Jednorazowe zanurzenie woskowych probówek w wodzie zapobiegnie ich sklejaniu się. Probówki można wykorzystać natychmiast lub przechowywać w szczelnym pojemniku w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia. Przechowywanie dłuższe niż tydzień doprowadzi do nadmiernego wyschnięcia pokarmu.

Jeśli probówki były przechowywane w temperaturze 4 °C, należy je ogrzać do temperatury pokojowej, pozostawiając je na blacie przed użyciem. Przed umieszczeniem much w probówkach do badania aktywności, należy włączyć inkubatory, w których będą znajdować się monitory aktywności. Dostosować temperaturę za pomocą sterowników inkubatora i ustawić cykl światła i ciemności, korzystając z kontrolera oświetlenia systemu DAM lub własnego systemu sterowania oświetleniem inkubatora, zgodnie z przyjętym planem eksperymentalnym.

Następnie znieczul muchy dwutlenkiem węgla. Potem, używając cienkiego pędzla, ostrożnie przenieś pojedynczą muchę do probówki do badania aktywności. Chwyć pęsetą środek pojedynczego kawałka włóczki o długości około pół cala i wprowadź włóczkę do końcówki probówki bez pożywki, aby zatkać otwór i zapobiec ucieczce muchy podczas eksperymentu.

Zapewniając jednocześnie dopływ powietrza do probówki, należy trzymać ją w pozycji poziomej do momentu, aż mucha się obudzi. Aby zapobiec przyklejeniu się muchy do pożywki, należy włożyć probówki do monitorów aktywności. W przypadku nowszego, bardziej kompaktowego modelu monitorów Tri Kinetics, konieczne jest przymocowanie probówek gumkami recepturkami, aby upewnić się, że wiązka podczerwieni przechodzi przez środek probówki. Na koniec należy umieścić monitory aktywności w inkubatorach i podłączyć je do systemu zbierania danych za pomocą przewodów telefonicznych, a następnie sprawdzić połączenie.

Używając oprogramowania systemu DAM, należy upewnić się, że wszystkie monitory są prawidłowo podłączone i że dane są zbierane z każdego z nich. Po umieszczeniu much w rurkach do badania aktywności i przygotowaniu systemu monitorowania aktywności lokomotorycznej można rozpocząć rejestrację danych. Muchy są synchronizowane i poddawane entrainmentowi poprzez wystawienie ich na wybrany reżim świetlny (światło, ciemność lub cykl LD) oraz temperatury przez dwa do pięciu pełnych dni.

Najczęściej stosowanym warunkiem synchronizacji jest cykl światło-ciemność 12 godzin światła i 12 godzin ciemności w temperaturze 25 °C. W badaniach rytmów okołodobowych w odniesieniu do tego protokołu, czas zapalenia świateł w inkubatorze definiuje się jako ZT 0, a wszystkie pozostałe czasy są określane względem tej wartości. W standardowych warunkach LD 12:12 dzikie typy *Drosophila melanogaster* wykazują zazwyczaj dwa okresy aktywności: jeden skupiony wokół ZT 0, nazywany szczytem porannym, oraz drugi wokół ZT 12, nazywany szczytem wieczornym. Rytmy aktywności lokomotorycznej w warunkach swobodnego biegu są mierzone w stałej ciemności i stałej temperaturze po okresie synchronizacji.

Ustawienia cyklu świetlnego można zmienić w dowolnym momencie fazy ciemnej w ostatnim dniu LD, tak aby następny dzień eksperymentu stanowił pierwszy dzień DD. Siedmiodniowy okres zbierania danych w warunkach DD jest wystarczający do obliczenia okresu okołodobowego oraz amplitudy lub siły rytmu u much. Generalnie, aby uzyskać wiarygodne okresy wolnobieżne dla konkretnego genotypu, niezbędna jest grupa badawcza licząca co najmniej 16 much.

Po zakończeniu eksperymentu surowe dane binarne zebrane za pomocą oprogramowania systemu DAM są pobierane na przenośny nośnik danych, na przykład pendrive USB. Surowe dane binarne są przetwarzane przy użyciu programu DAM file scan 1 0 2 x i sumowane w przedziałach 15- i 30-minutowych podczas analizy parametrów okołodobowych lub w przedziałach od jednej do pięciu minut podczas analizy snu.

Parametry spoczynku. Obecnie standardową definicją spoczynku związanego ze snem u drosophila są pięć następujących po sobie minut braku aktywności. Po zakończeniu tego protokołu ten sam zestaw danych można wykorzystać do porównania parametrów okołodobowych i parametrów snu zwierząt doświadczalnych oraz kontrolnych w odniesieniu do parametrów okołodobowych.

Wykresy indukcyjne ilustrujące codzienną aktywność lokomocyjną lub średnią aktywność much w ciągu kilku dni w warunkach LD lub DD można generować przy użyciu fast x oph melanogaster. Muchy te zazwyczaj wykazują dwa okresy aktywności: jeden skupiony wokół ZT 0, nazywany pikiem porannym, oraz drugi wokół ZT 12, nazywany pikiem wieczornym. Te dwa okresy aktywności są kontrolowane przez zegar endogenny i mogą być obserwowane nawet w warunkach wolnobieżnych DD. Zmiany w czasie występowania tych pików aktywności można łatwo zaobserwować na wykresach indukcyjnych, co może wskazywać na zmianę właściwości zegara endogennego.

Inną cechą świadczącą o prawidłowym funkcjonowaniu zegara biologicznego jest wyprzedzający wzrost aktywności lokomocyjnej obserwowany w cyklach LD, który występuje przed faktycznym przejściem z ciemności do światła lub ze światła do ciemności. Zachowanie to jest wyraźnie widoczne u much typu dzikiego, lecz nie występuje i jest arytmiczne u mutantów per zero. W przypadku tego mutanta.

Obserwowane piki poranne i wieczorne w cyklu LD są wyłącznie reakcjami przestrachu wynikającymi z gwałtownych zmian warunków oświetlenia. Muchy pozbawione zegara biologicznego nie antycypują zmian środowiskowych, lecz jedynie na nie reagują. Utrata rytmiczności behawioralnej jest znacznie bardziej wyraźna w DD i przejawia się zazwyczaj całkowitym zanikiem porannych lub wieczornych pików aktywności lokomotorycznej, co widoczne jest u much per zero.

Oprócz wykresów indukcji, dane dotyczące aktywności lokomocyjnej mogą być przedstawione w formie podwójnego aktogramu dla każdej pojedynczej muchy lub genotypu much, gdzie dane z dwóch dni są nanoszone sekwencyjnie w każdej linii, przy czym profil ostatniego dnia rozpoczyna kolejną linię obejmującą aktywność z dwóch dni. Na przykład, LD jeden i dwa są naniesione w pierwszej linii aktogramu. Kolejna linia rozpoczyna się od powtórzenia LD dwa, po którym następują LD trzy i tak dalej.

Zgodnie z tym formatem, dane dotyczące aktywności lokomotorycznej obejmujące cały eksperyment są przedstawione na aktogramie; jedną z zalet aktogramów nad wykresami redukcyjnymi jest to, że zmiana długości okresu rytmów aktywności dziennej jest łatwo zauważalna, oprócz generowania wykresów indukcyjnych i aktogramów.

Dane dotyczące aktywności lokomotorycznej z warunków DD można wprowadzić do programu far X w celu obliczenia długości okresu przy użyciu wielu różnych programów, w tym cycle P do analizy parametrów snu i spoczynku, gdzie spoczynek definiuje się jako pięć kolejnych minut braku aktywności. Dane zarejestrowane podczas testów aktywności lokomotorycznej oraz wiele parametrów snu można analizować za pomocą insomniac, programu opartego na środowisku MATLAB; pozwala on na obliczenie procentowego czasu, jaki muchy spędzają na śnie, w różnych odstępach czasu. Na przykład, procent czasu snu w każdej godzinie lub co 12 godzin.

Inne, częściej badane parametry snu obejmują średnią długość epizodu spoczynku, która jest miarą konsolidacji snu i może obrazować jego jakość. Kolejnym parametrem jest liczba aktywności podczas czuwania, będąca miarą poziomu aktywności w czasie, gdy muchy nie śpią. Parametr ten pomaga odróżnić muchy, u których zaburzenia dotyczą faktycznie snu i zachowań spoczynkowych, od osobników chorych lub hiperaktywnych.

Na przykład muchy, które są po prostu chore, mogą sprawiać wrażenie, że śpią dłużej, ponieważ są mniej mobilne. W przypadku tych much aktywność podczas czuwania będzie niższa w stosunku do zwierząt kontrolnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak za pomocą testów charakteryzować fenotypy okołodobowe i senne u drosophila. Dobowe rytmy aktywności lokomotorycznej.