Name: Izolacja komórek śródbłonka zastawek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Naucz się izolować komórki śródbłonka zastawek aortalnych z liści zastawki przy użyciu kolagenazy. Ta metoda umożliwia uzyskanie czystych populacji komórek do badań biologii serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsze badanie jest wspierane przez grant NSF CAREER, Fundację Hartwell oraz American Heart Association (#0830384N).

1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Autoklawować w przykrytej kuwecie następujące elementy: 
	<ol>
		<li>Pinceta chirurgiczna z ząbkami – do manipulowania tkanką płatka</li>
		<li>Nożyczki chirurgiczne (8 cm) – do przycinania tkanki płatka i kuspisów</li>
		<li>Patyczki bawełniane – do izolowania warstwy śródbłonka z płatka lub kuspisa</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować sterylny roztwór kolagenazy 
	<ol>
		<li>Dodać 4,0 g proszku DMEM do 250 mL wody 18 MΩ.</li>
		<li>Dodać 1,11 g wodorowęglanu sodu.</li>
		<li>Dodać 180 000 jednostek kolagenazy (600 U/mL).</li>
		<li>Dodać 1% (3 mL) Penicyliny/Streptomycyny.</li>
		<li>Dostosować pH roztworu do 7,2.</li>
		<li>Dopełnić roztwór do objętości 270 mL.</li>
		<li>Zsterylizować roztwór, przepuszczając go przez filtr 0,2 μm.</li>
		<li>Dodać 10% (30 mL) sterylnej płodowej surowicy bydlęcej.</li>
 </ol>
 </li>
	<li>Przygotować sterylne pożywkę dla komórek śródbłonka 
	<ol>
		<li>Dodać 6,7 g proszku DMEM do 400 mL wody 18 MΩ.</li>
		<li>Dodać 1,85 g wodorowęglanu sodu.</li>
		<li>Dodać 25 000 jednostek heparyny (50 U/mL).</li>
		<li>Dodać 1% (5 mL) Penicyliny/Streptomycyny.</li>
		<li>Dostosować pH roztworu do 7,2.</li>
		<li>Dopełnić roztwór do objętości 450 mL.</li>
		<li>Zsterylizować roztwór, przepuszczając go przez filtr 0,2 μm.</li>
		<li>Dodać 10% (50 mL) sterylnej płodowej surowicy bydlęcej.</li>
	</ol>
 </li>
	<li>Przygotować sterylną pożywkę dla komórek śródmiąższowych 
	<ol>
		<li>Dodać 13,37 g proszku DMEM do 800 mL wody 18 MΩ.</li>
		<li>Dodać 3,7 g wodorowęglanu sodu.</li>
		<li>Dodać 1% (10 mL) Penicyliny/Streptomycyny.</li>
		<li>Dostosować pH roztworu do 7,2.</li>
		<li>Dopełnić roztwór do objętości 900 mL.</li>
		<li>Zsterylizować roztwór, przepuszczając go przez filtr 0,2 μm.</li>
		<li>Dodać 10% (100 mL) sterylnej surowicy bydlęcej.</li>
	</ol>
 </li>
</ol>
2. Izolacja płatków zastawek serca
<ol>
	<li>Natychmiast po uśmierceniu zwierzęcia aseptycznie wyciąć pierścień aorty.</li>
	<li>Dokładnie wypłukać krew z pierścienia aorty zimnym, sterylnym DPBS. Niezbędne jest jak najszybsze usunięcie wszystkich składników krwi, aby ograniczyć obumieranie VEC oraz kontaminację bakteryjną. Na tym etapie nie zaleca się stosowania antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych, ponieważ mogą one być szkodliwe dla VEC.</li>
	<li>Wyizolować płatki zastawki (3 na zastawkę) bezpośrednio z pierścienia i umieścić je w sterylnej probówce stożkowej o pojemności 15 mL wypełnionej 12 mL zimnego DPBS. Kilkukrotnie wstrząsnąć, aby usunąć zanieczyszczenia, a następnie wymienić DPBS na świeży.</li>
	<li>Przetransportować próbkę do laboratorium w lodzie.</li>
	<li>Po przybyciu do laboratorium umieścić pojemnik z tkanką pod sterylnym dygestorium.</li>
</ol>
3. Izolacja warstwy śródbłonka
<ol>
	<li>Napełnij sterylną szalkę 35 mm 3 mL zimnego roztworu kolagenazy na każdą zastawkę (3 płatki).</li>
	<li>Przenieś wszystkie trzy płatki z probówki 15 mL do szalki wypełnionej roztworem kolagenazy.</li>
	<li>Inkubuj tkankę przez 5-10 minut w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Delikatnie usuń warstwę śródbłonka, obracając suchym sterylnym wymazem po powierzchni płatka. Kierunek obrotu i siła przyłożonego ścinania są kluczowe dla czystości próbki. Obrót wymazu powinien odbywać się w kierunku przeciwnym do liniowego ruchu ręki, co wytworzy kontrolowane ścinanie. To ścinanie powoduje oddzielenie komórek śródbłonka od tkanki. Siła nacisku powinna być wystarczająca, aby poczuć opór tkanki, ale nie może przebić błony podstawnej.</li>
	<li>Okazjonalnie dotykaj wymazem roztworu kolagenazy, aby uwolnić komórki z włókien końcówki. Po zakończeniu pobierania wymazem struktura warstwy śródbłonka powinna być nieco gładsza niż wcześniej.</li>
	<li>Zbierz zawiesinę komórkową/kolagenazę i przenieś ją do nowej sterylnej probówki 15 mL.</li>
	<li>Wiruj probówki przy 1000 rpm przez 5 minut, aby osadzić wyizolowane komórki, a następnie odessij nadosad. Jeśli izolujesz również komórki śródmiąższowe, wykonaj ten protokół w czasie wirowania tych komórek.</li>
	<li>Dodaj 3 mL pożywki dla śródbłonka świni do probówek 15 mL, wiruj po raz drugi i odessij pożywkę. To drugie wirowanie pomaga odfiltrować część niepożądanych materiałów, takich jak włókna z końcówki wymazu.</li>
	<li>Resuspenduj odwirowane komórki śródbłonka w 5 mL pożywki dla śródbłonka świni i wysiej komórki do wcześniej pokrytego kolagenem)): flaska T-25 (użyj jednej flaski na każdą probówkę do wirowania).</li>
	<li>Pozostaw komórki do wzrostu przez co najmniej 2-3 dni przed wymianą pożywki dla śródbłonka. Pomaga to komórkom w regeneracji i podziałach, ponieważ proces izolacji jest dość obciążający, a wydajność komórkowa może być niska. Krytyczne jest pasażowanie komórek w pobliżu konfluencji, ponieważ inhibicja kontaktowa mogłaby doprowadzić do transformacji komórek.</li>
</ol>
4. Przygotowanie 60 mm szalki hodowlanej do izolacji specyficznej dla strony
<ol>
	<li>Wyłóż szklane szalki Petriego o średnicy 60 mm folią aluminiową (2 szalki na jeden ulotkowy fragment tkanki). Folia aluminiowa ułatwia usunięcie parafiny, dzięki czemu szklana szalka Petriego może zostać ponownie wykorzystana do innych izolacji.</li>
	<li>Napełnić naczynia kuleczkami parafinowymi do około połowy ich wysokości, a następnie przykryć przed autoklawowaniem.</li>
	<li>Po zakończeniu autoklawowania i roztopieniu parafiny należy przenieść zestaw z szalką na chłodną, płaską powierzchnię. W miarę stygnięcia parafina stężeje, tworząc warstwę umożliwiającą nakłuwanie igłą.</li>
	<li>Po 30 minutach wysterylizowana szalka może zostać użyta jako komora izolacyjna do unieruchomienia tkanki liścika.</li>
</ol>
5. Izolacja specyficznej dla strony warstwy śródbłonka
<ol>
	<li>Wyjąć płatki z probówek 15 mL i umieścić je na przygotowanej szalce hodowlanej 60 mm w celu izolacji specyficznej dla danej strony.</li>
	<li>Ułożyć płatek tak, aby strona ventricularis była skierowana w dół, przylegając do powierzchni parafiny, pozostawiając stronę fibrosa odsłoniętą. Przymocować brzegi płatka szpilkami, aby odsłonić warstwę śródbłonka.</li>
	<li>Nanieść kilka kropli zimnej kolagenazy na każdą (skierowaną ku górze) powierzchnię śródbłonka i inkubować tkankę przez 5-10 minut w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Podobnie jak poprzednio, delikatnie usunąć warstwę śródbłonka, obracając suchym, sterylnym wymazem po powierzchni płatka. Kierunek obrotu i siła przyłożonego ścinania są kluczowe dla czystości próbki. Obrót wymazu powinien odbywać się w kierunku przeciwnym do liniowego ruchu ręki, co wytworzy kontrolowane ścinanie. Właśnie to ścinanie oddziela komórki śródbłonka od tkanki i nic innego. Przyłożona siła powinna być wystarczająca, aby wyczuć opór tkanki, ale nie może doprowadzić do penetracji tkanki.</li>
	<li>Okazjonalnie dotykać wymazem roztworu kolagenazy, aby uwolnić komórki z włókien końcówki. Po zakończeniu wymazu tekstura warstwy śródbłonka powinna wydawać się nieco gładsza niż wcześniej.</li>
	<li>Zebrać zawiesinę komórkową/kolagenazę i przenieść ją do nowej sterylnej probówki 15 mL. Oznaczyć na etykiecie specyficzność strony (płatki z tej samej zastawki można łączyć).</li>
	<li>Przenieść płatki do nowej szalki hodowlanej tak, aby tym razem odsłonięta była strona ventricularis, i powtórzyć kroki (5.3-5.6).</li>
	<li>Po zebraniu całej zawiesiny komórkowej/kolagenazy, odwirować probówki przy 1000 rpm przez 5 minut w celu osadzenia wyizolowanych komórek i odessać nadsącz. Jeśli izolowane są również komórki śródmiąższowe, przeprowadzić ten protokół podczas wirowania tych komórek.</li>
	<li>Dodać 3 mL pożywki dla śródbłonka świńskiego do probówek, odwirować po raz drugi i odessać pożywkę. To drugie wirowanie pomaga odfiltrować część niepożądanych materiałów, takich jak włókna z końcówki wymazu.</li>
	<li>Resuspendować odwirowane komórki śródbłonka w 5 mL pożywki dla śródbłonka świńskiego i wysiać komórki do uprzednio powleczonej kolagenem kolby T-25 (użyć 1 kolby na probówkę z wirówki).</li>
	<li>Pozostawić komórki do wzrostu przez co najmniej 2-3 dni przed wymianą pożywki dla śródbłonka. Pomaga to komórkom zregenerować się i dzielić, ponieważ proces izolacji jest dość agresywny. Jeśli zauważy się bardzo niską wydajność, należy rozważyć przeniesienie do mniejszej kolby lub płytki wielodołkowej, ponieważ adhezja międzykomórkowa sprzyja wzrostowi komórek. Pamiętać o pasażowaniu w pobliżu konfluencji, ponieważ inhibicja kontaktowa może prowadzić do transformacji komórek.</li>
</ol>
6. Izolacja komórek śródmiąższowych
<ol>
	<li>Napełnij sterylną probówkę wirówkową o pojemności 15 mL ilością 10 mL roztworu kolagenazy na jedną zastawkę (3 płatki).</li>
	<li>Po pobraniu wymazu komórek śródbłonka z płatków, umieść je natychmiast w odpowiedniej probówce 15 mL z roztworem kolagenazy.</li>
	<li>Inkubuj przez około 12 do 18 godzin (w razie potrzeby delikatnie mieszaj).</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj zdegradowaną tkankę za pomocą pipety serologicznej, aż zawiesina komórkowa/kolagenaza stanie się jednorodna. Homogenizacja ta pomaga rozbić tkankę i uwolnić komórki śródmiąższowe.</li>
	<li>Wirował strawioną tkankę przez 5 minut przy 1000 rpm, a następnie odessaj nadsącz.</li>
	<li>Dodaj 5 mL pożywki dla komórek śródmiąższowych świni do probówek 15 mL, odwirowuj po raz drugi i odessaj nadsącz.</li>
	<li>Resuspenduj odwirowane komórki śródbłonka w 5 mL pożywki dla komórek śródmiąższowych świni i wysiej komórki do kolby T-75 (użyj 1 kolby na każdą probówkę wirówkową).</li>
	<li>Pozostaw komórki do wzrostu na co najmniej 1-2 dni przed wymianą pożywki dla komórek śródmiąższowych. Będzie obecne znacznie więcej resztek tkankowych niż w przypadku komórek śródbłonka, co jest zjawiskiem oczekiwanym. Komórki powinny również szybciej osiągnąć konfluencję niż komórki śródbłonka ze względu na wydajność komórkową oraz ich naturę.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne obrazy
<img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig1.jpg" alt="Porównanie kultur komórkowych; A) wzrost konfluentny, B) wzrost rzadki; obraz mikroskopowy, skala 0,2 mm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Morfologia izolowanych komórek 2-3 dni po izolacji. (A) VEC wykazują typową morfologię śródbłonka i tworzą skupiska, aby wspomóc wzrost. (B) Morfologia VIC jest podobna do miofibroblastów, które mają zazwyczaj kształt wrzecionowaty i są równomiernie rozłożone w całej kolbie.
<img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig2.jpg" alt="Porównanie wzrostu komórek; obrazy mikroskopowe przedstawiające gęste i rzadkie kultury komórkowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Morfologia wyizolowanych komórek przy pełnej konfluencji. (A) VEC wykazują typową morfologię endotelialną, mając zazwyczaj strukturę przypominającą bruk i wykazując hamowanie wzrostu w kontakcie. (B) Morfologia VIC jest podobna do miofibroblastów, które mają zazwyczaj kształt wrzecionowaty i nie wykazują hamowania wzrostu w kontakcie.
<img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig3.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający struktury komórkowe; analiza lokalizacji białek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Charakterystyka funkcjonalna wyizolowanych komórek6. (A) VEC charakteryzują się wysokim poziomem wychwytu acetylowanego LDL (kolor czerwony). (B) VIC charakteryzują się niskim poziomem wychwytu acetylowanego LDL.
<img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig4.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający jądra komórkowe (niebieski) i prawdopodobnie ekspresję białka (zielony)." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4. Markery komórkowe wyizolowanych komórek 6. (A) Fenotyp VEC potwierdzono poprzez pozytywne barwienie na czynnik Von Willebranda (zielony), niebieski (jądra). (B) Fenotyp VIC potwierdzono poprzez negatywne barwienie na czynnik Von Willebranda.
<img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig5.jpg" alt="Struktura komórek w mikroskopii fluorescencyjnej; A: zabarwione jądra, B: wizualizacja cytoszkieletu i jąder." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> Rycina 5. Markery komórkowe wyizolowanych komórek. (A) Fenotyp VEC potwierdzony ujemnym barwieniem na alpha SMA (zielony), niebieski (jądra). (B) Fenotyp VIC potwierdzony dodatnim barwieniem na alpha SMA.
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Środek dysocjujący</td>
 <td>Technika dysocjacji</td>
 <td>Pozyskiwanie komórek</td>
 <td>Liczba komórek</td>
 <td>Komórka 
 Czystość</td>
 <td>Zanieczyszczenie</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA (3 mM) bez CaCl22</td>
 <td>5, 20, 60 min. 
 przed CaCl22 dodawanie</td>
 <td>20, 60, 120 min przed pobraniem</td>
 <td>-</td>
 <td>+/-</td>
 <td>+++</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA (6mM) bez CaCl22</td>
 <td>5, 20, 60 min. 
 przed CaCl22 dodawanie</td>
 <td>20, 60, 120 min przed pobraniem</td>
 <td>+/-</td>
 <td>+</td>
 <td>+++</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsyna-EDTA (0,5 g/L)</td>
 <td>5, 10, 15 min. 
 przed dezaktywacją</td>
 <td>Pożywka zebrana niezwłocznie </td>
 <td>+</td>
 <td>+</td>
 <td>++</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kolagenaza II (300 U/ml)</td>
 <td>5, 10, 15 min. 
 przed dezaktywacją</td>
 <td>Pożywka zebrana natychmiast</td>
 <td>-, +, ++</td>
 <td>-, ++, +</td>
 <td>+</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kolagenaza II (600 U/ml)</td>
 <td>5, 10, 15 min. 
 przed dezaktywacją</td>
 <td>Medium pobrane natychmiast </td>
 <td>+, ++, + 
 ++</td>
 <td>++, ++, 
 -</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Wyniki wstępnych protokołów izolacji komórek śródbłonka zastawkowego.

<ol><li>Thompson, R. P., Fitzharris, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+truncus+arteriosus+of+the+chick+embryo+heart%3A+the+formation+and+migration+of+mesenchymal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the truncus arteriosus of the chick embryo heart: the formation and migration of mesenchymal tissue.</a> Am J Anat. 154, 545-556 (1979).</li>
<li>Johnson, C. M., Fass, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+cardiac+valvular+endothelial+cells+in+culture%3A+A+relative+deficiency+of+fibronectin+synthesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Porcine cardiac valvular endothelial cells in culture: A relative deficiency of fibronectin synthesis in vitro.</a> Lab Invest. 49 (5), 589-598 (1983).</li>
<li>Manduteanu, I., Popov, D., Radu, A., Simionescu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calf+cardiac+valvular+endothelial+cells+in+culture%3A+production+of+glycosaminoglycans%2C+prostacyclin+and+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Calf cardiac valvular endothelial cells in culture: production of glycosaminoglycans, prostacyclin and fibronectin.</a> J Mol Cell Cardiol. 20 (2), 103-118 (1988).</li>
<li>Cheunyg, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+isolating+and+purifying+porcine+aortic+valve+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JHVD%22%5BJournal%5D)">Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells.</a> JHVD. 17 (6), 674-681 (2008).</li>
<li>Paranya, G., Vineberg, S., Dvorin, E., Kaushal, S., Roth, S. J., Rabkin, E., Schoen, F. J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+valve+endothelial+cells+undergo+transforming+growth+factor-beta-mediated+and+non-transforming+growth+factor-beta-mediated+transdifferentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro.</a> Am J Pathol. 159 (4), 1335-1343 (2001).</li>
<li>Butcher, J. T., Penrod, A., Garcia, A. J. M., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+morphology+and+focal+adhesion+development+of+valvular+endothelial+cells+in+static+and+fluid+flow+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Bio%22%5BJournal%5D)">Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments.</a> Arterioscler Thromb Vasc Bio. 24 (1), 1429-1434 (2004).</li>
<li>Simmons, C. A., Grant, G. R., Manduchi, E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+heterogeneity+of+endothelial+phenotypes+correlates+with+side-specific+vulnerability+to+calcification+in+normal+porcine+aortic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial heterogeneity of endothelial phenotypes correlates with side-specific vulnerability to calcification in normal porcine aortic valves.</a> Circ Res. 96, 792-799 (2005).</li>
<li>Butcher, J. T., Tressel, S., Johnson, T., Turner, D., Sorescu, G., Jo, H., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Profiles+of+Valvular+and+Vascular+Endothelial+Cells+Reveal+Phenotypic+Differences%3A+Influence+of+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Profiles of Valvular and Vascular Endothelial Cells Reveal Phenotypic Differences: Influence of Shear Stress.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 69-69 (2006).</li>
<li>Parachuri, S., Yang, J. H., Aikawa, E., Melero-Martin, J. M., Khan, Z. A., Loukogeorgakis, S., Schoen, F. J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pulmonary+Valve+Progenitor+Cells+Exhibit+Endothelial%2FMesenchymal+Plasticity+in+Response+to+Vascular+Endothelial+Growth+Factor-A+and+Transforming+Growth+Factor-%CE%B22%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Human Pulmonary Valve Progenitor Cells Exhibit Endothelial/Mesenchymal Plasticity in Response to Vascular Endothelial Growth Factor-A and Transforming Growth Factor-β2.</a> Circ Res. 99 (8), 861-869 (2006).</li>
<li>Shi, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+circulating+bone+marrow-derived+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells.</a> Blood. 92, 362-367 (1998).</li>
<li>Rehman, J., Li, J., Orschell, C. M., March, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+endothelial+progenitor+cells+are+derived+from+monocyte%2Fmacrophages+and+secrete+angiogenic+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood endothelial progenitor cells are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors.</a> Circulation. 107, 1164-1169 (2003).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Zrozumienie biologii zastawek było utrudnione ze względu na problemy techniczne związane z izolacją i hodowlą czystych populacji komórek śródbłonka zastawek. Typowe techniki izolacji obejmują trawienie enzymatyczne podstawowej macierzy lub chemiczną dysocjację wiązań adhezyjnych śródbłonka2,3. Wstępne eksperymenty z izolacją oceniano jakościowo, zmieniając stosowane środki dysocjujące oraz okresy inkubacji. Wyniki tych eksperymentów wykazały, że inkubacja w EDTA (lub Trypsynie-EDTA) przez maksymalnie 60 minut ...

<table><tbody><tr><td>Modyfikowane pożywka Eagle'a Dulbecco&amp;rsquo;</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>50-103-PB</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsyna-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza Typ 2</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21300-058</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen z ogona szczura</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Wymazówki Critical Swabs</td><td>VWR international</td><td>89031-270</td><td></td></tr><tr><td>Węglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55761</td><td></td></tr><tr><td>Kolby T25</td><td>BD Biosciences</td><td>353018</td><td></td></tr><tr><td>Kolby T75</td><td>BD Biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Falcon BD</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka 60x15 mm</td><td>VWR international</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane 60x15</td><td>VWR international</td><td>89000-310</td><td></td></tr><tr><td>Wosk do zatapiania w parafinie</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19304-01</td><td></td></tr><tr><td>Igły Precision Glide</td><td>BD Biosciences</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>Filtry Nalgene 500 mL</td><td>VWR international</td><td>73520-985</td><td></td></tr><tr><td>Filtry Nalgene 1L</td><td>VWR international</td><td>73520-986</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta tkankowa</td><td>Fine Science Tools</td><td>11023-15</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta FSC #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja komórek śródbłonka zastawek

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Zastawki serca odpowiadają wyłącznie za utrzymanie jednokierunkowego przepływu krwi w układzie sercowo-naczyniowym. Te cienkie, włókniste tkanki są poddawane znacznym naprężeniom mechanicznym, otwierając się i zamykając kilka miliardów razy w ciągu całego życia. Niezwykła wytrzymałość tych tkanek wynika z obecności komórek śródbłonka zastawkowego (VEC) oraz komórek śródmiąższowych (VIC), które nieustannie naprawiają i przebudowują tkankę w odpowiedzi na lokalne sygnały mechaniczne i biologiczne. Dopiero niedawno zaczęliśmy rozumieć wyjątkowe zachowania tych komórek, w czym kluczową rolę odegrały eksperymenty in vitro. Szczególnie wymagająca jest izolacja i hodowla VEC. Szczególnej ostrożności należy zachować od momentu pobrania tkanki z organizmu gospodarza aż po końcowe wysianie komórek. Przedstawiamy tutaj protokoły bezpośredniej izolacji, izolacji specyficznej dla strony, hodowli oraz weryfikacji czystych populacji VEC. Stosujemy trawienie enzymatyczne, po którym następuje delikatna technika zdrapywania wymazem w celu oddzielenia wyłącznie komórek powierzchniowych. Komórki te są następnie zbierane do probówki i wirowane do postaci osadu. Osad jest następnie resuspendowany i wysiewany do kolb hodowlanych uprzednio pokrytych macierzą kolagenu I. Fenotyp VEC potwierdza się poprzez wzrost z hamowaniem kontaktowym oraz ekspresję markerów specyficznych dla śródbłonka, takich jak PECAM1 (CD31), czynnik von Willebranda (vWF), a także brak ekspresji alfa-aktyny mięśni gładkich (α-SMA). Funkcjonalne właściwości VEC wiążą się z wysokimi poziomami acetylowanego LDL. W przeciwieństwie do komórek śródbłonka naczyniowego, VEC mają unikalną zdolność do transformacji w mezenchymę, co normalnie zachodzi podczas embrionalnego tworzenia się zastawki1. Może to również wystąpić podczas znacznie przedłużonej hodowli in vitro po osiągnięciu konfluencji, dlatego należy dbać o pasażowanie komórek w momencie osiągnięcia lub w pobliżu konfluencji. Po izolacji VEC można łatwo uzyskać czyste populacje VIC.

Przedstawiamy metodę izolacji i hodowli czystych populacji komórek śródbłonka zastawek serca (VEC). Komórki VEC można izolować z obu stron cuspisu lub płatka zastawki, a bezpośrednio po tym procesie możliwe jest łatwe wyizolowanie znajdujących się pod nimi komórek śródmiąższowych (VIC).

Izolacja komórek śródbłonka zastawek

Zastawki serca są jedynymi strukturami odpowiedzialnymi za utrzymanie jednokierunkowego przepływu krwi w układzie sercowo-naczyniowym. Te cienkie, włókniste tkanki są ...

W niniejszym protokole wideo zademonstrowano izolację rezydentnych komórek śródstacia szczelinowego oraz komórek śródbłonka specyficznych dla danej strony z zastawki aortalnej serca. Płatek zastawki jest pobierany z serca i umieszczany w zimnym roztworze soli fizjologicznej. Warstwa śródbłonka może zostać usunięta z obu stron płatka poprzez delikatne ścinanie tkanki zanurzonej w roztworze kolagenazy za pomocą patyczka bawełnianego; w przypadku izolacji specyficznej dla danej strony, płatek zastawki jest przypinany do podłoża parafinowego tak, aby powierzchnia śródbłonka była odsłonięta.Następnie do płatka zastawki dodaje się kilka kropel zimnej kolagenazy, a płatki inkubuje przez okres od 5 do 10 minut. Po inkubacji z kolagenazą warstwę śródbłonka z konkretnej strony usuwa się poprzez delikatne ścinanie tkanki. Uwolnione komórki śródbłonka zbiera się za pomocą wymazówki, a następnie przemywa i wysiewa na podłoże.Pozostałe płatki poddawane są następnie trawieniu przez noc w celu wyizolowania komórek śródmiąższowych, które są zbierane i płukane. Wszystkie wyizolowane komórki są hodowane i mogą być wykorzystane do zrozumienia ich roli w naprawie i przebudowie zastawek serca w odpowiedzi na lokalne sygnały mechaniczne i biologiczne. Cześć, nazywam się Russell Gould.Znajduję się na Uniwersytecie Cornella, w departamencie inżynierii biomedycznej, pracując w laboratorium Butchera. Dzisiaj pokażę Państwu, jak izolować komórki śródbłonka zastawkowego. Zastosowanie tej techniki pozwala na zrozumienie, w jaki sposób rezydentne komórki śródbłonka nieustannie naprawiają i przebudowują tkankę w odpowiedzi na sygnały mechaniczne i biologiczne.Zacznijmy zatem. W pierwszej kolejności należy pozyskać świnię z lokalnej rzeźni, a następnie w warunkach aseptycznych wyciąć korzeń aorty. Dokładnie wypłucz korzeń aorty z krwi.Przy użyciu zimnego, sterylnego DPBS należy jak najszybciej usunąć wszystkie składniki krwi, aby ograniczyć obumieranie komórek śródbłonka zastawek (VEC) oraz kontaminację bakteryjną. Na tym etapie nie zaleca się stosowania antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych, ponieważ mogą one być szkodliwe dla komórek. Następnie należy wyizolować bezpośrednio z korzenia trzech.Kawałki płatków z każdej zastawki. Należy zachować ostrożność podczas izolowania płatków, ponieważ jakakolwiek tkanka pierścieniowa zanieczyści populację komórek. Umieścić wyizolowane płatki w sterylnej probówce stożkowej o pojemności 15 mililitrów wypełnionej 12 mililitrami zimnego DPBS.Wstrząśnij kilka razy, aby usunąć zanieczyszczenia, a następnie napełnij ponownie świeżym DPBS. Na koniec przetransportuj płatki zastawek do laboratorium w lodzie. Po przybyciu do laboratorium umieść pojemnik z tkanką pod sterylnym okapem, a następnie przystąp do izolacji warstwy śródbłonka; wysterylizuj w autoklawie w przykrytej tacy na narzędzia następujące przybory: pęsetę ząbkowaną, nożyczki do tkanek oraz patyczki bawełniane.Należy również przygotować sterylny roztwór kolagenazy, medium dla komórek śródbłonka oraz medium śródmiąższowe, zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami zawartymi w towarzyszącym protokole pisemnym. Sterylną szalkę o średnicy 35 milimetrów należy napełnić trzema mililitrami schłodzonego roztworu kolagenazy na każdą zastawkę, a następnie przenieść wszystkie trzy płatki z probówki o pojemności 15 mililitrów do szalki.Inkubować tkankę przez 5 do 10 minut w temperaturze 37 °C. Następnie delikatnie usunąć warstwę śródbłonka z obu stron płatka, obracając suchym sterylnym wymazem po jego powierzchni. Kierunek obrotu oraz siła przyłożonego ścinania są kluczowe dla czystości próbki.Rotacja wymazu odbywa się w kierunku przeciwnym do ruchu liniowego ręki trzymającej patyczek bawełniany. Tworzy to kontrolowane ścinanie, które oddziela komórki śródbłonka od tkanki. Siła nacisku powinna być wystarczająca, aby wyczuć opór tkanki, ale nie na tyle duża, by przebić błonę podstawną; okresowo przykładaj wymaz do roztworu kolagenazy, aby uwolnić komórki z włókien końcówki.Po zakończeniu wymazu tekstura warstwy śródbłonka powinna wydawać się nieco gładsza niż wcześniej. Zebrać komórki zawieszone w roztworze kolagenazy i przenieść je do nowej sterylnej probówki 15 ml. Po usunięciu komórek śródbłonka z płatków, natychmiast umieścić płatki w probówce 15 ml zawierającej 10 ml roztworu kolagenazy w celu izolacji komórek śródmiąższowych.Wirować probówki przy 1000 RPM przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu odwirowania wyizolowanych komórek, a następnie odessać supernatant. Do probótek 15 ml dodać trzy mililitry pożywki dla komórek śródbłonia. Wirować po raz drugi w ten sam sposób i odessać pożywkę.To drugie wirowanie pomaga odfiltrować niektóre niepożądane zanieczyszczenia, takie jak włókna z końcówek pipet. Zawiesinę komórek śródbłonka po wirowaniu przenieś do pięciu mililitrów pożywki dla komórek śródbłonka i wysiej komórki do kolby T 25 uprzednio powleczonej kolagenem. Używając jednej kolby na każdą probówkę do wirowania, pozwól komórkom rosnąć przez co najmniej dwa do trzech dni przed wymianą pożywki dla komórek śródbłonka.Pomaga to komórkom w regeneracji i podziale. Ponieważ proces izolacji jest dość drastyczny, a wydajność komórek może być niska, kluczowe jest pasażowanie komórek w pobliżu stanu konfluencji. Ze względu na to, że inhibicja kontaktowa może prowadzić do transformacji komórkowej, komórki śródbłonka można również izolować z konkretnej strony.W tym celu należy najpierw przygotować szalkę Petriego z warstwą parafiny. Do szklanych szalek Petriego o średnicy 60 mm używamy folii aluminiowej. Należy przewidzieć dwie szklane szalki na jeden liścik.Folia aluminiowa pomaga usunąć parafinę w celu ponownego wykorzystania szalki Petriego. Następnie należy wypełnić szalki granulkami parafiny do około połowy i przykryć je przed autoklawowaniem. Po zakończeniu autoklawowania i stopieniu parafiny, przenieś zestaw szalek na chłodną, płaską powierzchnię.W miarę stygnięcia parafina twardnieje, tworząc warstwę, która umożliwi nakłuwanie igłą. Po 60 minutach sterylizowana szalka może zostać użyta do unieruchomienia tkanki płatka. Wyjmij wyizolowane z zastawki płatki z probówek o pojemności 15 mililitrów i umieść je na podłożu z parafiny.Ustaw płatki w taki sposób, aby strona komorowa była skierowana w dół, przylegając do powierzchni parafiny, pozostawiając odsłoniętą stronę z włóknieniem. Przypnij brzegi płatka, aby odsłonić warstwę śródbłonka. Następnie nanieś po kilka kropli zimnej kolagenazy na każdą skierowaną ku górze powierzchnię śródbłonka i inkubuj tkankę przez 5 do 10 minut w temperaturze 37 °C.Po zakończeniu inkubacji delikatnie usuń warstwę śródbłonka, tak jak poprzednio, przesuwając suchym sterylnym tamponem po powierzchni płatka. Od czasu do czasu przykładaj tampon do roztworu kolagenazy, aby usunąć komórki z włókien końcówki. Po zakończeniu pobierania wymazu tekstura warstwy śródbłonka powinna wydawać się nieco gładsza niż wcześniej.Zebrać zawiesinę komórkową i przenieść ją do nowej, sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Oznaczyć specyficzność strony na etykietach; listki z tej samej zastawki można łączyć. Przepłukać unieruchomioną zastawkę kilkoma kroplami zimnego DPBS, aby usunąć pozostałe komórki lub zanieczyszczenia.Przenieś płatki do nowej szalki hodowlanej w taki sposób, aby strona komorowa była teraz odsłonięta, a następnie pobierz komórki śródbłonka, tak jak właśnie pokazano. Po zakończeniu wymazu komórek śródbłonka z płatka G, natychmiast umieść płatki w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml roztworu kolagenazy. Przemyj komórki, resuspenduj je i hoduj zgodnie z instrukcją przedstawioną dla niespecyficznej względem strony izolacji komórek śródbłonka.Jeśli wydajność komórek jest bardzo niska, należy rozważyć przeniesienie ich do mniejszej kolby lub zastosowanie płytki wielodołkowej. Ponieważ adhezja komórkowa sprzyja wzrostowi komórek, pamiętaj, aby pasażować komórki w pobliżu stanu konfluencji. Ze względu na to, że inhibicja kontaktowa może prowadzić do transformacji komórek, należy rozpocząć izolację komórek śródmiąższowych podczas wirowania komórek śródbłonka; probówki z płatkami inkubuje się przez około 12 do 18 godzin.W roztworze kolagenazy, delikatnie mieszając, jeśli jest to wskazane. Po zakończeniu okresu inkubacji użyć pipety serologicznej, aby delikatnie wymieszać trawioną tkankę, aż zawiesina komórkowa stanie się jednorodna. Homogenizacja ta pomaga rozbić tkankę i uwolnić komórki śródmiąższowe; następnie odwirować i przemyć komórki w sposób opisany dla komórek śródbłonka.Zamiast używać pięciu mililitrów medium do resuspensji komórek śródmiąższowych, zawiesić odwirowane komórki śródmiąższowe w 15 mililitrach medium do komórek śródmiąższowych i wysiać komórki do kolby T 75, używając jednej kolby na każdą probówkę do wirowania. Pozostawić komórki do wzrostu przez co najmniej jeden do dwóch dni przed wymianą medium do komórek śródmiąższowych; należy spodziewać się większej ilości pozostałości tkankowych niż w przypadku komórek śródbłonka. Ponadto komórki śródmiąższowe z natury szybciej osiągają konfluencję niż komórki śródbłonka i zapewniają wyższą wydajność komórkową na tych reprezentatywnych obrazach.Morfologia hodowlanych komórek śródbłonka zastawek V Cs oraz komórek śródmiąższowych zastawek jest przedstawiona po dwóch do trzech dniach. BEC wykazują typową morfologię śródbłonka, w której komórki tworzą wzór przypominający brukowaną nawierzchnię i zaczynają formować skupiska.Morfologia VS.Exhibit jest podobna do miofibroblastów, w której komórki mają zazwyczaj wrzecionowaty kształt i są rzadko rozmieszczone przy hodowli do ko-fluencji; ECS wykazują typową morfologię śródbłonka, w której komórki tworzą wzór brukowany, a ich wzrost jest hamowany przez kontakt. VI CS wykazują morfologię podobną do miofibroblastów, w której komórki mają zazwyczaj wrzecionowaty kształt i nie wykazują hamowania wzrostu przez kontakt. Charakterystyka funkcjonalna zarówno VEC, jak i VIC może być wnioskowana na podstawie barwienia. W przypadku LDL uptake.Komórki VEC charakteryzują się wysokim poziomem wychwytu acetylowanego LDL. Podczas gdy komórki VIC wykazują niski poziom wychwytu acetylowanego LDL, tutaj przedstawiono markery komórkowe VEC i VIC. Komórki ECS wykazują pozytywne barwienie na czynnik von Willebranda, podczas gdy.Nie wykazują barwienia na czynnik von Willebranda. Co więcej, barwienie V CS jest negatywne dla alpha smooth muscle actin, podczas gdy barwienie V CS jest pozytywne dla alpha smooth muscle actin. Mam nadzieję, że dowiedzieli się Państwo wiele z dzisiejszych izolacji.Należy jednak pamiętać, że błona podstawna komórek śródbłonka jest bardzo delikatna i każde naruszenie leżącej pod nią macierzy często uwalnia zanieczyszczające komórki z reszty tkanki. Aby potwierdzić pomyślną izolację, charakterystyka jest kluczowa dla oceny czystości uzyskanych preparatów. Życzymy zatem powodzenia.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja komórek endotelialnych zastawek

Niniejszy protokół wideo przedstawia izolację i hodowlę ludzkich komórek śródbłonka żyły pępekowej (HUVEC) z ludzkiej pępowiny. Po izolacji komórki te mogą być wykorzystywane w testach angiogenezy in vitro, takich jak zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego, zaprezentowany również przez laboratorium Hughesa.<br...

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)

W tym filmie pokazujemy izolację komórek śródmiąższowych zastawki aortalnej z serca dorosłej myszy za pomocą dwuetapowej procedury kolagenazy i ich późniejszą hodowlę w małej ilości pożywki wzrostowej.

Izolacja komórek śródmiąższowych zastawki myszy: enzymatyczna metoda izolowania i hodowli VIC z mysiej zastawki aortalnej

Pierwotna hodowla komórkowa jest użyteczną techniką do analizy określonych populacji komórek, szczególnie z transgenicznych zarodków myszy w określonych stadiach rozwoju. W tym przypadku komory embrionalne są preparowane i dysocjowane, a kulki sprzężone z przeciwciałami rozpoznają i oddzielają komórki śródbłonka do dalszej analizy.

Izolacja embrionalnych komórek śródbłonka komór

Zdolność do izolowania komórek śródbłonka zastawki serca (VEC) jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów rozwoju, utrzymania i choroby zastawki.  W tym miejscu opisujemy izolację VEC od embrionalnych i dorosłych myszy Tie2-GFP za pomocą FACS, co pozwoli na badania określające udział VEC w procesach rozwojowych i chorobowych.

Izolacja komórek śródbłonka mysiej zastawki

Ten protokół jest przygotowany, aby podzielić się naszą metodą izolowania komórek śródbłonka naczyń wieńcowych myszy w celu obrazowania lub przeprowadzania eksperymentów z biologii molekularnej.

Izolacja mysich komórek śródbłonka naczyń wieńcowych

Przedstawiamy protokół izolacji komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z serc szczurów poprzez sekwencyjne trawienie tkanek w buforze trawiennym, pobieranie komórek z powtarzających się cykli wirowania i oczyszczanie komórek za pomocą mikrogranulek anty-szczurzych CD31.

Izolacja komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z wolnej ściany komory serca szczura

Ten artykuł opisuje izolację komórek mysiej zastawki aortalnej za pomocą dwuetapowej procedury kolagenazy. Izolowane komórki zastawki myszy są ważne dla wykonywania różnych testów, takich jak test zwapnienia in vitro, oraz dla badania szlaków molekularnych prowadzących do mineralizacji zastawki aortalnej.

Izolacja komórek zastawki śródmiąższowej myszy w celu zbadania zwapnienia zastawki aortalnej in vitro

Ten protokół opisuje zbieranie ludzkich zastawek aortalnych pobranych podczas zabiegów chirurgicznej wymiany zastawki aortalnej lub z tkanki zwłok, a następnie izolację, rozszerzanie i charakterystykę specyficznych dla pacjenta komórek śródbłonka i śródmiąższu pierwotnej zastawki. Uwzględniono ważne szczegóły dotyczące procesów potrzebnych do zapewnienia żywotności komórek i swoistości fenotypu.

Izolacja ludzkich pierwotnych komórek zastawki do modelowania chorób in vitro

Przedstawiamy metodę izolowania komórek i jąder śródbłonka od światła tętnic szyjnych myszy wystawionych na stabilne lub zaburzone warunki przepływu w celu przeprowadzenia eksperymentów omicznych na pojedynczych komórkach.

Izolacja komórek śródbłonka ze światła tętnic szyjnych myszy do eksperymentów multiomicznych na pojedynczych komórkach

Chociaż jest to trudne, izolacja komórek śródbłonka płuc jest niezbędna do badań nad zapaleniem płuc. Niniejszy protokół opisuje procedurę wysokowydajnej izolacji komórek śródbłonka makronaczyniowego i mikronaczyniowego o wysokiej czystości.

Izolacja i oczyszczanie komórek śródbłonka mikronaczyniowego i makronaczyniowego z próbek pochodzących z płuc

Ten artykuł opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka z naczyń włosowatych limfatycznych skóry za pomocą kulek magnetycznych. Wyizolowane komórki śródbłonka limfatycznego można wykorzystać do dalszych eksperymentów in vitro i analizy ekspresji białek.

Mysia izolacja komórek śródbłonka limfatycznego skóry

Naucz się izolować komórki śródbłonka zastawek aortalnych z liści zastawki przy użyciu kolagenazy. Ta metoda umożliwia uzyskanie czystych populacji komórek do badań biologii serca.

Izolacja komórek śródbłonka zastawek

Przeglądaj więcej filmów