Izolacja komórek śródbłonka zastawek

W niniejszym protokole wideo zademonstrowano izolację rezydentnych komórek śródstacia szczelinowego oraz komórek śródbłonka specyficznych dla danej strony z zastawki aortalnej serca. Płatek zastawki jest pobierany z serca i umieszczany w zimnym roztworze soli fizjologicznej. Warstwa śródbłonka może zostać usunięta z obu stron płatka poprzez delikatne ścinanie tkanki zanurzonej w roztworze kolagenazy za pomocą patyczka bawełnianego; w przypadku izolacji specyficznej dla danej strony, płatek zastawki jest przypinany do podłoża parafinowego tak, aby powierzchnia śródbłonka była odsłonięta.

Następnie do płatka zastawki dodaje się kilka kropel zimnej kolagenazy, a płatki inkubuje przez okres od 5 do 10 minut. Po inkubacji z kolagenazą warstwę śródbłonka z konkretnej strony usuwa się poprzez delikatne ścinanie tkanki. Uwolnione komórki śródbłonka zbiera się za pomocą wymazówki, a następnie przemywa i wysiewa na podłoże.

Pozostałe płatki poddawane są następnie trawieniu przez noc w celu wyizolowania komórek śródmiąższowych, które są zbierane i płukane. Wszystkie wyizolowane komórki są hodowane i mogą być wykorzystane do zrozumienia ich roli w naprawie i przebudowie zastawek serca w odpowiedzi na lokalne sygnały mechaniczne i biologiczne. Cześć, nazywam się Russell Gould.

Znajduję się na Uniwersytecie Cornella, w departamencie inżynierii biomedycznej, pracując w laboratorium Butchera. Dzisiaj pokażę Państwu, jak izolować komórki śródbłonka zastawkowego. Zastosowanie tej techniki pozwala na zrozumienie, w jaki sposób rezydentne komórki śródbłonka nieustannie naprawiają i przebudowują tkankę w odpowiedzi na sygnały mechaniczne i biologiczne.

Zacznijmy zatem. W pierwszej kolejności należy pozyskać świnię z lokalnej rzeźni, a następnie w warunkach aseptycznych wyciąć korzeń aorty. Dokładnie wypłucz korzeń aorty z krwi.

Przy użyciu zimnego, sterylnego DPBS należy jak najszybciej usunąć wszystkie składniki krwi, aby ograniczyć obumieranie komórek śródbłonka zastawek (VEC) oraz kontaminację bakteryjną. Na tym etapie nie zaleca się stosowania antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych, ponieważ mogą one być szkodliwe dla komórek. Następnie należy wyizolować bezpośrednio z korzenia trzech.

Kawałki płatków z każdej zastawki. Należy zachować ostrożność podczas izolowania płatków, ponieważ jakakolwiek tkanka pierścieniowa zanieczyści populację komórek. Umieścić wyizolowane płatki w sterylnej probówce stożkowej o pojemności 15 mililitrów wypełnionej 12 mililitrami zimnego DPBS.

Wstrząśnij kilka razy, aby usunąć zanieczyszczenia, a następnie napełnij ponownie świeżym DPBS. Na koniec przetransportuj płatki zastawek do laboratorium w lodzie. Po przybyciu do laboratorium umieść pojemnik z tkanką pod sterylnym okapem, a następnie przystąp do izolacji warstwy śródbłonka; wysterylizuj w autoklawie w przykrytej tacy na narzędzia następujące przybory: pęsetę ząbkowaną, nożyczki do tkanek oraz patyczki bawełniane.

Należy również przygotować sterylny roztwór kolagenazy, medium dla komórek śródbłonka oraz medium śródmiąższowe, zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami zawartymi w towarzyszącym protokole pisemnym. Sterylną szalkę o średnicy 35 milimetrów należy napełnić trzema mililitrami schłodzonego roztworu kolagenazy na każdą zastawkę, a następnie przenieść wszystkie trzy płatki z probówki o pojemności 15 mililitrów do szalki.

Inkubować tkankę przez 5 do 10 minut w temperaturze 37 °C. Następnie delikatnie usunąć warstwę śródbłonka z obu stron płatka, obracając suchym sterylnym wymazem po jego powierzchni. Kierunek obrotu oraz siła przyłożonego ścinania są kluczowe dla czystości próbki.

Rotacja wymazu odbywa się w kierunku przeciwnym do ruchu liniowego ręki trzymającej patyczek bawełniany. Tworzy to kontrolowane ścinanie, które oddziela komórki śródbłonka od tkanki. Siła nacisku powinna być wystarczająca, aby wyczuć opór tkanki, ale nie na tyle duża, by przebić błonę podstawną; okresowo przykładaj wymaz do roztworu kolagenazy, aby uwolnić komórki z włókien końcówki.

Po zakończeniu wymazu tekstura warstwy śródbłonka powinna wydawać się nieco gładsza niż wcześniej. Zebrać komórki zawieszone w roztworze kolagenazy i przenieść je do nowej sterylnej probówki 15 ml. Po usunięciu komórek śródbłonka z płatków, natychmiast umieścić płatki w probówce 15 ml zawierającej 10 ml roztworu kolagenazy w celu izolacji komórek śródmiąższowych.

Wirować probówki przy 1000 RPM przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu odwirowania wyizolowanych komórek, a następnie odessać supernatant. Do probótek 15 ml dodać trzy mililitry pożywki dla komórek śródbłonia. Wirować po raz drugi w ten sam sposób i odessać pożywkę.

To drugie wirowanie pomaga odfiltrować niektóre niepożądane zanieczyszczenia, takie jak włókna z końcówek pipet. Zawiesinę komórek śródbłonka po wirowaniu przenieś do pięciu mililitrów pożywki dla komórek śródbłonka i wysiej komórki do kolby T 25 uprzednio powleczonej kolagenem. Używając jednej kolby na każdą probówkę do wirowania, pozwól komórkom rosnąć przez co najmniej dwa do trzech dni przed wymianą pożywki dla komórek śródbłonka.

Pomaga to komórkom w regeneracji i podziale. Ponieważ proces izolacji jest dość drastyczny, a wydajność komórek może być niska, kluczowe jest pasażowanie komórek w pobliżu stanu konfluencji. Ze względu na to, że inhibicja kontaktowa może prowadzić do transformacji komórkowej, komórki śródbłonka można również izolować z konkretnej strony.

W tym celu należy najpierw przygotować szalkę Petriego z warstwą parafiny. Do szklanych szalek Petriego o średnicy 60 mm używamy folii aluminiowej. Należy przewidzieć dwie szklane szalki na jeden liścik.

Folia aluminiowa pomaga usunąć parafinę w celu ponownego wykorzystania szalki Petriego. Następnie należy wypełnić szalki granulkami parafiny do około połowy i przykryć je przed autoklawowaniem. Po zakończeniu autoklawowania i stopieniu parafiny, przenieś zestaw szalek na chłodną, płaską powierzchnię.

W miarę stygnięcia parafina twardnieje, tworząc warstwę, która umożliwi nakłuwanie igłą. Po 60 minutach sterylizowana szalka może zostać użyta do unieruchomienia tkanki płatka. Wyjmij wyizolowane z zastawki płatki z probówek o pojemności 15 mililitrów i umieść je na podłożu z parafiny.

Ustaw płatki w taki sposób, aby strona komorowa była skierowana w dół, przylegając do powierzchni parafiny, pozostawiając odsłoniętą stronę z włóknieniem. Przypnij brzegi płatka, aby odsłonić warstwę śródbłonka. Następnie nanieś po kilka kropli zimnej kolagenazy na każdą skierowaną ku górze powierzchnię śródbłonka i inkubuj tkankę przez 5 do 10 minut w temperaturze 37 °C.

Po zakończeniu inkubacji delikatnie usuń warstwę śródbłonka, tak jak poprzednio, przesuwając suchym sterylnym tamponem po powierzchni płatka. Od czasu do czasu przykładaj tampon do roztworu kolagenazy, aby usunąć komórki z włókien końcówki. Po zakończeniu pobierania wymazu tekstura warstwy śródbłonka powinna wydawać się nieco gładsza niż wcześniej.

Zebrać zawiesinę komórkową i przenieść ją do nowej, sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Oznaczyć specyficzność strony na etykietach; listki z tej samej zastawki można łączyć. Przepłukać unieruchomioną zastawkę kilkoma kroplami zimnego DPBS, aby usunąć pozostałe komórki lub zanieczyszczenia.

Przenieś płatki do nowej szalki hodowlanej w taki sposób, aby strona komorowa była teraz odsłonięta, a następnie pobierz komórki śródbłonka, tak jak właśnie pokazano. Po zakończeniu wymazu komórek śródbłonka z płatka G, natychmiast umieść płatki w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml roztworu kolagenazy. Przemyj komórki, resuspenduj je i hoduj zgodnie z instrukcją przedstawioną dla niespecyficznej względem strony izolacji komórek śródbłonka.

Jeśli wydajność komórek jest bardzo niska, należy rozważyć przeniesienie ich do mniejszej kolby lub zastosowanie płytki wielodołkowej. Ponieważ adhezja komórkowa sprzyja wzrostowi komórek, pamiętaj, aby pasażować komórki w pobliżu stanu konfluencji. Ze względu na to, że inhibicja kontaktowa może prowadzić do transformacji komórek, należy rozpocząć izolację komórek śródmiąższowych podczas wirowania komórek śródbłonka; probówki z płatkami inkubuje się przez około 12 do 18 godzin.

W roztworze kolagenazy, delikatnie mieszając, jeśli jest to wskazane. Po zakończeniu okresu inkubacji użyć pipety serologicznej, aby delikatnie wymieszać trawioną tkankę, aż zawiesina komórkowa stanie się jednorodna. Homogenizacja ta pomaga rozbić tkankę i uwolnić komórki śródmiąższowe; następnie odwirować i przemyć komórki w sposób opisany dla komórek śródbłonka.

Zamiast używać pięciu mililitrów medium do resuspensji komórek śródmiąższowych, zawiesić odwirowane komórki śródmiąższowe w 15 mililitrach medium do komórek śródmiąższowych i wysiać komórki do kolby T 75, używając jednej kolby na każdą probówkę do wirowania. Pozostawić komórki do wzrostu przez co najmniej jeden do dwóch dni przed wymianą medium do komórek śródmiąższowych; należy spodziewać się większej ilości pozostałości tkankowych niż w przypadku komórek śródbłonka. Ponadto komórki śródmiąższowe z natury szybciej osiągają konfluencję niż komórki śródbłonka i zapewniają wyższą wydajność komórkową na tych reprezentatywnych obrazach.

Morfologia hodowlanych komórek śródbłonka zastawek V Cs oraz komórek śródmiąższowych zastawek jest przedstawiona po dwóch do trzech dniach. BEC wykazują typową morfologię śródbłonka, w której komórki tworzą wzór przypominający brukowaną nawierzchnię i zaczynają formować skupiska.

Morfologia VS.Exhibit jest podobna do miofibroblastów, w której komórki mają zazwyczaj wrzecionowaty kształt i są rzadko rozmieszczone przy hodowli do ko-fluencji; ECS wykazują typową morfologię śródbłonka, w której komórki tworzą wzór brukowany, a ich wzrost jest hamowany przez kontakt. VI CS wykazują morfologię podobną do miofibroblastów, w której komórki mają zazwyczaj wrzecionowaty kształt i nie wykazują hamowania wzrostu przez kontakt. Charakterystyka funkcjonalna zarówno VEC, jak i VIC może być wnioskowana na podstawie barwienia. W przypadku LDL uptake.

Komórki VEC charakteryzują się wysokim poziomem wychwytu acetylowanego LDL. Podczas gdy komórki VIC wykazują niski poziom wychwytu acetylowanego LDL, tutaj przedstawiono markery komórkowe VEC i VIC. Komórki ECS wykazują pozytywne barwienie na czynnik von Willebranda, podczas gdy.

Nie wykazują barwienia na czynnik von Willebranda. Co więcej, barwienie V CS jest negatywne dla alpha smooth muscle actin, podczas gdy barwienie V CS jest pozytywne dla alpha smooth muscle actin. Mam nadzieję, że dowiedzieli się Państwo wiele z dzisiejszych izolacji.

Należy jednak pamiętać, że błona podstawna komórek śródbłonka jest bardzo delikatna i każde naruszenie leżącej pod nią macierzy często uwalnia zanieczyszczające komórki z reszty tkanki. Aby potwierdzić pomyślną izolację, charakterystyka jest kluczowa dla oceny czystości uzyskanych preparatów. Życzymy zatem powodzenia.