Name: Ocena odpowiedzi aparatów szparkowych na żywe komórki bakteryjne za pomocą obrazowania całych liści (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Poznaj metodę oceny odpowiedzi aparatów szparkowych na żywe bakterie przy użyciu całych liści roślin. Technika ta minimalizuje uszkodzenia tkanek i umożliwia obserwację ruchu komórek strażniczych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to zostało sfinansowane z grantu National Institute of Health oraz ze środków University of Texas at Arlington przyznanych dla MM.

1. Uprawa roślin i przygotowanie bakterii
<ol>
 <li>Aby rozpocząć tę procedurę, wysiej nasiona Arabidopsis na mieszankę podłoża do wzrostu (Redi-earth plug and seedling mix, Sun Gro), drobnego wermikulitu i perlitu w proporcji 1:1:1 v:v:v.</li>
 <li>Uprawiaj rośliny w komorze wzrostowej (22°C, 12 godzin dziennie przy natężeniu światła 100 μmol/mm2/sec i wilgotności 65±5%) i podlewaj w razie potrzeby. Rośliny są gotowe do użycia w ciągu 4-6 tygodni, gdy wykształcą młode, w pełni rozwinięte liście przed stadium kwitnienia.</li>
 <li>Na dwa dni przed rozpoczęciem eksperymentu przygotuj kulturę bakterii. Wyseciuj Pseudomonas syringae z banku w glicerolu na modyfikowane podłoże LB (10 g/L tryptonu, 5 g/L ekstraktu z drożdży, 5 g/L NaCl pH 7.0 oraz 1,5% agaru) i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 28°C. Do przygotowania inokulum używaj świeżej kultury i zawsze rozpoczynaj hodowlę na płytkach z banków w glicerolu, ponieważ bakterie tracą zjadliwość po kolejnych pasażach.</li>
 <li>Wykorzystaj bakterie wyhodowane na płytce do zaszczepienia 10 mL płynnej kultury P. syringae w kolbie Erlenmeyera o pojemności 50 mL. Inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 28°C przy intensywnym wytrząsaniu, aż osiągnie gęstość optyczną (OD) przy 600 nm w zakresie od 0,8 do 1.</li>
 <li>Zmierz OD przy 600 nm i zbierz komórki poprzez wirowanie przy 1360 xg przez 10 minut. Resuspenderuj komórki w wodzie destylowanej tak, aby końcowa wartość OD wynosiła 0,2. Ta wartość OD odpowiada 108 jednostkom tworzących kolonie (CFU)/mL. Po przygotowaniu bakterii przystąp do przygotowania liści i przeprowadzenia testu.</li>
</ol>
2. Barwienie liści i inkubacja z bakteriami
<ol>
 <li>Aby zbarwić liście, należy najpierw przygotować 20 μM roztwór jodku propidyny (PI) w wodzie. 10 mL roztworu wystarcza do jednoczesnego zbarwienia 3 małych liści.</li>
 <li>Wyjąć rośliny z komory wzrostowej i za pomocą pęsety odciąć 3 młode, w pełni rozwinięte liście. Zanurzyć całe liście w roztworze PI na 5 minut. Następnie wyjąć liście i krótko opłukać je wodą destylowaną.</li>
 <li>Następnie położyć liść na szkiełku przedmiotowym stroną dolną do dołu. Przeciąć liść ostrym ostrzem żyletki na cztery części, omijając żyłkę główną, tak aby liść przylegał płasko do szkiełka.</li>
 <li>Aby inkubować bakterie z liśćmi, dodać 300 μL zawiesiny bakteryjnej pod fragmenty liścia na szkiełku. Upewnić się, że dolna powierzchnia liścia styka się z inokulum.</li>
 <li>Inkubować próbki w tych samych warunkach środowiskowych, w których hodowano rośliny. W momencie obserwacji liści pod mikroskopem przenieść fragmenty liścia na nowe szkiełko stroną dolną do góry. Należy pamiętać, że podczas montowania preparatów nie stosuje się szkiełek nakrywkowych. Tę samą próbkę liścia można obrazować wielokrotnie podczas inkubacji, a przebieg czasowy można dostosować do celów badawczych.</li>
</ol>
3. Mikroskopia, pomiary i analiza danych
<ol>
 <li>Do badania liści wykorzystuje się konfokalny mikroskop skaningowy (LSM 510 Meta, Carl Zeiss Inc.). Należy obserwować dolną powierzchnię liści w celu wykrycia fluorescencji PI (wzbudzenie 453 nm, emisja 543 i 620 nm).</li>
 <li>Przy użyciu tych samych próbek liści należy rejestrować obrazy aparatów szparkowych w odstępach czasowych. Obrazy należy zapisać w celu pomiaru szerokości otworu szparkowego.</li>
 <li>Za pomocą przeglądarki obrazów LSM należy zmierzyć szerokość otworu co najmniej 60 szparek dla każdego wariantu badawczego w każdym punkcie czasowym.</li>
 <li>Należy obliczyć średnią i błąd standardowy dla szerokości otworu szparkowego. Istotność statystyczną wyników można obliczyć za pomocą dwustronnego, parzystego testu t Studenta.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne obrazy odpowiedzi szparek aparatów szparkowych na inkubację z bakteriami
<ol>
 <li>Oto typowy obraz mikroskopowy (z użyciem obiektywu 20x) powierzchni liścia Arabidopsis wykonany za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego w trybie jasnego pola (Rysunek 1).</li>
 <li>Jodek propidyny barwi ściany komórkowe żywych komórek, co zwiększa widoczność komórek szparkowych, a dodatkowo pozwala na zidentyfikowanie nieuszkodzonych komórek do gromadzenia danych (Rysunek 2). Na tych mikrofotografiach można zaobserwować różny stopień otwarcia ujść szparek, od całkowicie zamkniętych po szeroko otwarte.</li>
 <li>Całkowicie zamknięte szparki są identyfikowane po kształcie komórek szparkowych (Rysunek 3). Szerokość otworu uznaje się w takim przypadku za 0 μm.</li>
 <li>W przypadku szparek otwartych (Rysunek 4) pokazaną szerokość otworu mierzy się, rysując linię prostą przez najszerszy obszar otworu szparkowego.</li>
 <li>Są to typowe wyniki eksperymentalne tego testu szparek. Liście Arabidopsis inkubowano w ciemności z trzema różnymi szczepami Pseudomonas syringae. Tylko bakteria Pst DC3000 była w stanie otworzyć zamknięte w ciemności szparki, co zmierzono na podstawie szerokości otworu 60 losowo wybranych szparek na każdy szczep bakteryjny (Rysunek 5).</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig1.jpg" alt="Mikrostruktura komórkowa, obraz mikroskopowy, morfologia komórek, badania biologiczne, analiza strukturalna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Mikrograf powierzchni liścia Arabidopsis. Pojedyncze pole widzenia powierzchni liścia pod laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym (LSCM) z użyciem obiektywu 20x. Należy zauważyć, że szparki są mniej wyraźne w porównaniu z obrazem fluorescencyjnym uzyskanym dzięki barwieniu jodkiem propidynyum (Rysunek 2).
<img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig2.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej komórek roślinnych; widoczne czerwone chloroplasty i zaznaczone komórki szparkowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Mikrografia powierzchni liścia Arabidopsis barwionego jodkiem propidyny. Pojedyncze pole widzenia powierzchni liścia pod laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym (LSCM) z użyciem obiektywu 20x. Zwróć uwagę na różny stopień otwarcia ujść szparek. Żółte strzałki wskazują całkowicie zamknięte szparki, a zielone strzałki wskazują szparki szeroko otwarte.
<img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig3.jpg" alt="Obraz mikroskopii fluorescencyjnej, struktura komórki, zaznaczone obszary, analiza optyczna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Całkowicie zamknięte aparaty szparkowe zidentyfikowane na podstawie kształtu i szczeliny między komórkami szparkowymi. Szerokość otworu uznaje się za 0 μm.
<img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig4.jpg" alt="Mikroskopia w świetle spolaryzowanym; analiza dwójłomności; pomiary w skali mikro; właściwości optyczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4. Otwarte szparki ukazujące szerokość otworu w μm. Pomiary wykonano za pomocą przeglądarki LSCM na podstawie linii prostej narysowanej w najszerszym obszarze poru szparkowego.
<img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig5.jpg" alt="Wykres słupkowy otworu szparkowego (µm) w różnych punktach czasowych, gdzie DC3000 wykazuje największy wzrost." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> Rycina 5. Otwór szparkowy liści Arabidopsis inkubowanych z trzema szczepami Pseudomonas syringae pv. tomato: DC3118, DB29 oraz DC3000. Rośliny przetrzymywano w ciemności podczas czasu trwania eksperymentu. Wyniki przedstawiono jako średnią (n=50-70) ± błąd standardowy. Istotność statystyczną określono za pomocą obustronnego testu t Studenta. Eksperyment powtórzono trzykrotnie, uzyskując podobne wyniki.

<ol><li>Brooks, D. M., Hernandez-Guzman, G., Kloek, A. P., Alarcon-Chaidez, F., Sreedharan, A., Rangaswamy, V., Penaloza-Vazquez, A., Bender, C. L., Kunkel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+well-defined+series+of+coronatine+biosynthetic+mutants+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a well-defined series of coronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 17, 162-174 (2004).</li>
<li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKatagiri%2C+F+%22The+Arabidopsis+Book%22">The Arabidopsis Book</a>. Somerville, C. R., Meyerowitz, E. M. , American Society of Plant Biologists. Rockville, MD. (2002).</li>
<li>Ma, S. W., Morris, V. L., Cuppels, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+DNA+region+required+for+production+of+the+phytotoxin+coronatine+by+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Characterization of a DNA region required for production of the phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv. tomato.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 4, 69-74 (1991).</li>
<li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126, 969-980 (2006).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiliśmy prostą procedurę pomiaru szerokości otworu szparkowego w nienaruszonym tkance liścia, co pozwala na łatwą ocenę reakcji szparek na różne zabiegi.
Choć przedstawiliśmy wyniki uzyskane w systemie modelowym Arabidopsis/Pseudomonas syringae, test aparatów szparkowych na nienaruszonym liściu można potencjalnie przeprowadzić z dowolną kombinacją rośliny i bakterii. Protokół można łatwo zmodyfikować, aby dostosować go do wymagań wzrostowych innych roślin i patogenów bakteryjnych. Ogólna zasada i procedura pozostają takie same. Ponadto metoda ta może być przydatna badaczom pragnącym badać funkcjonalną odpowiedź komórek szparkowych nie tylko na żywe mikroorganizmy, ale także na inne bodźce i czynniki chemiczne w warunkach zachowujących naturalne środowisko liścia.
Obrazowanie całego liścia może być trudne ze względu na jego grubość i nierówną topografię. Problem ten można rozwiązać poprzez usunięcie żyłki środkowej liścia, aby leżał on płasko na szkiełku, oraz stosując mikroskopię konfokalną. Można jednak wykorzystać inne rodzaje mikroskopów fluorescencyjnych w celu uzyskania obrazów powierzchni liścia o wysokiej rozdzielczości.

<table><tbody><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>Tryptona</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-1</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Difco Laboratories</td><td>0127-01-7</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>VWR international</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bio Express</td><td>J637-2500G</td><td></td></tr><tr><td>Komora wzrostu roślin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsarką</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop skaningowy</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena reakcji aparatów szparkowych na żywe komórki bakteryjne z wykorzystaniem obrazowania całych liści

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Aparaty szparkowe są naturalnymi otworami w epidermie rośliny, odpowiedzialnymi za wymianę gazową pomiędzy wnętrzem rośliny a środowiskiem. Tworzą je dwie komórki szparkowe, które potrafią zamknąć otwór szparkowy w odpowiedzi na szereg czynników zewnętrznych, w tym natężenie światła, stężenie dwutlenku węgla oraz wilgotność względną (RH). Otwór szparkowy jest również główną drogą wnikania patogenów do liści, co stanowi kluczowy etap rozwoju choroby. Niedawne badania wykazały, że zamknięcie otworu jest skuteczne w minimalizowaniu rozwoju chorób bakteryjnych u roślin Arabidopsis; jest to integralna część wrodzonej odporności roślin. Wcześniej wykorzystywaliśmy preparaty z naskórka do oceny reakcji szparek na żywe bakterie (Melotto et al. 2006); jednak utrzymanie korzystnych warunków środowiskowych zarówno dla naskórka roślinnego, jak i komórek bakteryjnych, było trudne. Epidermę liścia można utrzymać przy życiu i w zdrowym stanie w buforze MES (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) na potrzeby eksperymentów elektrofizjologicznych komórek szparkowych. Jednak bufor ten nie jest odpowiedni do przygotowania zawiesiny bakteryjnej. Z drugiej strony komórki bakteryjne mogą przetrwać w wodzie, która nie nadaje się do długotrwałego utrzymania naskórka. Gdy preparat z naskórka unosi się na wodzie, komórki naskórka wystawione na działanie powietrza wysychają w ciągu 4 godzin, co ogranicza czas prowadzenia eksperymentu. Idealna metoda oceny wpływu konkretnego bodźca na komórki szparkowe powinna w jak największym stopniu minimalizować ingerencję w fizjologię szparek oraz w naturalne środowisko rośliny. Opracowaliśmy zatem nową metodę oceny reakcji szparek na żywe bakterie, w której uszkadzanie i manipulacje przy liściu są znacznie ograniczone, co ma na celu zapewnienie łatwo powtarzalnego i wiarygodnego testu szparkowego. Protokół opiera się na barwieniu nienaruszonego liścia jodkiem propidium (PI), inkubacji zbarwionego liścia z zawiesiną bakteryjną oraz obserwacji liści pod konfokalnym mikroskopem skaningowym. Ostatecznie metoda ta umożliwia obserwację tej samej żywej próbki liścia przez dłuższy czas w warunkach, które ściśle naśladują naturalne warunki, w jakich rośliny są atakowane przez patogeny.

Opracowaliśmy prosty i powtarzalny protokół badania odpowiedzi aparatów szparkowych na żywe bakterie. Metoda ta minimalizuje uszkadzanie i manipulację liściem w porównaniu do wcześniej opisanego zastosowania preparatów z naskórka liści.

Ocena reakcji aparatów szparkowych na żywe komórki bakteryjne z wykorzystaniem obrazowania całych liści

Aparaty szparkowe to naturalne otwory w epidermie rośliny, odpowiedzialne za wymianę gazową między wnętrzem rośliny a środowiskiem. Są one tworzone przez parę...

W niniejszej procedurze obrazowanie liści jest wykorzystywane do oceny ruchu szparek w odpowiedzi na żywe komórki bakteryjne. Najpierw bakterie są hodowane z zapasu w glicerolu i przygotowywany jest inokulum. Następnie zbiera się młode, zdrowe liście i barwi je jodkiem propidium.Barwione liście są wycinane, a fragmenty liści inkubowane na powierzchni zawiesiny bakteryjnej. Na koniec powierzchnię liścia obserwuje się pod mikroskopem, co pozwala na pomiar szerokości szparek aparatów szparkowych. Wyniki uzyskane przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej wykazują zmiany w szerokości szparek w odpowiedzi na obecność bakterii.Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak stosowanie peelingów epidermalnych, jest to, że liść w kontakcie z bakteriami pozostaje nienaruszony, co naśladuje naturalne warunki penetracji bakterii do liści. Aby rozpocząć tę procedurę, wysiej nasiona Arabidopsis na mieszankę podłoża do wzrostu z wermikulitem w proporcji 1:1:1. Hoduj rośliny w komorze wzrostowej i podlewaj w razie potrzeby.Rośliny są gotowe do użycia po czterech do sześciu tygodniach, gdy posiadają młode, całkowicie rozwinięte liście przed wyrzuceniem pędu kwiatostanowego. Na dwa dni przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować posiew bakterii. Pseudomonas ringe należy wyizolować z banku w glicerolu na zmodyfikowanym podłożu LB i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 28 °C.Do przygotowania inokulum należy użyć świeżej kultury, a hodowle na płytkach zawsze rozpoczynać od banków glicerolowych. Ponieważ bakterie tracą zjadliwość po kolejnych pasażach, należy wykorzystać bakterie z płytki do zaszczepienia 10 ml kultury płynnej pseudomona singe. Kulturę inkubuje się przez noc w kolbie Erlenmeyera o pojemności 50 ml w temperaturze 28 °C przy intensywnym wstrząsaniu, aż do osiągnięcia gęstości optycznej (OD) przy 600 nm w przedziale od 0,8 do 1.Zmierz OD przy 600 nm i zbierz komórki poprzez wirowanie z prędkością 1 360 ×g przez 10 minut. Resuspenduj komórki w wodzie destylowanej tak, aby końcowe OD wynosiło 0,2. Ta wartość OD odpowiada 10⁸ jednostkom tworzącym kolonie na mililitr.Po przygotowaniu bakterii należy przystąpić do przygotowania liści i przeprowadzenia testu w celu ich zabarwienia. Najpierw należy przygotować 20 µM roztwór jodku propidyny (PI) w wodzie. 10 mL roztworu wystarczy do jednorazowego zabarwienia trzech małych liści.Wyjąć rośliny z komory wzrostowej i za pomocą pęsety odłączyć trzy młode, w pełni rozwinięte liście. Zanurzyć całe liście w roztworze PI na pięć minut. Następnie wyjąć liście i krótko opłukać je wodą destylowaną.Następnie należy umieścić liść na szkiełku przedmiotowym stroną spodnią do dołu. Za pomocą ostrego ostrza brzytwy podzielić liść na cztery części, omijając żyłkę główną, tak aby liść przylegał płasko do szkiełka, co umożliwi inkubację bakterii z tkankami liścia. Pod fragmenty liścia na szkiełku dodać 300 µL zawiesiny bakteryjnej, upewniając się, że spodnia powierzchnia liścia styka się z inokulum.Inkubuj próbki w tych samych warunkach środowiskowych, w których hodowano rośliny. W momencie rozpoczęcia obserwacji liści pod mikroskopem, przenieś fragmenty liści na nowy szkiełko przedmiotowe, tak aby ich dolna powierzchnia była skierowana do góry. Należy pamiętać, że podczas przygotowywania preparatów nie stosuje się szkiełek nakrywkowych.Tę samą próbkę liścia można obrazować wielokrotnie podczas inkubacji, a przebieg czasowy można ustalić zgodnie z celami badawczymi. W tym przypadku do badania liści wykorzystuje się konfokalny skaningowy mikroskop laserowy, obserwując dolną powierzchnię liści w celu wykrycia fluorescencji PI przy użyciu tych samych próbek liści oraz rejestrując obrazy aparatów szparkowych w czasie. Zapisz obrazy, aby zmierzyć szerokość szczeliny szparkowej.Zmierz szerokość szczeliny aparatów szparkowych dla co najmniej 60 szparek dla każdej serii badawczej w każdym punkcie czasowym. Używając przeglądarki obrazów LSM, oblicz średnią oraz błąd standardowy dla szerokości szczeliny szparkowej. Istotność statystyczną wyników można obliczyć przy użyciu dwustronnego sparowanego testu t-Studenta.Przedstawiony tutaj obraz jest typowym zdjęciem mikroskopowym powierzchni liścia arabidopsis wykonanym za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. W obrazowaniu w polu jasnym jodek propidyny barwi ściany komórkowe żywych komórek, co zwiększa widoczność komórek szparkowych, a ponadto pozwala na identyfikację nieuszkodzonych komórek. Na tych mikrografach widoczny jest zakres stopnia otwarcia szparek aparatów szparkowych, od całkowicie zamkniętych do szeroko otwartych.Całkowicie zamknięte szparki rozpoznaje się po kształcie komórek szparkowych. W przypadku szparek otwartych szerokość otworu przyjmuje się za zero mikrometrów. Przedstawiona szerokość otworu jest mierzona za pomocą linii prostej przeprowadzonej przez najszerszy obszar otworu szparkowego.Są to typowe wyniki eksperymentalne testu inokulacji żywych liści. Liście Arabidopsis inkubowano w ciemności z trzema różnymi szczepami pseudomonas Cy Ringe; tylko bakteria P-S-T-D-C 3000 była w stanie otworzyć szparki w ciemności, co zmierzono na podstawie szerokości apertury 60 losowo wybranych szparek na szczep bakteryjny. Technika ta otworzyła przed badaczami z dziedziny zaplanowanych interakcji bakteryjnych drogę do zgłębiania mechanizmów wczesnej odpowiedzi na patogeny u gatunków roślin.

assessing-stomatal-response-to-live-bacterial-cells-using-whole-leaf

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ocena reakcji stomi na żywe komórki bakterii za pomocą pełnego obrazu liścia

Opisujemy zastosowanie perfluorodekaliny jako infiltracyjnego medium montażowego. Jest to prosta metoda poprawiająca głębokość obrazowania w tkance liścia Arabidopsis thaliana przy minimalnym wpływie fizjologicznym.

Prosta metoda obrazowania liści Arabidopsis z wykorzystaniem perfluorodekaliny jako infiltrującego medium obrazującego

Źródło: Lee, H. i wsp., Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji. J. Vis. Exp. (2018)Ten film przedstawia metodę monitorowania infekcji bakteryjnej i dostarczania białek efektorowych w komórkach roślinnych za pomocą komplementacji dzielonego białka fluorescencyjnego (sfGFP) w połączeniu z mikroskopią konfokalną. Podejście to umożliwia precyzyjną wizualizację translokacji efektorowej do cytozolu komórki gospodarza.

Monitorowanie infekcji bakteryjnej i dostarczania białek efektorowych w komórkach roślinnych

Odkrycie, w jaki sposób fizjologia i morfologia są ze sobą powiązane, pozwala na głębsze zrozumienie mechanistycznego funkcjonowania liści roślin. Przedstawiono zarówno procedurę wyprowadzania parametrów regulacji aparatów szparkowych na podstawie pomiarów przewodności aparatów szparkowych, jak i korelacje z tradycyjnymi funkcjonalnymi cechami liści.

Powiązanie przewodnictwa aparatów szparkowych z cechami funkcjonalnymi liści

Kwantyfikacja wzrostu patogenów jest potężnym narzędziem do charakteryzowania różnych odpowiedzi immunologicznych Arabidopsis thaliana (dalej: Arabidopsis). Opisana tutaj metoda przedstawia zoptymalizowany test infiltracji strzykawki w celu ilościowego określenia Pseudomonas syringae pv. Maculicola powiedział: Wzrost ES4326 w dorosłych liściach Arabidopsis.

Test infiltracji bakteryjnych liści w celu dokładnej charakterystyki reakcji obronnych roślin przy użyciu patosystemu Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae

Opisane są protokoły badania dynamiki zrębów chloroplastowych, kanalików wypełnionych zrębem, które rozciągają się od powierzchni chloroplastów.

Wizualizacja częstotliwości zrębu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Przedstawiamy prostą i wszechstronną metodę wykonywania fluorescencyjnego obrazowania na żywo liści Arabidopsis thaliana przez dłuższy okres czasu. Używamy transgenicznej rośliny Arabidopsis wykazującej ekspresję fluorescencyjnego genu reporterowego pod kontrolą promotora związanego z odpornością jako przykładu uzyskania czasoprzestrzennego zrozumienia odpowiedzi immunologicznych roślin.

Uniwersalna metoda montażu liści Arabidopsis do przyżyciowego obrazowania poklatkowego

Tutaj opisujemy hydroponiczny test wzrostu roślin, aby określić ilościowo obecność gatunków i zobrazować przestrzenne rozmieszczenie bakterii podczas początkowej kolonizacji korzeni roślin i po ich przeniesieniu do różnych środowisk wzrostu.

Monitorowanie kolonizacji i utrzymania kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w pływającym systemie hydroponicznym

Obecny protokół opisuje metodę, która pozwala na analizę ekspresji genów w pojedynczych komórkach w populacjach Pseudomonas syringae hodowanych w roślinnym apoplastie.

Jednokomórkowa analiza ekspresji genów Pseudomonas syringae w tkance roślinnej

Tutaj prezentujemy prostą metodę bezpośredniej obserwacji i automatycznego pomiaru reakcji aparatów szparkowych na inwazję bakterii u Arabidopsis thaliana. Metoda ta wykorzystuje przenośne urządzenie do obrazowania aparatów szparkowych wraz z potokiem analizy obrazu przeznaczonym do obrazów liści zarejestrowanych przez urządzenie.

Bezpośrednia obserwacja i automatyczny pomiar reakcji aparatów szparkowych na Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 w rzodkiewniku pospolitym (Arabidopsis thaliana)

Protokół ten opisuje podejście o wysokiej przepustowości do oceny wycieku jonów roślinnych, aktywności peroksydazy oraz produkcji kalloz w tej samej próbce.

Ocena odpowiedzi liści na metabolity drugorzędne mikroorganizmów przy użyciu formatu o wysokiej przepustowości

Protokół ten przedstawia porównawczą metodę oceny cech szparkowych i naskórkowych u dwóch odrębnych gatunków za pomocą peelingów naskórnych, technik oczyszczania oraz analizy obrazowej wspomaganej przez AI. Celem jest umożliwienie wysokoprzepustowej, powtarzalnej ilościowej identyfikacji struktur komórkowych leżących u podstaw funkcji szparków szparkowych dla zastosowań rolniczych oraz szerokich badań roślinnych.

Charakteryzacja cech szparków szparkowych i naskórka za pomocą peelingów, oczyszczania oraz analizy obrazów opartej na AI

Poznaj metodę oceny odpowiedzi aparatów szparkowych na żywe bakterie przy użyciu całych liści roślin. Technika ta minimalizuje uszkodzenia tkanek i umożliwia obserwację ruchu komórek strażniczych w czasie rzeczywistym.

Ocena reakcji aparatów szparkowych na żywe komórki bakteryjne z wykorzystaniem obrazowania całych liści

Przeglądaj więcej filmów