Ocena reakcji aparatów szparkowych na żywe komórki bakteryjne z wykorzystaniem obrazowania całych liści

W tej procedurze wykorzystuje się obrazowanie liści do oceny ruchu komórek szparkowych w odpowiedzi na żywe komórki bakteryjne. Najpierw bakterie są hodowane z banku w glicerolu i przygotowywany jest inokulum. Następnie zbiera się młode, zdrowe liście i barwi je jodkiem propidydem.

Barwione liście zostają pocięte, a fragmenty liści inkubowane na powierzchni zawiesiny bakteryjnej. Na koniec powierzchnię liścia obserwuje się pod mikroskopem, co pozwala na pomiar szerokości szparek aparatów szparkowych. Wyniki uzyskane przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej wykazują zmiany w szerokości szparek w odpowiedzi na obecność bakterii.

Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wykorzystanie peelingów epidermalnych, jest to, że liść w kontakcie z bakteriami pozostaje nienaruszony, co naśladuje naturalne warunki penetracji bakterii do liści. Aby rozpocząć tę procedurę, nasiona Arabidopsis wysiewa się na mieszaninę podłoża wzrostowego, wermikulitu i perlitu w proporcji 1:1:1. Rośliny należy hodować w komorze wzrostowej, podlewając je w razie potrzeby.

Rośliny są gotowe do użycia po czterech do sześciu tygodniach, gdy mają młode, w pełni rozwinięte liście przed stadium kwitnienia. Na dwa dni przed rozpoczęciem eksperymentu przygotuj posiew bakterii. Wyseij Pseudomonas ringe z zapasu w glicerolu na zmodyfikowanym medium LB i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 28 °C.

Do przygotowania szczepionki należy użyć świeżej hodowli, a płytki z kulturą zawsze rozpoczynać z zapasów glicerynowych. Ponieważ bakterie tracą zjadliwość po kolejnych pasażach, należy użyć bakterii z płytki do zaszczepienia 10 ml hodowli ciekłej pseudomona singe. W kolbie Erlenmeyera o pojemności 50 ml inkubować hodowlę przez noc w temperaturze 28 °C przy intensywnym mieszaniu, aż osiągnie gęstość optyczną (OD) przy 600 nm w zakresie od 0,8 do 1.

Zmierz OD przy 600 nm i zbierz komórki poprzez wirowanie przy 1 360 ×g przez 10 minut. Resuspenduj komórki w wodzie destylowanej tak, aby końcowa wartość OD wynosiła 0,2. Ta wartość OD odpowiada 10⁸ jednostkom tworzących kolonie na mililitr.

Po przygotowaniu bakterii należy przystąpić do przygotowania liści i przeprowadzić analizę w celu ich zabarwienia. Najpierw przygotuj 20 µM roztwór jodku propidium (PI) w wodzie. 10 mL roztworu jest wystarczające do jednoczesnego zabarwienia trzech małych liści.

Wyjmij rośliny z komory wzrostowej i za pomocą pincety odetnij trzy młode, w pełni rozwinięte liście. Zanurz całe liście w roztworze PI na pięć minut. Następnie wyjmij liście i krótko opłucz je wodą destylowaną.

Następnie należy położyć liść na szkiełku przedmiotowym stroną dolną do dołu. Za pomocą ostrego żyletka należy pociąć liść na cztery części, pomijając żyłkę główną, tak aby liść przylegał płasko do szkiełka, co umożliwi inkubację bakterii z tkanką liściową. Pod kawałki liścia na szkiełku należy dodać 300 µL zawiesiny bakteryjnej, upewniając się, że dolna powierzchnia liścia ma kontakt z inokulum.

Inkubuj próbki w tych samych warunkach środowiskowych, w których hodowano rośliny. W momencie rozpoczęcia obserwacji liści pod mikroskopem, przenieś fragmenty liści na nowy preparat, kładąc ich powierzchnię dolną do góry. Należy pamiętać, że podczas przygotowywania preparatów nie stosuje się szkiełek nakrywkowych.

Tę samą próbkę liścia można obrazować wielokrotnie podczas inkubacji, a przebieg czasowy można ustalić zgodnie z celami badawczymi. W niniejszej procedurze wykorzystano konfokalny mikroskop skaningowy do badania liści, obserwacji ich dolnej powierzchni w celu wykrycia fluorescencji PI przy użyciu tych samych próbek liści oraz rejestrowania obrazów aparatów szparkowych w czasie. Zapisz obrazy w celu pomiaru szerokości otworu szparkowego.

Zmierz szerokość szczeliny aparatów szparkowych dla co najmniej 60 szparek dla każdej serii badawczej w każdym punkcie czasowym. Korzystając z przeglądarki obrazów LSM, oblicz średnią i błąd standardowy dla szerokości szczeliny szparkowej. Istotność statystyczną wyników można obliczyć, stosując dwustronny test t-Studenta dla par.

T-test przedstawia typowy obraz mikroskopowy powierzchni liścia arabidopsis wykonany za pomocą skaningowego mikroskopu konfokalnego. W obrazowaniu w jasnym polu jodek propidyny barwi ścian komórkowych żywych komórek, co zwiększa widoczność komórek szpary oraz umożliwia identyfikację nieuszkodzonych komórek. Na tych mikrografiach widoczny jest zakres stopnia otwarcia szparek, od całkowicie zamkniętych po szeroko otwarte.

Całkowicie zamknięte szparki rozpoznaje się po kształcie komórek strażniczych. Szerokość szczeliny w przypadku szparek otwartych przyjmuje się jako 0 µm. Przedstawiona szerokość szczeliny jest mierzona za pomocą linii prostej poprowadzonej przez najszerszy obszar otworu szparkowego.

Są to typowe wyniki eksperymentalne testu inokulacji żywych liści. Liście Arabidopsis inkubowano w ciemności z trzema różnymi szczepami pseudomonas Cy Ringe; tylko bakteria P-S-T-D-C 3000 była w stanie otworzyć aparaty szparkowe w ciemności, co zmierzono na podstawie szerokości otworu 60 losowo wybranych aparatów szparkowych na szczep bakteryjny. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny planowanych oddziaływań bakteryjnych do zgłębiania mechanizmów wczesnej odpowiedzi na patogeny u gatunków roślin.