Ocena odpowiedzi aparatów szparkowych na żywe komórki bakteryjne za pomocą obrazowania całych liści

W tej procedurze obrazowanie liści służy do oceny ruchu komórek ochronnych w odpowiedzi na żywe komórki bakteryjne. Najpierw przygotowuje się bakterie wyhodowane z glicerolu i inokulum. Następnie zbiera się młode, zdrowe liście i barwi jodkiem propidyny.

Poplamione liście są cięte, a kawałki liści inkubuje się na wierzchu zawiesiny bakteryjnej. Na koniec powierzchnia liścia jest obserwowana pod mikroskopem i można zmierzyć otwory szparkowe. Wyniki uzyskane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pokazują zmiany w otworze szparkowym w odpowiedzi na bakterie.

Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak stosowanie peelingów naskórka, jest to, że liść w kontakcie z bakteriami jest nienaruszony, naśladując naturalne warunki przenikania bakterii do liści Aby rozpocząć tę procedurę. Tak więc rzodkiewnik nasiona na mieszance jeden do jednego, do jednego V do V do V do V podłoża uprawowego. Znajdź światło amilitu wermikulitu, hoduj rośliny w komorze wzrostowej i podlewaj w razie potrzeby.

Rośliny są gotowe do użycia w ciągu czterech do sześciu tygodni, gdy mają młode, w pełni rozwinięte liście przed przycięciem. Dwa dni przed rozpoczęciem eksperymentu przygotuj smugę kultur bakterii. Pseudomonas należy wytworzyć z glicerolu na zmodyfikowanym podłożu LB i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 28 stopni Celsjusza.

Do przygotowania inokulum należy używać świeżej kultury bakterii i zawsze zaczynać od płytek hodowlanych z wywaru gliceryny. Ponieważ bakterie stają się mniej zjadliwe po subkulturze, użyj bakterii, które wyrosły na płytce, aby rozpocząć 10-mililitrową płynną kulturę pseudomona singe. W 50-mililitrowej kolbie Erlenmeyera inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza, energicznie wstrząsając, aż osiągnie gęstość optyczną lub średnicę od 600 nanometrów między 0,8 a jeden.

Zmierzyć OD przy 600 i zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 1,360 razy G przez 10 minut. Resus zawiesić komórki w wodzie destylowanej tak, aby końcowy OD wynosił 0,2. Odpowiada to od 10 do ośmiu jednostek tworzących kolonie na mililitr.

Gdy bakterie są gotowe, przystąp do przygotowania liści i wykonaj test w celu zabarwienia liści. Najpierw przygotuj 20 mikromolowy roztwór propidy, jodku lub PI w wodzie. 10 mililitrów roztworu wystarczy do zabarwienia trzech małych liści na raz.

Wyjmij rośliny z komory wzrostowej i za pomocą kleszczy oderwij trzy młode, w pełni rozwinięte liście. Zanurz całe liście w roztworze PI na pięć minut. Następnie usuń liście i krótko je spłucz wodą destylowaną.

Następnie umieść liść dolną powierzchnią skierowaną w dół na szkiełku mikroskopowym. Pokrój liść ostrą żyletką na cztery części, z wyłączeniem żyły środkowej, tak aby liść leżał płasko na szkiełku, aby inkubować bakterie z liśćmi. Dodaj 300 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej pod kawałki liści na szkiełku, upewnij się, że dolna powierzchnia liścia styka się z inokulum.

Próbki należy inkubować w tych samych warunkach środowiskowych, które zostały użyte do uprawy roślin. Kiedy nadejdzie czas, aby obserwować liście pod mikroskopem, przenieś kawałki liści na nowe szkiełko dolną powierzchnią skierowaną do góry. Należy pamiętać, że szkiełko nakrywkowe nie jest używane podczas montażu prowadnic.

Ta sama próbka liści może być wielokrotnie obrazowana podczas inkubacji, a przebieg czasowy może być ustalony zgodnie z celami badań. W tym przypadku laserowy skaningowy mikroskop konfokalny służy do badania liści, obserwacji dolnej powierzchni liści w celu wykrycia fluorescencji PI przy użyciu tych samych próbek liści, przechwytywania obrazów stomii w czasie. Zapisz obrazy do pomiaru szerokości otworu szparkowego.

Zmierz szerokość otworu szparkowego wynoszącą co najmniej 60 stomii dla każdego zabiegu w każdym punkcie czasowym. Korzystając z przeglądarki obrazów LSM, oblicz błąd średni i błąd standardowy dla szerokości otworu szparkowego. Istotność statystyczna wyników może być obliczona przy użyciu dwustronnych par mądrych studentów.

Test T jest tutaj typowym obrazem mikroskopowym powierzchni liścia rzodkiewnika pod laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym. W jasnym polu jodek propidyny barwi ścianę komórkową żywotnych komórek, zwiększając widoczność komórek ochronnych, a także umożliwiając identyfikację komórek nieuszkodzonych. Na tych mikrofotografiach można zobaczyć szereg otworów aparatów szparkowych, od całkowicie zamkniętej stomii do szeroko otwartej stomii.

Całkowicie zamknięta stomia jest identyfikowana na podstawie kształtu komórek ochronnych. Uważa się, że szerokość otworu wynosi zero mikrometrów dla otwartej stomii. Pokazana szerokość otworu jest mierzona za pomocą linii prostej narysowanej w poprzek najszerszego obszaru porów stomijnych.

Są to typowe wyniki eksperymentalne testu inokulacji żywych liści. Liście rzodkiewnika inkubowano w ciemności z trzema różnymi szczepami pseudomonas Cy Ringe, tylko bakteria P-S-T-D-C 3000 była w stanie otworzyć ciemną stomię, mierzoną szerokością otworu 60 losowo wybranych stomii na szczep bakteryjny. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się planowanymi interakcjami bakterii do zbadania mechanizmów wczesnej reakcji na patogeny u gatunków roślin.