Szacowanie szybkości produkcji wirusów w systemach wodnych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie szybkości produkcji wirusów w wodnych społecznościach drobnoustrojów. Osiąga się to poprzez wstępną redukcję liczebności wolnych wirusów w badanej próbce, przy jednoczesnym zachowaniu natywnej społeczności mikrobiologicznej. Drugim etapem procedury jest inkubacja próbek w warunkach stymulujących oraz pobieranie podpróbek co dwie do trzech godzin przez okres do 10 godzin.

Trzecim krokiem procedury jest wyliczenie liczby wirusów w zebranych podpróbkach z każdego punktu czasowego. Ostatnim krokiem procedury jest określenie szybkości wzrostu liczebności cząsteczek wirusów w próbce oraz wyznaczenie tempa produkcji wirusów. W efekcie, na podstawie przeprowadzonych pomiarów, można uzyskać wyniki wskazujące na tempo produkcji wirusów w obrębie społeczności mikrobowej, co pozwala badaczom wnioskować o tempie śmiertelności mikroorganizmów spowodowanej aktywnością wirusów.

Witajcie wszyscy. Nazywam się Audrey Madison i pracuję w laboratorium dr. Stevena Milhama w Departamencie Mikrobiologii na Uniwersytecie Tennessee. Dzisiaj, z pomocą Charlesa Budoffa i Claire Campbell, zaprezentujemy procedurę analizy tempa produkcji wirusów w systemach wodnych.

Aby to osiągnąć, zmniejszamy liczbę wolnych wirusów w próbkach i wyliczamy tempo, w jakim pojawiają się one ponownie w wyniku lizy zakażonych wirusem mikroorganizmów. Obecnie stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania ekologii wirusów oraz tego, w jaki sposób mogą one kształtować społeczności drobnoustrojów. Po tym wstępie możemy przejść do rozpoczęcia pracy.

Przed rozpoczęciem tej procedury należy zebrać około 20 litrów wody morskiej w sposób jak najbardziej aseptyczny. Po pobraniu próbki wodę należy przefiltrować wstępnie przez filtr o średnicy 142 mm i wielkości porów 0,8 µm. W przypadku systemów o wysokiej produktywności biologicznej można poprzedzić ten etap filtracją przez filtr o większej wielkości porów lub filtr z włókna szklanego.

Aby uzyskać wodę ultrafiltrowaną, należy przygotować system ultrafiltracji, taki jak system AmCon M 12 z kartridżem z membraną spiralną w celu usunięcia wszystkich wirusów. Wirusy w próbce są następnie usuwane i zagęszczane przy prędkości wynoszącej około 25% prędkości maksymalnej i ciśnieniu wstecznym od 15 do 16 kPa. Retentat, o objętości około 500 ml, zawiera obecnie skoncentrowaną populację wirusów, którą można zachować do innych badań, podczas gdy wolny od wirusów permeat zostanie wykorzystany do testów produkcji wirusowej.

Po każdym dniu użytkowania należy wyczyścić system Omicron M 12, aby zapobiec uszkodzeniu membrany wkładu filtra. Podczas pracy z wodą morską membranę należy przepłukać co najmniej sześcioma litrami wody Milli Q, a następnie przemyć 0,1 M roztworem wodorotlenku sodu przez 30 do 45 minut. Następnie wkład należy przepłukać kolejnymi co najmniej sześcioma litrami wody Milli Q.

Po zakończeniu prac kartridż spiralny można przechowywać w 0,05 molarnym roztworze kwasu fosforowego w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby rozpocząć metodę redukcji wirusów, 500 mililitrów próbki wody morskiej z tej samej lokalizacji, z której pobrano wodę wolną od wirusów, umieszcza się w jednostce filtracji sterylnej z filtrem o niskim wiązaniu białek i nominalnej wielkości porów 0,2 mikrona. W tym momencie należy również pobrać podpróbkę w celu określenia całkowitej liczby wirusów i bakterii w wodzie wyjściowej.

Ostrożnie poddaj próbkę podciśnieniu poniżej 200 mmHg, stale resuspendując ją za pomocą sterylnej pipety transferowej, aby zapobiec koncentracji komórek bakteryjnych na filtrze. Następnie powoli dodaj do zawiesiny bakteryjnej trzy objętości (łącznie 500 mL) ultrafiltratu, aby zmniejszyć liczbę wolnych wirusów w próbce, utrzymując jednocześnie stałą gęstość populacji bakterii. Na koniec rozcieńcz frakcję bakteryjną z powrotem do objętości 500 mL, używając ultrafiltrowanej wody wolnej od wirusów. Następnie podziel ją na trzy powtórzenia po 150 mL i umieść je w przezroczystych butelkach z poliwęglanu o pojemności 250 mL.

Stanowi to zestaw próbek z punktu czasowego zero. Pobierz próbki do szacowania liczebności bakterii i wirusów z próbek z punktu czasowego zero. Przenieś próbki do probówek kriogenicznych z końcowym stężeniem od 2.0 do 2.5% sterylnego glutaraldehydu.

W celu utrwalenia próbek należy je bezzwłocznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia. Alternatywnie do zagęszczania drobnoustrojów morskich można zastosować system filtracji stycznej (TFF). Aby skorzystać z metody TFF, należy pobrać około 500 ml próbki naturalnej.

Skoncentrować tę próbkę, używając systemu filtracji stycznej o nominalnej wielkości porów 0,2 mikrona, aż frakcja bakteryjna zostanie zredukowana do około 10 do 15 ml w wodzie ultrafiltrowanej, wolnej od wirusów, zgodnie z opisem metody redukcji wirusów; uzyskane butelki z powtórzeniami inkubować w warunkach in situ. W komorach środowiskowych w morzu stosujemy inkubatory z przepływem wody morskiej podłączone do dopływu wody powierzchniowej, która utrzymuje temperaturę otoczenia. Poziomy oświetlenia można dostosować do warunków powierzchniowych, stosując niebieski akryl lub siatkę o neutralnej gęstości w celu zmniejszenia natężenia światła.

Podczas pracy w stacji terenowej lub laboratorium, a także w sytuacjach, gdy woda morska nie jest dostępna w przepływie, można zastosować inkubator wzrostowy z oświetleniem. Należy kontynuować pobieranie podpróbek co 2,5 godziny przez co najmniej 10 godzin, stosując metodę wykonaną dla próbki w czasie zero. Oprócz próbek do mikroskopii, niektórzy badacze będą chcieli pobrać wodę do ilościowej analizy qPCR w kierunku specyficznych wirusów.

W przypadku próbek do QPCR, należy dodać pięć mililitrów próbki do probówki kriogenicznej bez środka utrwalającego i natychmiast zamrozić w ciekłym azocie w ciekłym azocie w celu przygotowania do mikroskopii produkcji wirusowej; zamrożone próbki należy rozmrozić na lodzie i przygotować świeże roztwory zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Następnie należy umieścić filtr dyskowy o rozmiarze porów 0,02 mikrona i średnicy 25 milimetrów na filtrze wspierającym z celulozy o rozmiarze porów 0,45 mikrona. Następnie należy dodać 850 µL utrwalonej próbki na górną część filtra anadi i poddać próżni przy ciśnieniu poniżej 20 kPa aż do całkowitego wyschnięcia.

Po wyschnięciu filtra z dyskiem anody, pipetuj 100 µL roboczego roztworu Cyber Green do sterylnej szalki Petriego. Przy wciąż włączonej pompie próżniowej ostrożnie wyjmij dysk anody z wieży filtracyjnej i umieść go w roztworze Cyber Green. Inkubuj próbki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

Ostrożnie wyjmij filtr z roztworu cyber green i osusz jego tylną stronę za pomocą chusteczki Kim wipe, aby usunąć cały pozostały barwnik. Następnie nanieś małą kroplę roztworu Antifa na szkiełko przedmiotowe i przykryj ją szkiełkiem nakrywką. Zdejmij szkiełko nakrywkowe i umieść wysuszony filtr na szkiełku przedmiotowym.

Ponownie dodaj niewielką ilość roztworu Antifa na szkiełko nakrywkowe i powoli umieść je na wierzchu filtra, dbając o usunięcie wszelkich pęcherzyków powietrza, które mogą powstać. Policz wirusy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z szerokopasmowym filtrem niebieskim; policz co najmniej 20 pól widzenia dla każdego filtra, upewniając się, że określasz całkowitą liczbę wirusów z każdej siatki pola, aby zapewnić równomierny rozkład wirusów na membranie filtra. Oblicz średnie tempo powrotu wirusów z trzech niezależnych powtórzeń i wyznacz odchylenie standardowe dla temp produkcji. Na koniec skoryguj te wartości o rozcieńczenie mikroorganizmów z liczebności początkowej do liczebności rozcieńczonej w próbce o zredukowanej zawartości wirusów.

Podstawowym zbiorem danych wynikającym z niniejszego badania są wskaźniki powtarzalności liczebności wirusów w podpróbkach z inkubacji. Wyniki te stanowią niezależne regresje liczebności wirusów w funkcji czasu dla każdej z próbek. Produkcja cząstek wirusopodobnych była monitorowana przez 10 godzin inkubacji w warunkach in situ przy użyciu mikroskopii epi-fluorescencyjnej.

Próbki te pobrano podczas zakwitu fitoplanktonu u wybrzeży Nowej Zelandii we wrześniu 2008 roku. Przedstawiliśmy właśnie sposób szacowania tempa produkcji wirusów. Obejmuje on zastosowanie różnych systemów ultrafiltracji oraz przeprowadzenie eksperymentów w celu pomiaru tempa produkcji wirusów.

Pokazaliśmy również, jak przeprowadzić liczenie tych wirusów za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o używaniu czystego sprzętu, ostrożnym obchodzeniu się z zabarwionymi wirusami, ograniczeniu ekspozycji na światło, szybkim przetwarzaniu próbek oraz właściwym czyszczeniu wkładów do ultrafiltracji po każdym użyciu. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.