Name: Szacowanie tempa produkcji wirusa w systemach wodnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Poznaj metodę szacowania tempa produkcji wirusa w wodnych wspólnotach mikroorganizmów morskich i słodkowodnych. Technika redukcji i ponownego pojawiania się umożliwia wnioskowanie o śmiertelności mikroorganizmów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Publikacja niniejszego artykułu została sfinansowana z grantu przyznanego przez Office of Research na University of Tennessee. Autorzy dziękują poprzednim pokoleniom studentów i badaczy, którzy pracowali nad udoskonaleniem tych procedur. Badania były wspierane przez granty z National Science Foundation (NSF-0851113, NSF-0825405 oraz NSF-0550485).

1. Ultrafiltracja wody morskiej w celu uzyskania wody „wolnej od wirusów” (Wilhelm &amp; Poorvin 2001)
<ol>
 <li>Pobiera się około 20 L wody morskiej lub jeziornej, zachowując maksymalną możliwą aseptykę.</li>
 <li>Wodę poddaje się wstępnej filtracji seryjnej przez filtry poliwęglanowe o średnicy 142 mm i wielkości porów 0.8 μm, które można przechowywać w temperaturze -20 °C do analizy konsorcjum mikroorganizmów. W przypadku układów o bardzo wysokiej produktywności przed tym krokiem można zastosować filtry o większej wielkości porów.</li>
 <li>W celu uzyskania wody ultrafiltrowanej z systemu Amicon M12 (Millipore) stosuje się spiralny wkład z progiem odcięcia 30 kDa, aby usunąć wszystkie wirusy, w tym małe wirusy RNA.</li>
 <li>Próbki są przetwarzane i zagęszczane przy prędkości ~ 25% i ciśnieniu wstecznym ~ 15-16 kPa.</li>
 <li>Pozostała próbka o objętości ~ 500 mL wody będzie zawierać zagęszczone konsorcjum wirusów (które można zachować do innych doświadczeń), natomiast pozostałe 19,5 L wody wolnej od wirusów zostanie wykorzystane do testów produkcji wirusowej.</li>
 <li>Po każdym dniu użytkowania system Amicon M12 musi zostać wyczyszczony, aby zapobiec uszkodzeniu membrany wkładu filtrującego.</li>
 <li>W przypadku pracy z wodą morską membranę należy wypłukać co najmniej 6 L wody Milli-Q, a następnie przemyć roztworem 0.1N NaOH przez 30-45 minut.</li>
 <li>Wkład należy ponownie wypłukać co najmniej 6 L wody Milli-Q.</li>
 <li>Po zakończeniu pracy z systemem M12 wkład spiralny należy przechowywać w roztworze 0.05M H3PO4 w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
2. Metoda redukcji wirusa w celu produkcji wirusowej (Wilhelm et al. 2002)
<ol>
 <li>Pobiera się do 500 mL próbki wody morskiej / jeziornej zawierającej zarówno gospodarzy, jak i wirusy, a następnie umieszcza ją w jednostce sterifiltru z nałożonym filtrem o nominalnej wielkości porów 0,2-μm o niskim stopniu wiązania białek (np. Durapore).</li>
 <li>Próbkę poddaje się delikatnemu podciśnieniu próżniowemu &lt;200 mmHg, stale resuspendując ją za pomocą sterylnej pipety transferowej, aby zapobiec koncentracji komórek bakteryjnych na filtrze.</li>
 <li>Do zawiesiny bakteryjnej powoli dodaje się trzy objętości ultrafiltratu, aby znacząco zredukować liczbę wolnych wirusów w próbce.</li>
 <li>Frakcję bakteryjną rozcieńcza się z powrotem do 500 mL wodą wolną od wirusów, a następnie dzieli na trzy powtórzenia po 150 mL każde i umieszcza w przezroczystych poliwęglanowych butelkach o pojemności 250ml.</li>
</ol>
3. Metoda filtracji przepływu stycznego (TFF) w produkcji wirusowej (Weinbauer et al. 2002, Winget et al. 2005)
TFF stanowi alternatywne podejście do metody redukcji wirusów.
<ol>
 <li>Zgodnie z powyższym opisem pobiera się około 500 mL naturalnej próbki.</li>
 <li>Próbkę tę zagęszcza się przy użyciu systemu filtracji przepływowej stycznej o nominalnej wielkości porów 0,2-μm.</li>
 <li>Gdy frakcja bakteryjna zostanie zredukowana do około 10-15 mL, dodaje się ultrafiltrowaną wodę wolną od wirusów i rozdziela ją w sposób opisany powyżej.</li>
 <li>Powielone butelki inkubuje się w warunkach in situ w komorach środowiskowych.
 <ol>
 <li>Poziom oświetlenia dostosowuje się do warunków powierzchniowych, stosując niebieski akryl lub przezroczysty akryl z siatką cieniującą w celu zmniejszenia natężenia światła.</li>
 <li>Temperatury powierzchniowe otoczenia często uzyskuje się za pomocą pokładowego inkubatora z przepływem wody morskiej.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Próbki do szacowania liczebności bakterii i wirusów pobiera się w czasie 0, dodając do krioproletek sterylny glutaraldehyd o stężeniu końcowym 2,0-2,5%. Próbki te są natychmiast zamrażane szokowo w ciekłym azocie i przechowywane w zamrożeniu do czasu przetworzenia.
 <ol>
 <li>W przypadku braku dostępności ciekłego azotu można natychmiast przygotować i przetworzyć preparaty na szkiełkach mikroskopowych (patrz procedura poniżej)</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Podpróbki pobiera się co 2,5 godziny przez co najmniej 10 godzin metodą opisaną powyżej.
 <ol>
 <li>W tym czasie można pobrać wodę do analizy ilościowej PCR. Do krioproletki bez środka utrwalającego można dodać do 5 mL próbki, a następnie natychmiast zamrozić ją szokowo w ciekłym azocie.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
4. Mikroskopia produkcji wirusowej (Noble &amp; Fuhrman 1998, Wen et al. 2004)
<ol>
 <li>Zamrożone próbki przeznaczone do filtracji przez membranę 0,02 μm w celu przeprowadzenia mikroskopii należy rozmrozić na lodzie.</li>
 <li>Należy przygotować roztwór zapasowy SYBR Green poprzez rozcieńczenie roztworu zapasowego w sterylnej wodzie w stosunku 1:10. Następnie, z roztworu zapasowego, należy przygotować roztwór roboczy, dodając 1 mL roztworu zapasowego do 39 mL sterylnej wody. Przed rozpoczęciem należy również przygotować roztwór 50% glicerolu i 50% fosforanowego buforu solnego (PBS, 0,05 M Na2HPO4, 0,85% NaCl, pH 7,5) oraz świeży, 2,5% roztwór zapasowy p-fenylenodiaminy. Roztwór 50% glicerolu/50% PBS należy przechowywać w temperaturze 4°C, a roztwór zapasowy p-fenylenodiaminy w temperaturze -20°C w ciemności do momentu rozpoczęcia pracy. Bezpośrednio przed filtracją należy dodać p-fenylenodiaminę do roztworu 50% glicerolu/50% PBS do stężenia końcowego 0,1%, aby uzyskać roztwór Antifade.</li>
 <li>Na wierzchu filtra podkładowego z celulozy MicronStep 0,45 μm należy umieścić filtr Anodisc 25 mm 0,02 μm. Na wierzch Anodiscu należy nanieść 850 μL utrwalonej próbki i poddać działaniu próżni przy 20 pKa aż do całkowitego wyschnięcia. Do sterylnej szalki Petriego należy nalać 100 μL roboczego roztworu SYBR Green, a następnie, przy wciąż włączonej próżni, ostrożnie zdjąć Anodisc z wieży filtracyjnej i położyć go na SYBR Green. Próbki należy inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Ostrożnie należy zdjąć filtr z roztworu SYBR Green i osuszyć tył filtra chusteczką Kimwipe, aby usunąć cały pozostały barwnik. W razie potrzeby filtr można ponownie umieścić w wieży i przepuścić przez niego do 800 μL wody filtrowanej przez membranę 0,02 μm lub sterylnego medium, aby wypłukać nadmiar barwnika.</li>
 <li>Na szkiełko mikroskopowe należy nanieść małą kroplę roztworu antifade i nałożyć na wierzch szkiełko nakrywkowe. Należy zdjąć szkiełko nakrywkowe i przyłożyć wysuszony filtr do szkiełka mikroskopowego zwilżonego roztworem antifade. Ponownie należy nanieść niewielką ilość roztworu antifade na szkiełko nakrywkowe i powoli położyć je na filtrze, upewniając się, że usunięto wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogły powstać.</li>
 <li>Szkiełka należy niezwłocznie zamrozić w temperaturze -20° C do czasu użycia (należy ich użyć w ciągu kilku miesięcy, aby zapobiec blaknięciu i spadkowi liczby wirusów).</li>
 <li>Wirusy są zliczane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (w naszym przypadku mikroskop Leica DMRXA) z szerokim zestawem filtrów niebieskich (λEx= 450 do 490 nm, λEm= 510 nm z filtrem tłumiącym przy λ= 510 nm). Dla każdego filtra zostanie przeliczone co najmniej 20 pól widzenia, przy czym należy ilość wszystkich wirusów z każdej siatki pól, aby zapewnić równomierny rozkład wirusów na membranie filtra.</li>
 <li>Następnie oblicza się średnie wskaźniki powstawania wirusów z trzech niezależnych powtórzeń i wyznacza odchylenie standardowe z szybkości produkcji.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Surowe dane zebrane przez badacza wymagają minimalnego przetwarzania matematycznego w celu wyznaczenia wskaźników powtarzalności liczebności wirusów. Głównym zbiorem danych wynikającym z niniejszego badania są wskaźniki powtarzalności liczebności wirusów w podpróbkach z inkubacji. Wyniki te stanowią niezależne regresje liczebności wirusów w funkcji czasu dla każdej z próbek. Dla każdej próbki poszczególne inkubacje traktowane są jako jedna seria pomiarowa, zatem poprzez przeprowadzenie trzech inkubacji powtórzonych badacz może obliczyć wskaźniki oraz oszacować wariancję (np. odchylenie standardowe) (patrz Rysunek 1).
Jednym zastrzeżeniem dotyczącym tego procesu jest fakt, że zmniejszenie liczebności wirusów nieuchronnie prowadzi do redukcji liczby komórek gospodarza w próbce, które przenoszą ładunek wirusowy. Aby zrekompensować tę stratę, konieczne jest określenie liczebności bakterii zarówno w materiale źródłowym (niefiltrowanej wodzie morskiej lub jeziornej), jak i w próbce inkubacyjnej dla T = 0. Informacje te można wykorzystać do obliczenia procentowej utraty komórek: przyjmując, że proces redukcji liczebności wirusów nie jest selektywny względem żadnych członków społeczności mikrobiologicznej, czynnik ten można następnie wykorzystać do oszacowania tempa produkcji wirusów in situ.
<img src="/files/ftp_upload/2196/2196fig1.jpg" alt="Wykres stężenia cząstek wirusowych w funkcji czasu przedstawiający powtórzenia z paskami błędów dla analizy eksperymentalnej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Produkcja cząstek wirusopodobnych podczas 10-godzinnej inkubacji w warunkach in situ z wykorzystaniem mikroskopii epifluorescencyjnej. Próbki pobrano podczas zakwitu fitoplanktonu u wybrzeży Nowej Zelandii we wrześniu 2008 roku. <img src="/files/ftp_upload/2196/2196fig2.jpg" alt="Schemat procesu ultrafiltracji szczegółowo przedstawiający zagęszczanie wirusów oraz monitorowanie za pomocą mikroskopii i qPCR." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Schemat przebiegu procesu badania produkcji wirusów. Proces rozpoczyna się od ultrafiltracji próbek wody w celu uzyskania wody wolnej od wirusów. Jest to realizowane przy użyciu systemu ultrafiltracji. Równolegle z tego samego miejsca pobierane są próbki wody; wolne wirusy przechodzą przez filtr, podczas gdy społeczność drobnoustrojów (zawierająca mieszankę komórek zainfekowanych i niezinfekowanych) zostaje zatrzymana. Następnie społeczność tę resuspendsuje się w wodzie wolnej od wirusów i inkubuje w warunkach in situ. Następnie monitoruje się tempo ponownego pojawiania się wirusów przez kolejne 10 godzin, aby określić tempo produkcji wirusów.

<ol><li>Higgins, J. L., Kudo, I., Nishioka, J., Tsuda, A., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response+of+the+virus+community+to+a+mesoscale+iron+fertilization+in+the+sub-Arctic+Pacific+Ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Deep-Sea+Res+II%22%5BJournal%5D)">The response of the virus community to a mesoscale iron fertilization in the sub-Arctic Pacific Ocean.</a> Deep-Sea Res II. 56, 2788-2795 (2009).</li>
<li>Mioni, C. E., Poorvin, L., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+and+siderophore-mediated+transfer+of+available+Fe+between+heterotrophic+bacteria%3A+characterization+using+a+Fe-specific+bioreporter%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Virus and siderophore-mediated transfer of available Fe between heterotrophic bacteria: characterization using a Fe-specific bioreporter.</a> Aquat Microb Ecol. 41, 233-245 (2005).</li>
<li>Noble, R. T., Fuhrman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+SYBR+Green+I+for+rapid+epifluorescence+counts+of+marine+viruses+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria.</a> Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).</li>
<li>Parada, V., Herndl, G., Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+burst+size+of+heterotrophic+prokaryotes+in+aquatic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mar+Biol+Assoc+U+K%22%5BJournal%5D)">Viral burst size of heterotrophic prokaryotes in aquatic systems.</a> J Mar Biol Assoc U K. 86, 613-621 (2006).</li>
<li>Poorvin, L., Rinta-Kanto, J. M., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+release+of+Fe+and+its+bioavailability+to+marine+plankton%5BTitle%5D)+AND+%22Limnol+Oceanogr%22%5BJournal%5D)">Viral release of Fe and its bioavailability to marine plankton.</a> Limnol Oceanogr. 49, 1734-1741 Forthcoming.</li>
<li>Rowe, J. M., Saxton, M. A., Cottrell, M. T., DeBruyn, J. M., Berg, G. M., Kirchman, D. L., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constraints+on+virus+production+in+the+Sargasso+Sea+and+North+Atlantic%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Constraints on virus production in the Sargasso Sea and North Atlantic.</a> Aquat Microb Ecol. 52, 233-244 (2008).</li>
<li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+of+prokaryotic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Ecology of prokaryotic viruses.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-181 (2004).</li>
<li>Weinbauer, M. G., Peduzzi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency%2C+size+and+distribution+of+bacteriophages+in+different+marine+morphotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Ecol+Prog+Ser%22%5BJournal%5D)">Frequency, size and distribution of bacteriophages in different marine morphotypes.</a> Mar Ecol Prog Ser. 108, 11-20 (1994).</li>
<li>Weinbauer, M. G., Winter, C., H&ouml, fle, G, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconsidering+transmission+electron+microscopy+based+estimates+of+viral+infection+of+bacterioplankton+using+conversion+factors+derived+from+natural+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Reconsidering transmission electron microscopy based estimates of viral infection of bacterioplankton using conversion factors derived from natural communities.</a> Aquat Microb Ecol. 27, 103-110 (2002).</li>
<li>Wen, K., Ortmann, A. C., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+estimation+of+viral+abundance+by+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Accurate estimation of viral abundance by epifluorescence microscopy.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 3862-3867 (2004).</li>
<li>Wilhelm, S. W., Brigden, S. M., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dilution+technique+for+the+direct+measurement+of+viral+production%3A+a+comparison+in+stratified+and+tidally+mixed+coastal+waters%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">A dilution technique for the direct measurement of viral production: a comparison in stratified and tidally mixed coastal waters.</a> Microb Ecol. 43, 168-173 (2002).</li>
<li>Wilhelm, S. W., Matteson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freshwater+and+marine+virioplankton%3A+a+brief+overview+of+commonalities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Freshw+Biol%22%5BJournal%5D)">Freshwater and marine virioplankton: a brief overview of commonalities and differences.</a> Freshw Biol. 53, 1076-1089 (2008).</li>
<li>Wilhelm, S. W., Poorvin, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilhelm%2C+SW+%22Quantification+of+algal+viruses+in+marine+samples%22">Quantification of algal viruses in marine samples</a>. Paul, J. H. , Academic Press. London, UK. 53-66 (2001).</li>
<li>Wilhelm, S. W., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruses+and+nutrient+cycles+in+the+sea%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%22%5BJournal%5D)">Viruses and nutrient cycles in the sea.</a> Bioscience. 49, 781-788 (1999).</li>
<li>Wilhelm, S. W., Weinbauer, M. G., Suttle, C. A., Jeffrey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+sunlight+in+the+removal+and+repair+of+viruses+in+the+sea%5BTitle%5D)+AND+%22Limnol+Oceanogr%22%5BJournal%5D)">The role of sunlight in the removal and repair of viruses in the sea.</a> Limnol Oceanogr. 43, 586-592 (1998).</li>
<li>Winget, D. M., Williamson, K. E., Helton, R. R., Wommack, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tangential+flow+diafiltration%3A+an+improved+technique+for+estimation+of+virioplankton+production%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Tangential flow diafiltration: an improved technique for estimation of virioplankton production.</a> Aquat Microb Ecol. 41, 221-232 (2005).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Kluczowym elementem zrozumienia, w jaki sposób wirusy wpływają na morskie społeczności drobnoustrojów, jest określenie szybkości produkcji cząsteczek wirusów. Biorąc pod uwagę, że ich liczebność jest (mniej lub bardziej) statyczna w większości systemów (Wilhelm &amp; Suttle 1999, Weinbauer 2004), a wirusy są szybko usuwane lub tracą zdolność infekowania w systemach wodnych (Wilhelm et al. 1998), tempo produkcji musi być względnie wysokie, aby zastąpić utracone cząsteczki. Szacowanie śmiertelności mikrobów wywołanej przez wirusy w obrębie społeczności mikrobiologicznej wymaga wiedzy o tym, ile wirusów powstaje podczas każdego procesu lizy komórki (tzw. „wielkość wyrzutu”, ang. burst size). Wielkość wyrzutu wirusów w próbkach naturalnych może się znacznie różnić. Można ją wyznaczyć bezpośrednio za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (np. Weinbauer &amp; Peduzzi 1994), jednak często wykracza to poza możliwości danego laboratorium lub nie zawsze jest praktyczne. W sytuacjach, gdy nie można ich wyznaczyć empirycznie, dla systemów morskich można przyjąć wartości literaturowe wynoszące 24 wirusy na zdarzenie lityczne, a dla systemów słodkowodnych 34 (Parada et al. 2006). Jeśli tempo produkcji wirusów zostanie podzielone przez tę liczbę, wynikiem będzie liczba komórek na jednostkę objętości niszczonych przez wirusy w skali doby. Otrzymaną wartość liczby zlizowanych mikrobów można następnie podzielić przez całkowitą liczebność bakterii, co pozwoli wyznaczyć śmiertelność indukowaną przez wirusy w badanym systemie: istniejące szacunki wahają się od kilku procent do prawie całej populacji i często zależą od innych czynników w badanym systemie (Wilhelm &amp; Matteson 2008). Aby określić procent całkowitej śmiertelności, liczbę tę często mnoży się przez dwa (przy założeniu, że 50% komórek przechodzi do reprodukcji, a 50% komórek zostaje utraconych, Weinbauer 2004). Biorąc pod uwagę, że biodostępność składników odżywczych i pierwiastków śladowych (np. N, P, Fe) może ograniczać tempo pierwotnej produktywności, a tym samym przepływ węgla przez systemy wodne, zrozumienie roli śmiertelności mikroorganizmów indukowanej przez wirusy w tym procesie stało się przedmiotem zainteresowania geochemików morskich. Istnieje obecnie kilka szacunków sugerujących, że wirusy codziennie uwalniają do kolumny wody znaczne stężenia pierwiastków odżywczych (Rowe et al. 2008, Higgins et al. 2009) i że pierwiastki te są szybko asymilowane przez społeczność mikrobiologiczną (Poorvin et al. 2004, Mioni et al. 2005). Tempo przepływu składników odżywczych do środowiska można określić, mnożąc liczbę zniszczonych komórek przez ilość składnika odżywczego na komórkę (oznaczaną jako „kwoty”). Informacje te mogą dostarczyć kluczowego elementu do zrozumienia sposobu funkcjonowania mikrobiologicznych sieci troficznych w systemach wodnych. Bieżące kierunki rozwoju: Obecne działania szeregu grup badawczych koncentrują się na adaptacji powyższej strategii w celu enumeracji konkretnych wirusów w obrębie społeczności, a tym samym określenia, w jaki sposób konkretne organizmy są pod wpływem aktywności wirusów. W tym celu badacze stosują ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (qPCR), aby oszacować liczebność konkretnych grup lub rodzin wirusów równolegle do szacowania całkowitej społeczności wirusów. Wyniki te są następnie bezpośrednio wykorzystywane do określenia śmiertelności wirusów, obrotu składników odżywczych itp. dla konkretnych grup planktonu. To potężne, nowe podejście pozwoli badaczom w nadchodzących latach znacznie głębiej zgłębić procesy związane z ekologią wirusów i po raz pierwszy ilościowo określić interakcje w konkretnych społecznościach wirus-gospodarz poza ograniczeniami systemów laboratoryjnych.

<table><tbody><tr><td>2,5% &lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-fenylenediamina</td><td>Acros Organics</td><td>130575000</td><td>Roztwór zapasowy do Antifade</td></tr><tr><td>System Amicon Proflux M12</td><td>EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>Do tego etapu można użyć dowolnego urządzenia do ultrafiltracji</td></tr><tr><td>Barwnik do żeli kwasów nukleinowych SYBR Green I</td><td>Invitrogen</td><td>S-7563</td><td></td></tr><tr><td>Filtr Helicon S10 30kDa</td><td>EMD Millipore</td><td>CDUF010LT</td><td></td></tr><tr><td>Filtry Pelicon XL 0,22 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>PXGVPPC50</td><td></td></tr><tr><td>Filtry membranowe GE 0,2 &amp;mu;m PCTE (47 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-732-35</td><td></td></tr><tr><td>System do filtracji stycznej w skali laboratoryjnej Millipore Labscale Tangential Flow Filtration System</td><td>EMD Millipore</td><td>XX42LSS11</td><td>Do tego etapu można użyć innych systemów TFF</td></tr><tr><td>Filtry Micronstep 0,45 &amp;mu;m, celulozowe, białe, gładkie (25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>E04WP02500</td><td></td></tr><tr><td>Filtry GE Whatman Anodisc 0,02 &amp;mu;m (25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>68-09-6002</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Leica DMRXA</td><td></td><td></td><td>Można użyć dowolnego mikroskopu epifluorescencyjnego z zestawem filtrów niebieskich</td></tr><tr><td>Poliwęglanowe baniaki 20L</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>PBS (0,05 M Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0,85% NaCl, pH 7,5)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-500, S640-500</td><td></td></tr><tr><td>50% Glutaraldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>G151-1</td><td></td></tr><tr><td>Krioprobówki Corning 2 mL – polipropylenowe z gwintem zewnętrznym</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-71</td><td>Można użyć dowolnych kriopróbek</td></tr><tr><td>Krioprobówki Corning 5 mL – polipropylenowe z gwintem zewnętrznym</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-74</td><td>Można użyć dowolnych kriopróbek</td></tr><tr><td>85% H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A242-212</td><td>Przechowywanie membran spiralnych</td></tr><tr><td>Granulki NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-3</td><td>Czyszczenie M12</td></tr><tr><td>Miarki graduowane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr membranowy Isopore o rozmiarze porów 0,8-&amp;mu;m (142 mm)</td><td>EMD Millipore</td><td>ATTP14250</td><td></td></tr><tr><td>Stalowy uchwyt filtra ciśnieniowego Millipore (142 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>YY30 090 00</td><td></td></tr></tbody></table>

szacowanie szybkości produkcji wirusów w systemach wodnych

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Wirusy są powszechnymi składnikami systemów morskich i słodkowodnych i wiadomo, że stanowią istotne czynniki śmiertelności drobnoustrojów. Opracowanie ilościowych szacunków tego procesu jest kluczowe, ponieważ pozwala na tworzenie lepszych modeli struktury i funkcji społeczności drobnoustrojów, a także na poszerzenie wiedzy o tym, w jaki sposób wirusy modyfikują wodne cykle biogeochemiczne. Technika redukcji wirusów pozwala badaczom oszacować tempo uwalniania cząstek wirusowych z endemicznej społeczności drobnoustrojów. W skrócie, liczba wolnych (zewnątrzkomórkowych) wirusów w próbce jest redukowana, podczas gdy społeczność drobnoustrojów jest utrzymywana w stężeniu zbliżonym do otoczenia. Następnie społeczność drobnoustrojów jest inkubowana w nieobecności wolnych wirusów, a tempo ponownego pojawiania się wirusów w próbce (poprzez lizę już zainfekowanych członków społeczności) można określić za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub, w przypadku specyficznych wirusów, za pomocą ilościowej PCR. Wartości te mogą być następnie wykorzystane do oszacowania tempa śmiertelności drobnoustrojów wynikającej z indukowanej przez wirusy lizy komórkowej.

Szybkość wymiany wirusów w systemach morskich i słodkowodnych można oszacować za pomocą techniki redukcji i ponownego pojawienia się. Uzyskane dane pozwalają badaczom wywnioskować tempo śmiertelności mikroorganizmów indukowanej przez wirusy w systemach wodnych.

Szacowanie szybkości produkcji wirusów w systemach wodnych

Wirusy są powszechnymi składnikami systemów morskich i słodkowodnych i wiadomo, że stanowią istotne czynniki śmiertelności mikroorganizmów. Opracowanie ilościowych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie szybkości produkcji wirusów w wodnych społecznościach drobnoustrojów. Osiąga się to poprzez wstępną redukcję liczebności wolnych wirusów w badanej próbce, przy jednoczesnym zachowaniu natywnej społeczności mikrobiologicznej. Drugim etapem procedury jest inkubacja próbek w warunkach stymulujących oraz pobieranie podpróbek co dwie do trzech godzin przez okres do 10 godzin.Trzecim krokiem procedury jest wyliczenie liczby wirusów w zebranych podpróbkach z każdego punktu czasowego. Ostatnim krokiem procedury jest określenie szybkości wzrostu liczebności cząsteczek wirusów w próbce oraz wyznaczenie tempa produkcji wirusów. W efekcie, na podstawie przeprowadzonych pomiarów, można uzyskać wyniki wskazujące na tempo produkcji wirusów w obrębie społeczności mikrobowej, co pozwala badaczom wnioskować o tempie śmiertelności mikroorganizmów spowodowanej aktywnością wirusów.Witajcie wszyscy. Nazywam się Audrey Madison i pracuję w laboratorium dr. Stevena Milhama w Departamencie Mikrobiologii na Uniwersytecie Tennessee. Dzisiaj, z pomocą Charlesa Budoffa i Claire Campbell, zaprezentujemy procedurę analizy tempa produkcji wirusów w systemach wodnych.Aby to osiągnąć, zmniejszamy liczbę wolnych wirusów w próbkach i wyliczamy tempo, w jakim pojawiają się one ponownie w wyniku lizy zakażonych wirusem mikroorganizmów. Obecnie stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania ekologii wirusów oraz tego, w jaki sposób mogą one kształtować społeczności drobnoustrojów. Po tym wstępie możemy przejść do rozpoczęcia pracy.Przed rozpoczęciem tej procedury należy zebrać około 20 litrów wody morskiej w sposób jak najbardziej aseptyczny. Po pobraniu próbki wodę należy przefiltrować wstępnie przez filtr o średnicy 142 mm i wielkości porów 0,8 µm. W przypadku systemów o wysokiej produktywności biologicznej można poprzedzić ten etap filtracją przez filtr o większej wielkości porów lub filtr z włókna szklanego.Aby uzyskać wodę ultrafiltrowaną, należy przygotować system ultrafiltracji, taki jak system AmCon M 12 z kartridżem z membraną spiralną w celu usunięcia wszystkich wirusów. Wirusy w próbce są następnie usuwane i zagęszczane przy prędkości wynoszącej około 25% prędkości maksymalnej i ciśnieniu wstecznym od 15 do 16 kPa. Retentat, o objętości około 500 ml, zawiera obecnie skoncentrowaną populację wirusów, którą można zachować do innych badań, podczas gdy wolny od wirusów permeat zostanie wykorzystany do testów produkcji wirusowej.Po każdym dniu użytkowania należy wyczyścić system Omicron M 12, aby zapobiec uszkodzeniu membrany wkładu filtra. Podczas pracy z wodą morską membranę należy przepłukać co najmniej sześcioma litrami wody Milli Q, a następnie przemyć 0,1 M roztworem wodorotlenku sodu przez 30 do 45 minut. Następnie wkład należy przepłukać kolejnymi co najmniej sześcioma litrami wody Milli Q.Po zakończeniu prac kartridż spiralny można przechowywać w 0,05 molarnym roztworze kwasu fosforowego w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby rozpocząć metodę redukcji wirusów, 500 mililitrów próbki wody morskiej z tej samej lokalizacji, z której pobrano wodę wolną od wirusów, umieszcza się w jednostce filtracji sterylnej z filtrem o niskim wiązaniu białek i nominalnej wielkości porów 0,2 mikrona. W tym momencie należy również pobrać podpróbkę w celu określenia całkowitej liczby wirusów i bakterii w wodzie wyjściowej.Ostrożnie poddaj próbkę podciśnieniu poniżej 200 mmHg, stale resuspendując ją za pomocą sterylnej pipety transferowej, aby zapobiec koncentracji komórek bakteryjnych na filtrze. Następnie powoli dodaj do zawiesiny bakteryjnej trzy objętości (łącznie 500 mL) ultrafiltratu, aby zmniejszyć liczbę wolnych wirusów w próbce, utrzymując jednocześnie stałą gęstość populacji bakterii. Na koniec rozcieńcz frakcję bakteryjną z powrotem do objętości 500 mL, używając ultrafiltrowanej wody wolnej od wirusów. Następnie podziel ją na trzy powtórzenia po 150 mL i umieść je w przezroczystych butelkach z poliwęglanu o pojemności 250 mL.Stanowi to zestaw próbek z punktu czasowego zero. Pobierz próbki do szacowania liczebności bakterii i wirusów z próbek z punktu czasowego zero. Przenieś próbki do probówek kriogenicznych z końcowym stężeniem od 2.0 do 2.5% sterylnego glutaraldehydu.W celu utrwalenia próbek należy je bezzwłocznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia. Alternatywnie do zagęszczania drobnoustrojów morskich można zastosować system filtracji stycznej (TFF). Aby skorzystać z metody TFF, należy pobrać około 500 ml próbki naturalnej.Skoncentrować tę próbkę, używając systemu filtracji stycznej o nominalnej wielkości porów 0,2 mikrona, aż frakcja bakteryjna zostanie zredukowana do około 10 do 15 ml w wodzie ultrafiltrowanej, wolnej od wirusów, zgodnie z opisem metody redukcji wirusów; uzyskane butelki z powtórzeniami inkubować w warunkach in situ. W komorach środowiskowych w morzu stosujemy inkubatory z przepływem wody morskiej podłączone do dopływu wody powierzchniowej, która utrzymuje temperaturę otoczenia. Poziomy oświetlenia można dostosować do warunków powierzchniowych, stosując niebieski akryl lub siatkę o neutralnej gęstości w celu zmniejszenia natężenia światła.Podczas pracy w stacji terenowej lub laboratorium, a także w sytuacjach, gdy woda morska nie jest dostępna w przepływie, można zastosować inkubator wzrostowy z oświetleniem. Należy kontynuować pobieranie podpróbek co 2,5 godziny przez co najmniej 10 godzin, stosując metodę wykonaną dla próbki w czasie zero. Oprócz próbek do mikroskopii, niektórzy badacze będą chcieli pobrać wodę do ilościowej analizy qPCR w kierunku specyficznych wirusów.W przypadku próbek do QPCR, należy dodać pięć mililitrów próbki do probówki kriogenicznej bez środka utrwalającego i natychmiast zamrozić w ciekłym azocie w ciekłym azocie w celu przygotowania do mikroskopii produkcji wirusowej; zamrożone próbki należy rozmrozić na lodzie i przygotować świeże roztwory zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Następnie należy umieścić filtr dyskowy o rozmiarze porów 0,02 mikrona i średnicy 25 milimetrów na filtrze wspierającym z celulozy o rozmiarze porów 0,45 mikrona. Następnie należy dodać 850 µL utrwalonej próbki na górną część filtra anadi i poddać próżni przy ciśnieniu poniżej 20 kPa aż do całkowitego wyschnięcia.Po wyschnięciu filtra z dyskiem anody, pipetuj 100 µL roboczego roztworu Cyber Green do sterylnej szalki Petriego. Przy wciąż włączonej pompie próżniowej ostrożnie wyjmij dysk anody z wieży filtracyjnej i umieść go w roztworze Cyber Green. Inkubuj próbki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 minut.Ostrożnie wyjmij filtr z roztworu cyber green i osusz jego tylną stronę za pomocą chusteczki Kim wipe, aby usunąć cały pozostały barwnik. Następnie nanieś małą kroplę roztworu Antifa na szkiełko przedmiotowe i przykryj ją szkiełkiem nakrywką. Zdejmij szkiełko nakrywkowe i umieść wysuszony filtr na szkiełku przedmiotowym.Ponownie dodaj niewielką ilość roztworu Antifa na szkiełko nakrywkowe i powoli umieść je na wierzchu filtra, dbając o usunięcie wszelkich pęcherzyków powietrza, które mogą powstać. Policz wirusy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z szerokopasmowym filtrem niebieskim; policz co najmniej 20 pól widzenia dla każdego filtra, upewniając się, że określasz całkowitą liczbę wirusów z każdej siatki pola, aby zapewnić równomierny rozkład wirusów na membranie filtra. Oblicz średnie tempo powrotu wirusów z trzech niezależnych powtórzeń i wyznacz odchylenie standardowe dla temp produkcji. Na koniec skoryguj te wartości o rozcieńczenie mikroorganizmów z liczebności początkowej do liczebności rozcieńczonej w próbce o zredukowanej zawartości wirusów.Podstawowym zbiorem danych wynikającym z niniejszego badania są wskaźniki powtarzalności liczebności wirusów w podpróbkach z inkubacji. Wyniki te stanowią niezależne regresje liczebności wirusów w funkcji czasu dla każdej z próbek. Produkcja cząstek wirusopodobnych była monitorowana przez 10 godzin inkubacji w warunkach in situ przy użyciu mikroskopii epi-fluorescencyjnej.Próbki te pobrano podczas zakwitu fitoplanktonu u wybrzeży Nowej Zelandii we wrześniu 2008 roku. Przedstawiliśmy właśnie sposób szacowania tempa produkcji wirusów. Obejmuje on zastosowanie różnych systemów ultrafiltracji oraz przeprowadzenie eksperymentów w celu pomiaru tempa produkcji wirusów.Pokazaliśmy również, jak przeprowadzić liczenie tych wirusów za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o używaniu czystego sprzętu, ostrożnym obchodzeniu się z zabarwionymi wirusami, ograniczeniu ekspozycji na światło, szybkim przetwarzaniu próbek oraz właściwym czyszczeniu wkładów do ultrafiltracji po każdym użyciu. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

estimating-virus-production-rates-in-aquatic-systems

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Szacowanie wskaźników produkcji wirusów w systemach wodnych

W celu wytworzenia lentiwirusów wektory DNA są transfekowane do ludzkich komórek 293. Po zbiorze i skoncentrowaniu naddatku miano wirusa jest określane na podstawie ekspresji fluorescencji przy użyciu cytometru przepływowego.

Produkcja lentiwirusa

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

Opisujemy użycie fluorescencyjnego wirusa krowianki reporterowej, który umożliwia pomiar zakaźności wirusa i ekspresji genów w czasie rzeczywistym poprzez specyficzną dla etapu ekspresję spektralnie odrębnych fluoroforów reporterowych. Szczegółowo opisujemy metodę opartą na płytkach do dokładnej identyfikacji etapu, na którym replikacja wirusa jest zaburzona w odpowiedzi na hamowanie małych cząsteczek.

Wirusy reporterowe krowianki do ilościowego określania funkcji wirusa na wszystkich etapach ekspresji genów

Opracowano podejście do identyfikacji optymalnych warunków koncentracji wirusa dla małych objętości próbek wody przy użyciu kolców ludzkiego adenowirusa. Opisane tutaj techniki są wykorzystywane do identyfikacji parametrów stężenia dla innych celów wirusowych i stosowane do eksperymentów z stężeniem wirusa na dużą skalę.

Procedura małej objętości do pomiaru stężenia wirusa z wody

Ten artykuł przedstawia wysokoprzepustową metodę miareczkowania różnych wirusów RNA i DNA opartą na ekspresji lucyferazy przy użyciu automatycznych i ręcznych płynów.

Wysokoprzepustowe miareczkowanie rekombinowanych wirusów eksprymujących lucyferazy

Tutaj prezentujemy protokół do rozmnażania komórek Homalodisca vitripennis i HoCV-1 in vitro. Pożywkę usunięto z kultur dodatnich w stosunku do HoCV-1 i ekstrahowano RNA co 24 godziny przez 168 godzin. Przeżywalność komórek określono ilościowo za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Całe cząsteczki wirusa zostały wyekstrahowane po zakażeniu. Wyekstrahowany RNA oznaczono ilościowo metodą qRT-PCR.

Namnażanie wirusa Homalodisca coagulata-01 za pośrednictwem hodowli komórkowej Homalodisca vitripennis

Metoda EPA 1615 wykorzystuje filtr elektrododatni do koncentracji enterowirusów i norowirusów w środowisku i wodach pitnych. Niniejszy manuskrypt opisuje procedurę pobierania próbek do analiz metodą 1615.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. I. Pobieranie próbek wirusów

Tutaj prezentujemy procedurę pomiaru całkowitej liczby wirusów zdolnych do hodowli za pomocą linii komórkowej nerki Buffalo Green Monkey. Procedura zapewnia ustandaryzowane narzędzie do pomiaru występowania zakaźnych wirusów w środowisku i wodach pitnych.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. II. Całkowity test na obecność wirusa hodowlanego

Stężenie wirusa z próbek wody i ścieków środowiskowych jest trudnym zadaniem, przeprowadzanym głównie w celu identyfikacji i kwantyfikacji wirusów. Chociaż opracowano i przetestowano kilka metod koncentracji wirusów, tutaj wykazujemy skuteczność ultrafiltracji i flokulacji mleka odtłuszczonego dla wirusów RNA z różnymi typami próbek.

Zagęszczenie cząstek wirusa w próbkach wody i ścieków środowiskowych przy użyciu flokulacji mleka odtłuszczonego i ultrafiltracji

Opisany tutaj test TCID50 wykorzystuje bezoznakowe pomiary impedancji w czasie rzeczywistym oraz moduł Virology systemu, aby obiektywnie monitorować efekty cytopatyczne (CPE) wywołane wirusem w czasie rzeczywistym. Ten uprościony test znacznie skraca czas pracy praktycznej, jednocześnie wspierając wysokoprzepustowe, ilościowe pomiary kinetyczne CPE oraz umożliwiając zautomatyzowane, w czasie rzeczywistym obliczenia TCID50.

Uproszczony, bezoznakowy, w czasie rzeczywistym 50% testu zakaźnego hodowli tkanek (TCID50) z impedancją do automatycznego ilościowania miana wirusowego

W tym miejscu opisano metody pobierania próbek ze stref eufotowych ekosystemów morskich i słodkowodnych w celu wyizolowania cyjanofagów (i ich gospodarzy) oraz procesy po pobraniu próbek, które wzbogacają pojedyncze genotypy i charakteryzują dynamikę interakcji wirus-gospodarz.

Pobieranie próbek środowiskowych mikroorganizmów fotosyntetycznych i ich wirusów: od terenu do laboratorium

Poznaj metodę szacowania tempa produkcji wirusa w wodnych wspólnotach mikroorganizmów morskich i słodkowodnych. Technika redukcji i ponownego pojawiania się umożliwia wnioskowanie o śmiertelności mikroorganizmów.

Szacowanie szybkości produkcji wirusów w systemach wodnych

Przeglądaj więcej filmów