Specyficzne znakowanie komórek zakażonych HIV-1 przy użyciu zależnego od Rev wektora lentiwirusego wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego
23 września 2010
Opracowaliśmy wektor lentiwirusem, który oprócz LTR reagującego na Tat posiada element odpowiedzi Rev (RRE), umożliwiający regulację ekspresji genu reporterowego w sposób zależny od Tat i Rev HIV-1. Wektor ten pozwala na specyficzne wykrywanie replikującego się HIV w żywych komórkach poprzez ekspresję GFP.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja komórek z dodatnim wynikiem w kierunku HIV przy użyciu zależnego od rev wektora lentiwirusowego HIV-1 niosącego zielone białko fluorescencyjne. Jest to realizowane poprzez wstępne wytworzenie cząstek lentiwirusowych zależnych od rev za pomocą kotransfekcji. Drugim etapem procedury jest zakażenie ludzkich limfocytów T CD4 wirusem HIV-1.
Następnie ludzkie limfocyty T CD4 dodatnie zakażone HIV poddaje się superinfekcji cząsteczkami lentiwirusowymi niosącymi gen GFP. Ostatnim krokiem jest identyfikacja komórek zakażonych HIV poprzez pomiar liczby komórek GFP-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej. W rezultacie można uzyskać dane określające procent komórek GFP-dodatnich wyznaczony metodą cytometrii przepływowej.
Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię zakażenia HIV, ze względu na fakt, że wektor zależny od rev może również dostarczać i selektywnie eksprimować geny terapeutyczne w komórkach zakażonych HIV, aby indukować śmierć komórek HIV-dodatnich. Procedurę tę zademonstruje gi, adiunkt z naszego laboratorium. Aby wyprodukować lentiwirusowe cząsteczki zależne od rev, komórki HEK 293T są transfektowane trzema plazmidami: zależnym od rev wektorem lentiwirusowym GFP, konstruktem pakującym HIV-1 oraz plazmidem niosącym glikoproteinę VSVG. Na jeden dzień przed transfekcją plazmidami wysiej 2×10⁶ komórek HEK 293T w 10 ml pożywki.
W szalce Petri o średnicy 100 mm hoduj komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Następnego dnia zastąp supernatant komórek 5 mL świeżej pożywki.
Następnie kontynuuj hodowlę komórek przez cztery godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Przed upływem czterogodzinnej inkubacji przygotuj odczynniki do transfekcji. Komórki HEK 293T zostaną poddane transfekcji trzema plazmidami w stosunku: 10 µg lentiwirusowego wektora GFP zależnego od rev, 7,5 µg konstruktu pakującego HIV-1 oraz 2,5 µg glikoproteiny VSVG.
Najpierw wymieszaj trzy plazmidowe DNA w pożądanym stosunku. Następnie przygotuj dwie polistyrenowe probówki o pojemności 5 ml. Do pierwszej i drugiej probówki dodaj po 480 µL dwukrotnego buforu HBS.
Do plazmidowego DNA i buforu do transfekcji dodać 60 µL buforu z CaCl₂ o stężeniu 2 M, aby uzyskać całkowitą objętość 480 µL. Następnie mieszaninę plazmidowego DNA z CaCl₂ dodać kroplami do probówki z 2× HPS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
Stopniowo utworzy się drobny osad. Teraz dodaj kroplami za pomocą pipety wszystkie 960 µL mieszaniny do komórek HEK 2 9 3 T. Inkubuj w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2 przez noc.
Następnego dnia należy usunąć supernatant S i dodać 10 ml świeżej pożywki. Komórki ponownie inkubować w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% carbon dioxide przez noc. Po 48 godzinach od transfekcji zebrać wirusa, usuwając supernatant i przenosząc go do sterylnej probówki o pojemności 50 ml.
Dodaj 10 ml świeżej pożywki do szalki Petriego i kontynuuj inkubację przez noc. Przechowuj nadsącz wirusowy w temperaturze 4 °C. Kontynuuj zbiory w 72 h po transfekcji, zbierając nadsącz i łącząc go z nadsączem zebranym wcześniej.
Następnie odwiruj supernatant S z przyspieszeniem 500 ×g przez 15 minut, aby osadzić i usunąć szczątki komórkowe. Po wirowaniu zbierz supernatant S i przelej go do nowej probówki. Następnie przefiltruj supernatant przez filtr Millipore o rozmiarze porów 0,22 µm.
Wirus zostanie dalej zagęszczony za pomocą kolumny do chromatografii wykluczania cząsteczkowego, co zostanie zaprezentowane w kolejnym kroku w celu stężenia cząsteczek wirusa. Należy nałożyć nadsącz wirusowy na kolumnę do chromatografii wykluczania cząsteczkowego i wirować przy 6,000 ×g w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Należy zebrać zagęszczony nadsącz wirusowy, odstawiając około 100 µL do oznaczenia miana wirusa.
Pozostałą część rozdzielić na alykwouty i przechowywać w temperaturze -80 °C. Wyznaczenie miana wirusa jest jednym z najistotniejszych etapów tej procedury. Do skutecznej infekcji komórek wektorem GFP VIR wymagana jest wysoka wielokrotność infekcji.
W celu uzyskania wartości procentowej komórek pozytywnych pod kątem GFP, wykrywalnej za pomocą cytometrii przepływowej, aby określić miano wirusa, linię komórkową jerk cat pozytywną pod kątem HIV-1 traktowaną TNF zainfekuje się nadsączem wirusowym. Te komórki pozytywne pod kątem HIV-1 są hodowane.
W płytce 96-dołkowej przy zagęszczeniu 2,5 × 10⁵ komórek/ml w całkowitej objętości 100 µL. Przygotować sześć dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych lentiwirionów zależnych od rev do zakażenia komórek dodatnich pod kątem HIV-1; dodać 100 µL każdego rozcieńczenia seryjnego wirusa do każdego dołka z komórkami. Inkubować w inkubatorze z CO2 w temperaturze 37 °C przez siedem dni.
Miano cząsteczek szacuje się poprzez obserwację komórek pozytywnych pod kątem GFP przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Obliczenia przeprowadza się zgodnie z metodą Reida i MU, a miano określa się jako punkt rozcieńczenia, który może skutkować uzyskaniem studzienek pozytywnych pod kątem GFP. W 50% studzienek zainfekowanych w stopniu IV stwierdzono obecność jednej komórki pozytywnej przy użyciu cząsteczek lentiwirusowych zależnych od rev.
Linia ludzkich limfocytów T CD4 zostanie najpierw zainfekowana wirusem HIV-1. Do każdej infekcji wykorzystujemy 2×10⁵ komórek. Dwie godziny przed infekcją.
Dodaj poly brain do komórek do końcowego stężenia 4 µg/mL. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Następnie zainfekuj komórki, wprowadzając roztwór HIV do jednej z probówek o pojemności 5 mL.
Pozostałe dwie probówki z komórkami nie są zainfekowane i będą służyć jako kontrole. Inkubować wszystkie komórki w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Po dwóch godzinach odwirować komórki z prędkością 300 ×g przez 10 minut, usunąć wirusy wolne od komórek poprzez odlanie nadsączu i resuspenderować komórki w świeżej pożywce w stężeniu 2 × 10⁵ komórek/ml; inkubować hodowlę w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.
Po 48 godzinach komórki zakażone HIV są gotowe do infekcji. W przypadku cząsteczek lentiwirusowych zależnych od białka rev, do infekcji należy użyć 2 × 10⁵ komórek, dodając 100 µL cząsteczek lentiwirusowych do komórek zakażonych HIV V1. Jako kontrolę, ludzkie komórki T CD4 niezakażone HIV V1 są również infekowane 100 µL cząsteczek lentiwirusowych. Komórki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez noc, a następnie kontynuować procedurę następnego dnia.
Zużyte pożywkę należy zastąpić świeżą i resuspenderć komórki do stężenia 2 × 10⁵ komórek/ml. 48 godzin po infekcji komórki należy osadzić w wirówce, a następnie resuspenderć w 500 µL 1% paraformaldehydu i przenieść do probówki do cytometrii przepływowej w celu przeprowadzenia analizy. Po 20-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej komórki można analizować na analizatorze FACS pod kątem pozytywności na GFP.
Jeśli eksperymenty zostaną przeprowadzone pomyślnie, zależny od procesu odwrotnej transkrypcji wektor lentiwirusowy V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A umożliwi wysoce specyficzną detekcję replikującego się HIV w żywych populacjach komórek poprzez pomiar ekspresji zielonego białka fluorescencyjnego GFP. W tym przykładzie zebrane komórki C-E-M-S-S barwiono szczurzym przeciwciałem monoklonalnym przeciwko mysiej CD 24 HSA znakowanym PE, a następnie analizowano za pomocą cytometru przepływowego pod kątem ekspresji zarówno HSA, jak i GFP, co przedstawiono tutaj. Znaczną populację GFP wykryto w komórkach zakażonych HIV 1, które zostały dodatkowo zainfekowane wektorem V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A.
W przeciwieństwie do powyższego, komórek pozytywnych pod kątem GFP nie wykryto ani w niezakażonych HIV-1 komórkach C-E-M-S-S bez superinfekcji lentiwirusowej, ani w niezakażonych HIV-1 komórkach z superinfekcją lentiwirusową. Należy pamiętać, że praca z HIV może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak odpowiednie poziomy biosafety oraz właściwe praktyki laboratoryjne.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nowy wektor lentiwirusowy zaprojektowany do wykrywania komórek HIV-dodatnich poprzez ekspresję GFP w sposób zależny od Tat i Rev wirusa HIV-1. Metoda ta umożliwia identyfikację replikującego się HIV w żywych komórkach, co ma istotne znaczenie dla zastosowań terapeutycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Wirusologia
- Terapia genowa
Wstęp
- Zakażenie HIV pozostaje poważnym globalnym problemem zdrowotnym.
- Obecne metody wykrywania komórek HIV-dodatnich są ograniczone.
- Wektory lentiwirusowe mogą być modyfikowane w celu specyficznej ekspresji genów.
- Element odpowiedzi Rev (RRE) zwiększa swoistość detekcji.
Cel badania
- Opracowanie wektora lentiwirusowego umożliwiającego wykrywanie komórek HIV-dodatnich.
- Wykorzystanie ekspresji GFP jako markera do identyfikacji zainfekowanych komórek.
- Zbadanie potencjału terapeutycznego wektora w leczeniu HIV.
Zastosowane metody
- Kotransfekcja komórek HEK 293T w celu produkcji cząstek lentiwirusowych.
- Infekcja ludzkich limfocytów T CD4 wirusem HIV-1, a następnie superinfekcja wektorem lentiwirusowym.
- Cytometria przepływowa w celu pomiaru liczby komórek GFP-dodatnich.
- Oznaczenie miana wirusa poprzez rozcieńczenia seryjne i obserwację GFP.
Główne wyniki
- Skuteczna produkcja cząstek lentiwirusowych zależnych od białka Rev.
- Identyfikacja komórek HIV-dodatnich poprzez ekspresję GFP.
- Wyniki cytometrii przepływowej wskazały na mierzalny odsetek zainfekowanych komórek.
- Wektor wykazał potencjał w dostarczaniu genów terapeutycznych.
Wnioski
- Opracowany wektor lentiwirusa jest skuteczny w wykrywaniu komórek HIV-dodatnich.
- Metoda ta może usprawnić strategie terapeutyczne w zwalczaniu zakażenia HIV.
- Przyszłe badania mogą skupić się na optymalizacji wektora pod kątem zastosowań w terapii genowej.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia wysoce specyficzną detekcję replikującego się HIV w żywych populacjach komórek, rozwiązując kluczowy problem w walidacji celów przeciwwirusowych, w której niespecyficzna aktywność reportera utrudnia interpretację mechanistyczną. Dzięki powiązaniu ekspresji GFP z zależnością od białek Tat oraz Rev, wektor redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich wynikających ze stanów aktywacji komórkowej, co zwiększa pewność predykcyjną w badaniach przesiewowych wczesnych etapów terapii HIV. Podejście to wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego, zapewniając mierzalny odczyt oparty na fluorescencji do oceny wpływu związków na cykle replikacji wirusa.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie specyficznej dla HIV regulacji transkrypcyjnej i potranskrypcyjnej poprzez podwójną ekspresję reporterową zależną od Tat/Rev.
- Wartość operacyjna: Redukuje szum tła pochodzący z wektorów zawierających wyłącznie LTR, zwiększając swoistość testu w kampaniach walidacji celów.
- Wartość prognostyczna: Wspiera priorytetyzację związków, które zaburzają zależny od Rev eksport lub późne etapy replikacji wirusa.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Zapewnia ilościowy odczyt kompatybilny z cytometrią przepływową do pomiaru komórek GFP-dodatnich jako wskaźnika replikującego się HIV.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzowane, powtarzalne procedury infekcji i superinfekcji w modelach limfocytów T CD4+.
- Skalowalność: Wyznaczanie miana wirusa poprzez rozcieńczenia seryjne umożliwia normalizację testu na płytkach screeningowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy wczesną detekcję komórek HIV-dodatnich z późniejszym dostarczaniem genów terapeutycznych w ramach tego samego systemu wektorowego.
- Ograniczanie ryzyka mechanistycznego: Pozwala ocenić, czy związki kandydackie redukują sygnał GFP poprzez hamowanie replikacji, a nie w wyniku cytotoksyczności.
- System istotny dla przebiegu choroby: Wykorzystuje superinfekowane ludzkie limfocyty T CD4+ do modelowania fizjologicznie istotnych kontekstów replikacji HIV.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, gdzie specyficzna detekcja replikującego się wirusa dostarcza informacji dla badań nad mechanizmem działania i wspiera decyzje o kontynuowaniu lub przerwaniu prac w oparciu o redukcję sygnału GFP.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących interakcji HIV z czynnikami gospodarza oraz funkcji genów wirusowych poprzez regulowaną ekspresję raportera.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów dzięki mierzalnej ekspresji GFP, którą można wykryć za pomocą cytometrii przepływowej po superinfekcji.
- Analityka: Generuje odczyty procentowe komórek GFP-dodatnich, co pozwala na porównanie różnych warunków traktowania i mian wirusa.
- Badania translacyjne: Łączy zdolność detekcji z potencjałem terapeutycznym poprzez dostarczanie genów efektorowych za pomocą tego samego wektora.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Platformę można dostosować do innych wirusów RNA poprzez wymianę elementów regulacyjnych przy zachowaniu projektu o podwójnej zależności.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez odróżnienie prawdziwych sygnałów zależnych od HIV od artefaktów aktywacji komórkowej.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przebieg detekcji z wykorzystaniem produkcji lentiwirusów, miareczkowania oraz odczytu metodą cytometrii przepływowej.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez redukcję liczby fałszywie dodatnich wyników w kaskadach przesiewowych leków przeciwwirusowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektów w oparciu o analizę ryzyka i mierzalną redukcję sygnału wirusa replikującego się.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w produkcji wektorów lentiwirusowych, znajomości protokołów bezpieczeństwa biologicznego dotyczących HIV oraz obsługi cytometru przepływowego.
- Zależy od dostępu do komórek HEK 293T do pakowania wirusa oraz modeli ludzkich limfocytów T CD4+ do infekcji.
- Wymaga standaryzacji czasu superinfekcji oraz kwantyfikacji miana wirusa pomiędzy laboratoriami.
- Adaptacja do komórek pierwotnych lub alternatywnych modeli może wymagać optymalizacji wydajności infekcji i aktywności promotora.
- Ograniczenie praktyczne: sygnał zależy od aktywnej ekspresji Rev, co może nie pozwolić na uchwycenie etapów latentnych lub wczesnych etapów po integracji.
