Name: Specyficzne znakowanie komórek HIV-1 dodatnich przy użyciu zależnego od Rev wektora lentiwirusowego wyrażającego białko zielonej fluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Poznaj metodę specyficznego znakowania komórek HIV-1 dodatnich przy użyciu wektora lentiwirusowego zależnego od Rev wyrażającego GFP. Technika ta umożliwia identyfikację zakażonych komórek poprzez cytometrię przepływową i ma zastosowanie w terapii genowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była częściowo finansowana z grantu Public Health Service 1R01AI081568 z NIAID dla Y. W. oraz dzięki hojnym darowiznom darczyńców i uczestników rajdu 2009 NYCDC AIDS Ride zorganizowanego przez M. Rosen i Day2 Inc.

1. Transfekcja plazmidów w celu produkcji cząstek lentiwirusowych zależnych od białka Rev
Przygotowanie: Zależny od Rev lentiwirusek wektor GFP, pNL-GFP-RRE-SA, został opisany wcześniej4,5,6. W celu montażu w cząstkę wirusową, plazmid został współtransfekowany do komórek HEK293 T wraz z konstruktem pakującym HIV-1, pCMVΔ8.2 (uprzejmie udostępnionym przez dr. Didera Trono), oraz plazmidem niosącym glikoproteinę VSV-G (pHCMV-G). Transfekcję przeprowadzono metodą fosforanu wapnia.
Przygotowanie buforów: 10 X HBS (Hepes Buffered Saline) przygotowano poprzez rozpuszczenie 5 g Hepes, 8 g NaCl, 0,37 g KCl, 1 g dekstrozy oraz 0,103 g Na2HPO4 (bezwodnego) w 100 mL H2O. Bufor 10 X HBS należy podzielić na alykwoyty po 1 mL i przechowywać w temperaturze -20°C. W momencie transfekcji należy rozcieńczyć 10 X HBS do 2 X HBS za pomocą H2O (rozcieńczenie 1:5) i dostosować pH do wartości między 7,05 a 7,12 (dla 10 mL 2 X HBS zazwyczaj wymagane jest około 50 μL 1M NaOH). Bufor 2X HBS należy wysterylizować przez filtrację przez filtr Millipore 0,22 μM. Bufor CaCl2 przygotowano poprzez rozpuszczenie CaCl2 w 10 mM Hepes do stężenia końcowego 2M. Należy dostosować pH do wartości 5,8, wysterylizować bufor przez filtrację i przechowywać w temperaturze 4°C.
Procedura:
<ol>
	<li>Na jeden dzień przed transfekcją wysiać 2 x 106 komórek HEK293T do szalki Petriego o średnicy 100 mm i hodować komórki przez noc w 10 mL DMEM + 10% FBS w temperaturze 37°C, 5% CO2.</li>
	<li>Następnego dnia usunąć nadosad z komórek i zastąpić go 5 mL świeżego DMEM + 10% FBS, a następnie kontynuować hodowlę komórek przez 4 godziny.</li>
	<li>Do polistyrenowej probówki o pojemności 5 mL dodać 480 μL buforu 2X HBS.</li>
	<li>Do drugiej polistyrenowej probówki o pojemności 5 mL dodać 60 μL buforu 2M CaCl2, plazmidowe DNA oraz bufor TE do transfekcji (1 mM Tris, 25 mM EDTA, pH 8.0) do uzyskania całkowitej objętości 480 μL. Dla każdej szalki Petriego plazmidy należy dodać w proporcjach: 10 μg pNL-GFP-RRE-SA, 7,5 μg pCMVΔR8.3 i 2,5 mg pHCMV-G.</li>
	<li>Mieszaninę plazmidowego DNA i CaCl2 dodawać kroplami do probówki z 2X HBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Powstanie drobny osad.</li>
	<li>Za pomocą pipety dodać kroplami 960 μL mieszaniny do komórek. Inkubować w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia usunąć nadosad i dodać 10 mL świeżego DMEM + 10% FBS, a następnie kontynuować inkubację komórek w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez noc.</li>
	<li>W 48 godzinach po transfekcji zebrać wirusa poprzez usunięcie nadosadu i przeniesienie go do sterylnych probówek o pojemności 50 mL. Do każdej szalki Petriego dodać 10 mL świeżego DMEM + 10% FBS i kontynuować hodowlę przez noc. Nadosad zawierający wirusa przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Kontynuować zbiór w 72 godzinach po transfekcji poprzez pobranie nadosadu. Połączyć wszystkie nadosady i wirować w 500 x g przez 15 minut w celu osadzenia i usunięcia resztek komórkowych.</li>
	<li>Nadosady zebrano i przefiltrowano przez filtr Millipore 0,22 μM. Wirus został następnie skoncentrowany przy użyciu kolumn do chromatografii wykluczania.</li>
</ol>
2. Zagęszczenie cząsteczek wirusa i oznaczenie miana wirusa
<ol>
	<li>Cząsteczki wirusa skoncentrowano za pomocą kolumny do chromatografii wykluczania cząsteczkowego (próg odcięcia 100 000 MW, Centricoin). Nadosad wirusowy naniesiono na kolumnę, a następnie wirówkowano przy 6 000 x g w temperaturze 4°C przez 15 minut.</li>
	<li>Skoncentrowany nadosad wirusowy zebrano, podzielono na aلیکwoty i przechowywano w temperaturze -80°C.</li>
	<li>Miano wirusa określono poprzez zakażenie linii komórkowej Jacket J1.1, pozytywnej pod kątem HIV-1 i traktowanej TNF. Komórki hodowano na płytce 96-dołkowej w zagęszczeniu 2,5 x 105 komórek na mL (całkowita objętość 100 mL) i zakażano 100 mL seryjnie rozcieńczonego vNL-GFP-RRE-SA przez tydzień. Miano (TCID50) cząsteczek oszacowano poprzez zliczenie dołków pozytywnych pod kątem GFP zgodnie z metodą Reeda i Muencha.</li>
</ol>
3. Znakowanie komórek dodatnich pod kątem HIV-1 za pomocą cząsteczki lentiwirusowej vNL-GFP-RRE-SA
Przygotowanie: linię ludzkich limfocytów T CD4, CEM-SS, najpierw zainfekowano HIV-1. Po 48 godzinach od infekcji komórki poddano superinfekcji cząsteczkami lentiwirusowymi vNL-GFP-RRE-SA. Po kolejnych dwóch dniach superinfekcji komórki GFP-dodatnie przeanalizowano metodą cytometrii przepływowej. W ramach kontroli komórki CEM-SS niezainfekowane HIV-1 zainfekowano w identyczny sposób za pomocą vNL-GFP-RRE-SA. Tylko zainfekowane HIV-1 komórki CEM-SS dały początek komórkom GFP-dodatnim, natomiast nie zaobserwowano tego w przypadku komórek CEM-SS niezainfekowanych HIV-1.
Procedura:
<ol>
	<li>Na dwie godziny przed infekcją dodać polybrane do stężenia końcowego 4 mg / mL. Policzyć komórki i odmierzyć 2 x 105 komórek na każdą infekcję. Zainfekować komórki dawką 200 ng (p24) HIV-1NL4-3 przez 2 godziny.</li>
	<li>Po przemyciu komórek w wirówce przy 300 x g przez 10 minut, resuspendować komórki do stężenia 2 x 105 komórek / mL i inkubować w temperaturze 37°C przez 48 godzin.</li>
	<li>Policzyć komórki i odmierzyć 2 x 105 komórek na każdą infekcję vNL-GFP-RRE-SA. Dodać 100 mL vNL-GFP-RRE-SA i inkubować w temperaturze 37°C przez noc. Przemyć komórki i resuspendować do stężenia 2 x 105 komórek / mL.</li>
	<li>Przeprowadzić analizę cytometrii przepływowej 48 godzin po superinfekcji. Zainfekowane komórki odwirować i resuspendować w 500 mL 1% paraformaldehydu, inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie przeanalizować na analizatorze FACScan (Becton Dickenson).</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Jeśli eksperymenty zostaną przeprowadzone pomyślnie, w zakażonych HIV-1 komórkach CEM-SS za pomocą cytometru przepływowego zostanie wykryta znaczna populacja GFP, natomiast w kontroli komórki dodatnie pod kątem GFP nie zostaną wykryte w niezakażonych HIV-1 komórkach CEM-SS.
Jeśli eksperymenty zostaną przeprowadzone pomyślnie, lentiwirusem wektor zależny od białka Rev, vNL-GFP-RRE-SA, umożliwi on wysoce specyficzne wykrywanie replikującego się HIV w żywych populacjach komórek poprzez pomiar ekspresji zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). W tym przykładzie zebrane komórki CEM-SS zabarwiono znakowanym PE szczurzym przeciwciałem monoklonalnym przeciwko mysiemu CD24, HSA, a następnie przeanalizowano za pomocą cytometru przepływowego pod kątem ekspresji HSA oraz GFP.
<img src="/files/ftp_upload/2198/2198fig1.jpg" alt="Wykresy cytometrii przepływowej; analiza ekspresji GFP i HSA; wykazano wpływ HIV-1; wynik ekspresji 18,9%." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Jak pokazano tutaj, w komórkach zakażonych HIV-1, które poddano superinfekcji vNL-GFP-RRE-SA, wykryto znaczną populację GFP (Rysunek 1c). W przeciwieństwie do tego, komórek dodatnich pod kątem GFP nie wykryto ani w komórkach CEM-SS niezakażonych HIV-1 bez superinfekcji lentiwirusem (Rysunek 1a), ani w komórkach niezakażonych HIV-1 z superinfekcją lentiwirusem (Rysunek 1b).

<ol><li>Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+cellular+proteins+involved+in+the+transcriptional+regulation+of+the+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus.</a> EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).</li>
<li>Merzouki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+gp120%2F160+expressing+cells+upregulate+HIV-1+LTR+directed+gene+expression+in+a+cell+line+transfected+with+HIV-1+LTR-reporter+gene+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%22%5BJournal%5D)">HIV-1 gp120/160 expressing cells upregulate HIV-1 LTR directed gene expression in a cell line transfected with HIV-1 LTR-reporter gene constructs.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand. 41, 445-452 (1995).</li>
<li>Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+reporter+cell+line+for+HIV-1+tat+activity%2C+HIV-1+inhibitors%2C+and+T+cell+activation+effects%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).</li>
<li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-dependent+lentiviral+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Rev-dependent lentiviral expression vector.</a> Retrovirology. 4, 12-12 (2007).</li>
<li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-dependent+indicator+T+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Current+HIV+Research%22%5BJournal%5D)">Rev-dependent indicator T cell line.</a> Current HIV Research. 5, 395-403 (2007).</li>
<li>Young, J., Tang, Z., Yu, Q., Yu, D., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+killing+of+HIV-1-positive+macrophages+and+T+Cells+by+the+Rev-dependent+lentivirus+carrying+anthrolysin+O+from+Bacillus+anthracis%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Selective killing of HIV-1-positive macrophages and T Cells by the Rev-dependent lentivirus carrying anthrolysin O from Bacillus anthracis.</a> Retrovirology. 5, 36-36 (2008).</li>
<li>Perez, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HIV-1-infected+T+cell+clone+defective+in+IL-2+production+and+Ca2%2B+mobilization+after+CD3+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">An HIV-1-infected T cell clone defective in IL-2 production and Ca2+ mobilization after CD3 stimulation.</a> Journal of Immunology. 147, 3145-3148 (1991).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Podobnie jak w przypadku wcześniej opracowanych wektorów ekspresyjnych zależnych od Tat, opisany tutaj system Rev jest wykorzystaniem ewolucyjnego procesu HIV. Wprowadzenie zależności od Rev sprawia, że oparty na LTR wektor ekspresyjny jest silnie zależny od obecności replikującego się HIV. Zastosowanie tego wektora, opisane tutaj jako zależny od HIV wirus reporterowy, oferuje nowatorskie podejście do identyfikacji komórek HIV-dodatnich. Wektor ten umożliwia badanie żywych komórek, może ekspresować dowolny gen na potrzeby podstawowych lub klinicznych eksperymentów i jako pseudotypowany lentiwirus ma dostęp do większości typów komórek i tkanek.

<table><tbody><tr><td>Dygestorium z laminarnym przepływem powietrza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td></td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Allega&amp;#174;6KR</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;#x00B0;lodówka C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20&amp;#x00B0;lodówka C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> -80&amp;#x00B0;lodówka C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer&amp;#174; AutoT4</td><td></td></tr><tr><td>linia komórkowa HEK293T</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>linia komórkowa CEM-SS</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa Jurkat J1.1</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>21870</td><td></td></tr><tr><td>HI FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10438-018</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1&lt;sub&gt;NL4-3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>przygotowane poprzez transfekcję komórek HeLa sklonowanym prowiralnym DNA</td></tr><tr><td>pNL-GFP-RRE</td><td></td><td></td><td>całkowita delecja wszystkich otwartych ramek odczytu (ORF) HIV z pNL4-3</td></tr><tr><td>pNL-GFP-RRE-SA</td><td></td><td></td><td>Wprowadzenie HIV-1 A5 i D4 do pNL-GFP-RRE</td></tr><tr><td>pCMV&amp;#916;8.2</td><td></td><td></td><td>udostępnione przez dr. Didera Trono</td></tr><tr><td>pHCMV-G</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 x HBS (bufor solny z Hepesem)</td><td>Invitrogen</td><td>11344-041</td><td></td></tr><tr><td>2M CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; bufor</td><td>Invitrogen</td><td>S-013-154-10</td><td></td></tr><tr><td>1% paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>probówki Falcon 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>358206</td><td></td></tr><tr><td>probówki z okrągłym dnem o pojemności 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>0.45&amp;mu;filtr Millipore M</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>0.20&amp;mu;filtr M Millipore</td><td>EMD Millipore</td><td>SLFG85000</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petri 100 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430588</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna do chromatografii wykluczania treści molekularnych (próg odcięcia 100 000 MW)</td><td>Sartorius AG</td><td>VS2041</td><td></td></tr><tr><td>probówka do mrożenia 2 ml</td><td>Axygen Scientific</td><td>SCT-200</td><td></td></tr><tr><td>płytka 96-dołkowa</td><td>BD Biosciences</td><td>353227</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr></tbody></table>

specyficzne znakowanie komórek zakażonych hiv-1 przy użyciu zależnego od rev wektora lentiwirusego wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Większość wektorów ekspresyjnych reagujących na HIV opiera się na promotorze HIV, czyli długiej powtórzonej sekwencji końcowej (LTR). Choć LTR reaguje na wczesne białko HIV, Tat, jest on również podatny na stany aktywacji komórkowej oraz lokalną aktywność chromatyny w miejscu, w którym doszło do integracji. Może to prowadzić do wysokiej aktywności niezależnej od HIV, co ograniczyło użyteczność reporterów opartych na LTR w znakowaniu komórek z dodatnim wynikiem w kierunku HIV 1,2,3. W niniejszej pracy skonstruowaliśmy lentiwirusowy wektor ekspresyjny, który oprócz LTR reagującego na Tat posiada liczne sekwencje DNA HIV, obejmujące element odpowiedzi Rev oraz miejsca splicingowe HIV 4,5,6. Wektor ten włączono do lentiwirusowego wirusa reporterowego, co umożliwiło bardzo specyficzną detekcję replikującego się HIV w żywych populacjach komórek. Aktywność wektora mierzono poprzez ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). Zastosowanie opisanego tutaj wektora stanowi nową, alternatywną metodę w stosunku do istniejących technik, takich jak PCR in situ czy barwienie na antygeny HIV, w celu identyfikacji komórek HIV-dodatnich. Wektor ten może być również wykorzystany do ekspresji genów terapeutycznych w badaniach podstawowych lub klinicznych, aby celować w komórki HIV-dodatnie.

Opracowaliśmy wektor lentiwirusem, który oprócz LTR reagującego na Tat posiada element odpowiedzi Rev (RRE), umożliwiający regulację ekspresji genu reporterowego w sposób zależny od Tat i Rev HIV-1. Wektor ten pozwala na specyficzne wykrywanie replikującego się HIV w żywych komórkach poprzez ekspresję GFP.

Specyficzne znakowanie komórek zakażonych HIV-1 przy użyciu zależnego od Rev wektora lentiwirusego wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego

Większość wektorów ekspresyjnych reagujących na HIV opiera się na promotorze HIV, czyli długiej powtórzonej sekwencji końcowej (LTR). Choć wektory te reagują na wczesne białko HIV, Tat, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja komórek z dodatnim wynikiem w kierunku HIV przy użyciu zależnego od rev wektora lentiwirusowego HIV-1 niosącego zielone białko fluorescencyjne. Jest to realizowane poprzez wstępne wytworzenie cząstek lentiwirusowych zależnych od rev za pomocą kotransfekcji. Drugim etapem procedury jest zakażenie ludzkich limfocytów T CD4 wirusem HIV-1.Następnie ludzkie limfocyty T CD4 dodatnie zakażone HIV poddaje się superinfekcji cząsteczkami lentiwirusowymi niosącymi gen GFP. Ostatnim krokiem jest identyfikacja komórek zakażonych HIV poprzez pomiar liczby komórek GFP-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej. W rezultacie można uzyskać dane określające procent komórek GFP-dodatnich wyznaczony metodą cytometrii przepływowej.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię zakażenia HIV, ze względu na fakt, że wektor zależny od rev może również dostarczać i selektywnie eksprimować geny terapeutyczne w komórkach zakażonych HIV, aby indukować śmierć komórek HIV-dodatnich. Procedurę tę zademonstruje gi, adiunkt z naszego laboratorium. Aby wyprodukować lentiwirusowe cząsteczki zależne od rev, komórki HEK 293T są transfektowane trzema plazmidami: zależnym od rev wektorem lentiwirusowym GFP, konstruktem pakującym HIV-1 oraz plazmidem niosącym glikoproteinę VSVG. Na jeden dzień przed transfekcją plazmidami wysiej 2×10⁶ komórek HEK 293T w 10 ml pożywki.W szalce Petri o średnicy 100 mm hoduj komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Następnego dnia zastąp supernatant komórek 5 mL świeżej pożywki.Następnie kontynuuj hodowlę komórek przez cztery godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Przed upływem czterogodzinnej inkubacji przygotuj odczynniki do transfekcji. Komórki HEK 293T zostaną poddane transfekcji trzema plazmidami w stosunku: 10 µg lentiwirusowego wektora GFP zależnego od rev, 7,5 µg konstruktu pakującego HIV-1 oraz 2,5 µg glikoproteiny VSVG.Najpierw wymieszaj trzy plazmidowe DNA w pożądanym stosunku. Następnie przygotuj dwie polistyrenowe probówki o pojemności 5 ml. Do pierwszej i drugiej probówki dodaj po 480 µL dwukrotnego buforu HBS.Do plazmidowego DNA i buforu do transfekcji dodać 60 µL buforu z CaCl₂ o stężeniu 2 M, aby uzyskać całkowitą objętość 480 µL. Następnie mieszaninę plazmidowego DNA z CaCl₂ dodać kroplami do probówki z 2× HPS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Stopniowo utworzy się drobny osad. Teraz dodaj kroplami za pomocą pipety wszystkie 960 µL mieszaniny do komórek HEK 2 9 3 T. Inkubuj w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2 przez noc.Następnego dnia należy usunąć supernatant S i dodać 10 ml świeżej pożywki. Komórki ponownie inkubować w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% carbon dioxide przez noc. Po 48 godzinach od transfekcji zebrać wirusa, usuwając supernatant i przenosząc go do sterylnej probówki o pojemności 50 ml.Dodaj 10 ml świeżej pożywki do szalki Petriego i kontynuuj inkubację przez noc. Przechowuj nadsącz wirusowy w temperaturze 4 °C. Kontynuuj zbiory w 72 h po transfekcji, zbierając nadsącz i łącząc go z nadsączem zebranym wcześniej.Następnie odwiruj supernatant S z przyspieszeniem 500 ×g przez 15 minut, aby osadzić i usunąć szczątki komórkowe. Po wirowaniu zbierz supernatant S i przelej go do nowej probówki. Następnie przefiltruj supernatant przez filtr Millipore o rozmiarze porów 0,22 µm.Wirus zostanie dalej zagęszczony za pomocą kolumny do chromatografii wykluczania cząsteczkowego, co zostanie zaprezentowane w kolejnym kroku w celu stężenia cząsteczek wirusa. Należy nałożyć nadsącz wirusowy na kolumnę do chromatografii wykluczania cząsteczkowego i wirować przy 6,000 ×g w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Należy zebrać zagęszczony nadsącz wirusowy, odstawiając około 100 µL do oznaczenia miana wirusa.Pozostałą część rozdzielić na alykwouty i przechowywać w temperaturze -80 °C. Wyznaczenie miana wirusa jest jednym z najistotniejszych etapów tej procedury. Do skutecznej infekcji komórek wektorem GFP VIR wymagana jest wysoka wielokrotność infekcji.W celu uzyskania wartości procentowej komórek pozytywnych pod kątem GFP, wykrywalnej za pomocą cytometrii przepływowej, aby określić miano wirusa, linię komórkową jerk cat pozytywną pod kątem HIV-1 traktowaną TNF zainfekuje się nadsączem wirusowym. Te komórki pozytywne pod kątem HIV-1 są hodowane.W płytce 96-dołkowej przy zagęszczeniu 2,5 × 10⁵ komórek/ml w całkowitej objętości 100 µL. Przygotować sześć dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych lentiwirionów zależnych od rev do zakażenia komórek dodatnich pod kątem HIV-1; dodać 100 µL każdego rozcieńczenia seryjnego wirusa do każdego dołka z komórkami. Inkubować w inkubatorze z CO2 w temperaturze 37 °C przez siedem dni.Miano cząsteczek szacuje się poprzez obserwację komórek pozytywnych pod kątem GFP przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Obliczenia przeprowadza się zgodnie z metodą Reida i MU, a miano określa się jako punkt rozcieńczenia, który może skutkować uzyskaniem studzienek pozytywnych pod kątem GFP. W 50% studzienek zainfekowanych w stopniu IV stwierdzono obecność jednej komórki pozytywnej przy użyciu cząsteczek lentiwirusowych zależnych od rev.Linia ludzkich limfocytów T CD4 zostanie najpierw zainfekowana wirusem HIV-1. Do każdej infekcji wykorzystujemy 2×10⁵ komórek. Dwie godziny przed infekcją.Dodaj poly brain do komórek do końcowego stężenia 4 µg/mL. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Następnie zainfekuj komórki, wprowadzając roztwór HIV do jednej z probówek o pojemności 5 mL.Pozostałe dwie probówki z komórkami nie są zainfekowane i będą służyć jako kontrole. Inkubować wszystkie komórki w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Po dwóch godzinach odwirować komórki z prędkością 300 ×g przez 10 minut, usunąć wirusy wolne od komórek poprzez odlanie nadsączu i resuspenderować komórki w świeżej pożywce w stężeniu 2 × 10⁵ komórek/ml; inkubować hodowlę w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.Po 48 godzinach komórki zakażone HIV są gotowe do infekcji. W przypadku cząsteczek lentiwirusowych zależnych od białka rev, do infekcji należy użyć 2 × 10⁵ komórek, dodając 100 µL cząsteczek lentiwirusowych do komórek zakażonych HIV V1. Jako kontrolę, ludzkie komórki T CD4 niezakażone HIV V1 są również infekowane 100 µL cząsteczek lentiwirusowych. Komórki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez noc, a następnie kontynuować procedurę następnego dnia.Zużyte pożywkę należy zastąpić świeżą i resuspenderć komórki do stężenia 2 × 10⁵ komórek/ml. 48 godzin po infekcji komórki należy osadzić w wirówce, a następnie resuspenderć w 500 µL 1% paraformaldehydu i przenieść do probówki do cytometrii przepływowej w celu przeprowadzenia analizy. Po 20-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej komórki można analizować na analizatorze FACS pod kątem pozytywności na GFP.Jeśli eksperymenty zostaną przeprowadzone pomyślnie, zależny od procesu odwrotnej transkrypcji wektor lentiwirusowy V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A umożliwi wysoce specyficzną detekcję replikującego się HIV w żywych populacjach komórek poprzez pomiar ekspresji zielonego białka fluorescencyjnego GFP. W tym przykładzie zebrane komórki C-E-M-S-S barwiono szczurzym przeciwciałem monoklonalnym przeciwko mysiej CD 24 HSA znakowanym PE, a następnie analizowano za pomocą cytometru przepływowego pod kątem ekspresji zarówno HSA, jak i GFP, co przedstawiono tutaj. Znaczną populację GFP wykryto w komórkach zakażonych HIV 1, które zostały dodatkowo zainfekowane wektorem V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A.W przeciwieństwie do powyższego, komórek pozytywnych pod kątem GFP nie wykryto ani w niezakażonych HIV-1 komórkach C-E-M-S-S bez superinfekcji lentiwirusowej, ani w niezakażonych HIV-1 komórkach z superinfekcją lentiwirusową. Należy pamiętać, że praca z HIV może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak odpowiednie poziomy biosafety oraz właściwe praktyki laboratoryjne.

specific-marking-hiv-1-positive-cells-using-rev-dependent-lentiviral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Specyficzne oznaczanie komórek HIV-1 dodatnich za pomocą wirusowego wektora lentivirowego zależnego od Rev, ekspresującego zieloną fluorescencyjną białko

Niniejszy eksperyment w formie wizualizacji jest przewodnikiem po wykorzystaniu fluorescencyjnego klonu molekularnego HIV do eksperymentów z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek.

Wizualizacja transferu HIV między komórkami z wykorzystaniem fluorescencyjnych klonów HIV oraz konfokalnej mikroskopii żywych komórek

Lentiwirusowe wektory ekspresyjne są najskuteczniejszymi nośnikami do stabilnej ekspresji różnych cząsteczek efektorowych lub konstruktów reporterowych w dzielących się i niedzielących się komórkach ssaków oraz w całych organizmach. Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący pakowania lentiwirusowych konstruktów ekspresyjnych w pseudowirusowe cząstki oraz transdukcji komórek docelowych przy użyciu tych cząstek.

Pakowanie konstruktów ekspresyjnych lentiwektorów opartych na HIV lub FIV oraz transdukcja pseudotypowanych cząsteczek wirusowych VSV-G

Opisujemy klon molekularny wirusa maedi-visna, który wykazuje ekspresję GFP i jest w pełni zakaźny. Replikację tego wirusa można wykryć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz cytometrii przepływowej.

Propagowanie i wykrywanie zakaźnego klonu molekularnego wirusa maedi-visna wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego

Opracowano metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu wizualnej detekcji wirusowego RNA genomowego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Przygotowano sondę specyficzną dla wirusowego RNA, która może być następnie identyfikowana za pomocą kombinacji technik hybrydyzacji i immunofluorescencji. Technika ta daje możliwość określenia lokalizacji wirusowego RNA lub DNA w stanie stacjonarnym, dostarczając informacji o kontroli procesów wewnątrzkomórkowego transportu wirusa.

Wykrywanie wirusowego RNA za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH)

W niniejszym protokole opisujemy produkcję, oczyszczanie i miareczkowanie wektorów lentiwirusowych. Przedstawiamy przykład dostarczania genów za pomocą wektora lentiwirusowego do pierwotnych hodowli neuronów i astrocytów. Nasze metody mogą mieć zastosowanie również do innych typów komórek in vitro oraz in vivo.

Produkcja wektorów lentiwirusem do transdukcji komórek ośrodkowego układu nerwowego

Od czasu odkrycia genu białka zielonej fluorescencji, białka fluorescencyjne wpłynęły na biologię molekularną komórki. Protokół ten opisuje, w jaki sposób ekspresja odrębnych białek fluorescencyjnych za pomocą inżynierii genetycznej jest wykorzystywana do kodowania kreskowego poszczególnych komórek. Procedura umożliwia śledzenie odrębnych populacji w mieszaninie komórek, co jest idealne do zastosowań multipleksowanych.

Genetyczne kody kreskowe z białkami fluorescencyjnymi do zastosowań multipleksowych

Opisujemy test oparty na komórkach, który informuje o fuzji HIV-1 poprzez ekspresję białka zielonej fluorescencji wykrywalnego za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej. Może być stosowany do testowania inhibitorów wnikania wirusa (szczególnie na etapie fuzji) w systemach infekcji bezkomórkowych i międzykomórkowych.

Wysokoprzepustowy test fuzji błony wirusowej aktywowanej Cre-Lox w celu identyfikacji inhibitorów fuzji błony wirusowej HIV-1

Protokół o wysokiej przepustowości do oceny funkcjonalnej skutecznej reaktywacji i usuwania utajonych prowirusów HIV jest opisany i stosowany poprzez testowanie wpływu interwencji na transkrypcję i splicing HIV. Przedstawiono reprezentatywne wyniki wpływu czynników odwracających opóźnienia na transkrypcję i splicing sterowany przez LTR.

Wysokoprzepustowa ocena in vitro czynników odwracających opóźnienia w transkrypcji i splicingu HIV

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Pokazujemy krok po kroku protokół badania funkcji genów w makrofagach rezydujących w tkance otrzewnej in vivo, przy użyciu wektorów lentiwirusowych.

Preparat wektora lentiwirusowego do skutecznej modulacji genów i mikroRNA makrofagów rezydujących w tkankach jamy otrzewnej in vivo u myszy

Poznaj metodę specyficznego znakowania komórek HIV-1 dodatnich przy użyciu wektora lentiwirusowego zależnego od Rev wyrażającego GFP. Technika ta umożliwia identyfikację zakażonych komórek poprzez cytometrię przepływową i ma zastosowanie w terapii genowej.

Specyficzne znakowanie komórek HIV-1 dodatnich przy użyciu zależnego od Rev wektora lentiwirusowego wyrażającego białko zielonej fluorescencji (Wideo) | JoVE Journal

Specyficzne znakowanie komórek zakażonych HIV-1 przy użyciu zależnego od Rev wektora lentiwirusego wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego

Przeglądaj więcej filmów