Name: Przygotowanie wysoce sprzężonych mitochondriów serca szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Naucz się izolować wysoce sprzężone mitochondria serca szczura przy użyciu mechanicznej i enzymatycznej homogenizacji oraz różnicowej wirowania. Ta metoda zapewnia wysoką jakość preparatów do badań bioenergetyki komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy prof. A. Vinogradovowi oraz dr Verze Grivennikovej za wprowadzenie autorów w dziedzinę biologii mitochondriów oraz za wiele cennych spostrzeżeń i porad dotyczących tej procedury. Autorzy są wdzięczni pani Amandzie McKintock z biura mediów Queens University za pomoc w przygotowaniu materiału wideo.

Wstęp
Mitochondria z serca szczura stanowią jedną z najczęściej stosowanych preparatów w przeszłych i obecnych badaniach nad metabolizmem komórkowym. Można je szybko i niezawodnie pozyskać w dużych ilościach od zwierząt typu dzikiego lub z nokautem genowym. Ogólna procedura obejmuje trawienie tkanki trypsyną, frakcjonowanie oraz wirowanie różnicowe.
Podczas izolacji mitochondriów z różnych tkanek, w tym z serca, należy zachować szereg określonych warunków (Rys. 1).
<ul>
 <li>Tkankę należy dokładnie rozdrobnić, ponieważ ma to bezpośredni wpływ na wydajność uzyskiwanych mitochondriów. Tkankę serca najlepiej rozdrabniać małymi zakrzywionymi nożyczkami, a następnie użyć homogenizatora Latapie lub, w przypadku braku homogenizatora, praski do czosnku z otworami wylotowymi o średnicy około 1.0 mm.</li>
 <li>Niezbędne jest utrzymanie temperatury roztworów na każdym etapie. Dlatego całą procedurę należy przeprowadzić w pomieszczeniu chłodniczym, a wszystkie instrumenty i roztwory muszą zostać przygotowane i schłodzone z wyprzedzeniem. Jeśli warunki temperaturowe nie zostaną utrzymane na stałym poziomie, może dojść do utraty kilku właściwości preparatu. Struktura mitochondriów jest bardzo wrażliwa na zamrażanie, dlatego dopuszczalne nie jest nadmierne zamrożenie zawiesiny (na przykład podczas wirowania), szczególnie jeśli istotne są badania transportu aktywnego.</li>
 <li>Ważnym parametrem jest czas trwania procedury; izolację należy przeprowadzić jak najszybciej, a otrzymany preparat należy wykorzystać niezwłocznie. W związku z tym instrumenty chirurgiczne, roztwory i urządzenia muszą być przygotowane z wyprzedzeniem.</li>
</ul>
Materiały i instrumenty
Instrumenty
<ol>
 <li>Proste nożyczki operacyjne, ostre końce</li>
 <li>Nożyczki zakrzywione</li>
 <li>Pinceta</li>
 <li>Szalka Petriego</li>
 <li>Mały lejek + kawałek filtra nylonowego (wstępnie przemyty)</li>
 <li>6 zlewków 50 ml</li>
 <li>Dwa mieszadła magnetyczne i dwie łaźnie lodowe</li>
 <li>Jedna duża łaźnia lodowa</li>
 <li>2 małe mieszadełka magnetyczne</li>
 <li>Spatułki do zgarniania osadu</li>
 <li>Probówki do wirowania</li>
 <li>Prasa do tkanek Latapie (można zastąpić praską do czosnku)</li>
 <li>Homogenizatory teflonowo-szklane 20ml i 1-2ml</li>
 <li>Zlewek na odpady</li>
 <li>Probówki Eppendorf do końcowej zawiesiny mitochondrialnej i próbek do oznaczania białka</li>
 <li>Łaźnie lodowe</li>
</ol>
Roztwory (obliczone dla 2 szczurów):
<ol>
 <li>Bufor płuczący: 0,3 M sacharozy, 10 mM HEPES (pH=7,2), 0,2 mM EDTA (1000 ml)</li>
 <li>Bufor izolacyjny: 0,3 M sacharozy, 10 mM HEPES (pH=7,4), 0,2 mM EDTA, 1 mg/ml BSA (Sigma A6003) (100 ml przygotowanych z buforu płuczącego). Albuminę surowicy bydlęcej można zastąpić tańszymi analogami wolnymi od kwasów tłuszczowych. Ten sam bufor lub jego warianty izotoniczne mogą być stosowane jako bufor do resuspensji.</li>
 <li>Roztwór trypsyny (Sigma T8003): 2,5 mg/ml w 1 mM HCl (0,5 ml)</li>
 <li>Inhibitor trypsyny z soi (Sigma T9128): 6,5 mg / 10 ml buforu izolacyjnego</li>
</ol>
Protokół
Ogólny schemat procedury przedstawiono na Rys. 1. Serca należy schłodzić i przemyć buforem do mycia, wyciąć tkankę komór, posiekać i homogenizować podczas obróbki fotolitycznej z trypsyną. Zawiesinę wiruje się z niską prędkością, a otrzymany nadsącz wiruje się ponownie z większą prędkością w celu zebrania mitochondriów. W zależności od planowanych eksperymentów bufor do resuspensji można zastąpić dowolnym innym roztworem izotonicznym.
Zwierzęta uśmiercono zgodnie z brytyjską ustawą „Animals (Scientific Procedures) Act” poprzez zwichnięcie stawów szyjnych, a następnie dekapitację. Serce należy wyciąć natychmiast po dekapitacji zwierzęcia, aby uniknąć opóźnienia między uśmierceniem zwierzęcia a pobraniem narządu. Jeśli planowana jest równoległa izolacja mitochondriów wątrobowych, szczury powinny być głodzone przez noc przed eksperymentem.
<ol>
 <li> Przygotuj trzy zlewki zawierające 40 ml buforu piorącego (Washing Buffer). Chłodź je w łaźni lodowo-solnej przez 3 do 5 min przed przejściem do następnego kroku. Należy uważać, aby ich nie zamrozić zbyt mocno; należy ich użyć natychmiast po pojawieniu się pierwszych kryształków lodu.</li>
 <li> Otwórz klatkę piersiową zdekapitowanego szczura i wyjmij serce. Wykonaj niewielkie nacięcia, a następnie natychmiast przenieś serce do lodowatego roztworu w pierwszej zlewce. Ściśnij serce, aby usunąć krew, i przełóż je do drugiej zlewki. Powtórz tę operację dla każdego serca.</li>
 <li> Osusz serca na papierze filtracyjnym. Usuń cały tłuszcz, skrzepy krwi, uszka i powięzi, a następnie połącz tkankę komór.</li>
 <li> Posiekaj połączoną tkankę małymi zakrzywionymi nożyczkami na szalce Petriego na lodzie przez około 5 min, aż wielkość cząstek wyniesie około 1-2 mm.</li>
 <li> Umieść posiekaną tkankę w prasie do tkanek i przepuść ją przez urządzenie. Należy pamiętać, że znaczna ilość materiału może pozostać w prasie, dlatego należy zebrać całą tkankę serca ze ścianek i dna prasy.</li>
 <li> Przenieś materiał do zlewki z 50 ml buforu piorącego (Washing Buffer) i wymieszaj. Następnie przefiltruj zawiesinę przez filtr nylonowy. Przepłucz posiekaną tkankę na filtrze 3 razy buforem piorącym i odrzuć filtrat.</li>
 <li> Przenieś wypłukaną tkankę do 20 ml buforu piorącego (Washing Buffer) i umieść ją w łaźni lodowej na mieszadle magnetycznym. Dodaj 0,5 ml roztworu trypsyny przy ciągłym mieszaniu i uruchom stoper. Przygotuj drugie mieszadło magnetyczne, łaźnię lodową oraz drugą zlewkę o pojemności 50 ml.</li>
 <li> W 4th minucie krótko homogenizuj zawiesinę partiami, używając małego, luźno dopasowanego homogenizatora szklano-teflonowego (10-15 ml), wykonując kilka ruchów góra-dół w celu rozproszenia zawiesiny. Po homogenizacji przenieś zawiesinę do drugiej zlewki. Powtórz procedurę w 9th minucie, tak aby przeprowadzić homogenizację zawiesiny łącznie dwa razy. Po 15 min inkubacji dodaj 10 ml buforu izolacyjnego zawierającego inhibitor trypsyny i inkubuj przez 1 min.</li>
 <li> Ponownie przefiltruj zawiesinę przez filtr nylonowy i zachowaj filtrat. Zbierz frakcję cząsteczkową pozostałą na filtrze i homogenizuj przez 1 min w 15-20 ml buforu piorącego (Washing Buffer).</li>
 <li> Połącz homogenat z filtratem i wiruj przez 15 min przy 600g.</li>
 <li> Ostrożnie przefiltruj otrzymany nadsącz do nowej probówki wirówkowej. Unikaj zanieczyszczenia osadem i wiruj ponownie przez 15 min przy 8500g.</li>
 <li> Po wirowaniu wysokoobrotowym odrzuć nadsącz i przepłucz osad 2-3 razy 1 ml buforu, usuwając puszystą, białą zewnętrzną warstwę krawędziową. Rozbij osad szpatułką, unikając czerwonej plamki erytrocytów na dnie. Jeśli komórki krwi się poluzowały, usuń czerwone fragmenty z zawiesiny przed homogenizacją.</li>
 <li> Resuspenduj osad za pomocą małego homogenizatora lub alternatywnie poprzez delikatne pipetowanie. Rozcieńcz zawiesinę większą ilością buforu izolacyjnego (Isolationbuffer) i wiruj ponownie przez 15 min przy 8500g.</li>
 <li> Odrzuć nadsącz, resuspenduj osad w buforze resuspendującym (Resuspending Buffer – dowolny wybrany bufor izotoniczny) i wiruj ponownie.</li>
 <li> Otrzymany brązowy osad zawiera wypłukane, nienaruszone mitochondria. Resuspenduj osad w bardzo małej objętości wybranego buforu izotonicznego.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2202/2202fig1.jpg" alt="Proces frakcjonowania komórek; etapy wirowania; schemat eksperymentu biologicznego; oddzielanie osadu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Schemat przedstawiający procedurę izolacji mitochondriów serca szczura krok po kroku. Górna część, etapy 1-9: rozdrabnianie tkanek, traktowanie trypsyną i homogenizacja; dolna część, etapy 10-15: wirowanie różnicowe.

<ol><li>Jacobus, W. E., Saks, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+kinase+of+heart+mitochondria%3A+changes+in+its+kinetic+properties+induced+by+coupling+to+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation.</a> Arch. Biochem. Biophys. 219, 167-178 (1982).</li>
<li>Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., Vinogradov, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+assay+of+the+intramitochondrial+enzymes%3A+use+of+alamethicin+for+permeabilization+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria.</a> Anal. Biochem. 313, 46-52 (2003).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Opisano szczegółowy, szybki protokół izolacji nienaruszonych mitochondriów o wysokim stopniu sprzężenia. Uzyskany preparat może być wykorzystany w badaniach funkcjonalnych lub strukturalnych bioenergetyki komórkowej, w badaniach proteomicznych lub analizie zawartości mtDNA i lipidów. Możliwe jest również przeprowadzenie badań biofizycznych nad aktywnym transportem jonów i produktów pośrednich metabolizmu. Preparat mitochondrialny można poddać dalszej obróbce w celu wyizolowania cząstek submitochondrialnych, błony zewnętrznej lub oczyszczenia poszczególnych komponentów fosforylacji oksydacyjnej. Opisana metoda jest modyfikacją standardowego protokołu izolacji opracowanego przez Jacobusa i Saksa1. Przewidywana wydajność przygotowanych mitochondriów wynosi około 10-15 mg białka mitochondrialnego z jednego serca, a współczynnik kontroli oddechowej na malonianie/glutaminianie takiego preparatu waha się od 8 do 12, przy oddychaniu w stanie IV na poziomie około 0.12 μmol O2xmin-1xmg protein-1 w temperaturze 23°C w medium zawierającym 0.25 M sacharozy, 10 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 5 mM fosforanu potasu (pH 8.0) z dodatkiem 150 μM ADP w celu zainicjowania oddychania w stanie III (dokładne warunki eksperymentalne i dodatki opisano w ref. 2).
Przed rozpoczęciem procedury izolacji należy zwrócić szczególną uwagę na kilka szczegółów technicznych. Kluczowe jest użycie czystych probówek wirówkowych z poliwęglanu lub polipropylenu; probówki powinny być zatem dokładnie umyte czystą szczoteczką i gorącą wodą, przy czym należy ograniczyć stosowanie detergentów do minimum. Wskazane jest również zgromadzenie całego niezbędnego szkła i instrumentów w pomieszczeniu chłodniczym dzień przed izolacją.
Podczas izolacji, przy przenoszeniu buforów z kolb do zlewów, należy zwrócić szczególną uwagę, aby do roztworów nie dostały się krople wody z lodu. Przy pracy z tkankami należy podkreślić, że ekstrakcję serca należy przeprowadzić jak najszybciej, ponieważ nawet krótkie opóźnienie między dekapitacją zwierzęcia a schłodzeniem tkanki spowodowałoby częściowe rozprzężenie mitochondriów. Szybkie schłodzenie i dokładne przemycie wyjętych serc jest niezbędne do uzyskania standardowego preparatu, wolnego od hemoglobiny i erytrocytowej NADazy.
Trypsynę stosuje się do degradacji białek łącznych, aby zwiększyć podatność tkanki na siły ścinające podczas homogenizacji. Należy unikać przedłużonej ekspozycji tkanki na proteazę, ponieważ prowadzi to do uzyskania mitochondriów gorszej jakości.
Po wirowaniu przy wysokich prędkościach ścianki probówek do wirowarki należy przetrzeć ręcznikiem papierowym, aby usunąć wszelkie osady tłuszczu nagromadzone na ściankach.
Do końcowego resuspensowania zaleca się użycie małej objętości buforu końcowego, aby zminimalizować utratę funkcji mitochondriów podczas przechowywania (150 do 200 μl buforu na serce). W badaniach nad transportem kationów dwuwartościowych w końcowym preparacie nie mogą znajdować się żadne środki chelatujące, dlatego mitochondria należy kilkukrotnie przemyć medium wolnym od EGTA i wykorzystać w ciągu pierwszych godzin po izolacji.

przygotowanie silnie sprzężonych mitochondriów serca szczura

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

Rola mitochondriów w generowaniu komórkowego ATP w procesie fosforylacji oksydacyjnej jest powszechnie znana. W ciągu ostatnich dekad nastąpił znaczący postęp w zrozumieniu funkcji mitochondriów wykraczających poza wytwarzanie energii. Obejmuje to ich rolę w apoptozie, działanie jako organelle sygnalizacyjne, udział w rozwoju i starzeniu się ssaków, a także wkład w koordynację między metabolizmem a proliferacją komórek. Nasza wiedza na temat procesów biologicznych modulowanych przez mitochondria opiera się na solidnych metodach izolacji i preparatyki nienaruszonych mitochondriów z tkanek zwierząt laboratoryjnych. Mitochondria z serca szczura stanowią jedną z najczęściej stosowanych preparacji w dawnych i obecnych badaniach nad metabolizmem komórkowym, w tym w badaniach nad zwierzętami z knockoutem.
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy szczegółową, szybką metodę izolacji nienaruszonych mitochondriów o wysokim stopniu sprzężenia. Tak przygotowane mitochondria serca szczura stanowią doskonały obiekt do badań funkcjonalnych i strukturalnych nad bioenergetyką komórkową, transportem biomolekuł, badań proteomicznych oraz analizy mitochondrialnego DNA, białek i lipidów.

Opisujemy protokół izolacji czystych, silnie sprzężonych mitochondriów serca szczura do funkcjonalnych lub strukturalnych badań bioenergetyki komórkowej, pomiarów biofizycznych, proteomiki oraz analizy mitochondrialnego DNA i lipidów.

Przygotowanie silnie sprzężonych mitochondriów serca szczura

Rola mitochondriów w generowaniu komórkowego ATP w procesie fosforylacji oksydacyjnej jest powszechnie znana. W ciągu ostatnich kilku dekad...

Jestem dr Ska. Dzisiaj pokażę Państwu, jak izolować mitochondria z serca szczura. Kluczowe etapy izolacji mitochondriów z tkanek to przede wszystkim rozbicie tkanki i komórek poprzez obróbkę mechaniczną lub enzymatyczną.Po drugie, przeprowadzono wirowanie różnicowe z niską prędkością w celu usunięcia resztek komórkowych, uszkodzonych komórek oraz jąder. Po trzecie, zastosowano wirowanie z wyższą prędkością w celu wyizolowania mitochondriów. Instrumenty i roztwory zostały przygotowane i przechowywane wcześniej w pomieszczeniu chłodniczym.Podczas izolacji mitochondriów należy zachować kilka warunków. Po pierwsze, niezbędne jest dokładne rozbicie tkanki, ponieważ bezpośrednio wpływa ono na wydajność uzyskiwania mitochondriów. Po drugie, podczas wszystkich etapów należy utrzymywać niską temperaturę, uważając jednak, aby nie doprowadzić do nadmiernego zamrożenia roztworów, szczególnie podczas wirowania.Po trzecie, im szybciej przeprowadza się operacje, tym lepszej jakości otrzymuje się mitochondria. Zwierzęta zostały uśmiercone zgodnie z brytyjską ustawą Animal Scientific Procedure Act, a wszystkie poniższe czynności wykonano w pomieszczeniu chłodniczym. Przygotuj trzy zlewki zawierające 40 ml buforu do przemywania.Schładzaj to w kąpieli lodowej przez trzy do pięciu minut przed przejściem do następnego kroku. Należy uważać, aby nie zamrozić próbek zbyt mocno i użyć ich niezwłocznie po szybkim pojawieniu się chmurek kryształków lodu; otwórz klatkę piersiową odgłowionego szczura i wyizoluj serce. Wykonaj niewielkie nacięcia, a następnie natychmiast przenieś serce do lodowatego roztworu.W pierwszym zlewce należy wycisnąć serce, aby usunąć krew, a następnie przenieść je do drugiej zlewki. Operację tę należy powtórzyć dla każdego serca. Szybkie schłodzenie i przemycie usuniętych serc jest niezbędne do uzyskania standardowego preparatu wolnego od hemoglobiny, erytrocytów oraz adas.Osusz serca na papierze filtracyjnym. Usuń całą tkankę tłuszczową, skrzepy krwi oraz tętnicę. Następnie wypreparuj tkankę komór.Następnie należy rozdrobić tkankę za pomocą małych zakrzywionych nożyczek na szalce Petriego. Przez pięć minut dociskać tkankę za pomocą MIT. Po dociśnięciu tkanki przenieść materiał do zlewki zawierającej 50 ml buforu płuczącego i wymieszać.Następnie przefiltruj zawiesinę przez filtr wyspowy. Przemyj tkankę na filtrze trzykrotnie buforem płuczącym i usuń filtr. Przenieś przemytą tkankę do 20 ml buforu płuczącego i umieść ją w kąpieli lodowej na zewnętrznym magnesie.Dodawać kroplami do roztworu przy stałym mieszaniu i uruchomić czasomierz w czwartej minucie inkubacji. Krótko homogenizować zawiesinę partiami, niewielkimi porcjami, używając małego, luźno dopasowanego homogenizatora szklano-teflonowego. Po homogenizacji przenieść zawiesinę do innego zlewki na drugi mieszadło.Powtórz procedurę w dziewiątej minucie, tak aby po drugiej homogenizacji przeprowadzić ją łącznie dwa razy. W 15. minucie inkubacji dodaj 10 ml buforu izolacyjnego zawierającego inhibitor trypsyny i inkubuj przez jeszcze jedną minutę, a następnie ponownie przefiltruj zawiesinę przez filtr nylonowy. W tym przypadku zachowaj filtrat, a pozostałą część tkanki przenieś do homogenizatora i poddaj homogenizacji.Przez kolejną minutę łącz homogenat z filtratem w probówce do wirowania. Upewnij się, że probówki są odpowiednio zrównoważone, a następnie wykonaj wirowanie z niską prędkością przez 15 minut. Przy 600 G ostrożnie przefiltruj otrzymany nadsadziny do nowej probówki do wirowania.Należy unikać zanieczyszczenia osadu i ponownie odwirować próbkę przez 15 minut przy 8, 500 G. Po wirowaniu z wysoką prędkością należy odlać nadosad i przepłukać osad buforem, starając się usunąć białą, puszystą zewnętrzną warstwę krawędziową. Dodać 1 ml buforu do izolacji. Przechylić probówkę z jednej strony na drugą i usunąć pozostałość buforu.Rozbić osad za pomocą ula, starając się uniknąć czerwonej plamki erytrocytów na dnie, odpowiednio zawiesić osad za pomocą małego homogenizatora lub alternatywnie przez delikatne mieszanie, rozcieńczyć zawiesinę większą ilością buforu izolującego i ponownie odwirować przez 15 minut przy 8 500 G. Odrzucić supernatant Resus. Zawiesić osad w buforze zawieszającym Resus i ponownie odwirować przy 8 500 G. Powstały brązowy osad zawiera przemyte, nienaruszone mitochondria. Zawiesić osad w bardzo małej objętości buforu zawieszającego resus.Im mniejsza użyta objętość, tym bardziej stabilna będzie preparacja mitochondriów. Zazwyczaj wystarcza 200 µL buforu na jedno serce. Przewidywana wydajność przygotowanych mitochondriów wynosi około 10 do 15 mg białka mitochondrialnego na serce.Współczynnik kontroli oddychania na substratach kompleksu I w takiej preparacji powinien wynosić od 8 do 12. Powodzenia w przygotowaniu preparatu.

preparation-of-highly-coupled-rat-heart-mitochondria

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie wysoce sprzężonych mitochondriów z serc szczurów

W niniejszej pracy opisaliśmy typowy sposób izolacji i hodowli dorosłych miocytów serca szczura. Do trawienia i izolacji pojedynczych miocytów wykorzystuje się kolagenazę oraz proteazę. Miocyty hodowane zgodnie z tym protokołem spełniają większość wymagań eksperymentalnych.

Hodowla pierwotna kardiomiocytów dorosłego szczura

W niniejszym opracowaniu przedstawiono protokół spektrofluorometryczny do pomiaru otwarcia mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy. Analiza obejmuje jednoczesny pomiar gospodarki Ca2+ w mitochondriach, potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów. Opisano również procedurę pozyskiwania wysokiej jakości funkcjonalnych mitochondriów serca.

Wieloparametryczny pomiar otwierania poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy

Opisano metodę szybkiej izolacji mitochondriów z biopsji tkanek ssaków. Preparaty wątroby szczura lub mięśni szkieletowych homogenizowano za pomocą komercyjnego dysocjatora tkanek, a mitochondria izolowano przez filtrację różnicową przez filtry z siatki nylonowej. Czas izolacji mitochondriów wynosi &lt;30 min w porównaniu do 60 - 100 min przy użyciu metod alternatywnych.

Szybka izolacja i oczyszczanie mitochondriów do przeszczepu przez dysocjację tkanek i filtrację różnicową

Kilka protokołów zostało opracowanych i opisanych do izolacji różnych typów komórek serca z serca szczura. W tym miejscu opisano zoptymalizowany protokół, który pozwala na izolację wysokiej jakości głównych typów komórek serca (kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów) z jednego preparatu, zmniejszając koszty eksperymentu.

Jednoczesna izolacja wysokiej jakości kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów z serca dorosłego szczura

Tutaj prezentujemy dwa protokoły pomiaru napływu mitochondrialnego Ca2+ w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach. W przypadku izolowanych mitochondriów szczegółowo opisujemy test importu Ca2 + oparty na czytniku płytek przy użyciu wrażliwego barwnika Ca2 + zieleni wapniowej-5N. W przypadku hodowanych komórek opisujemy metodę mikroskopii konfokalnej z użyciem barwnika Ca2+ Rhod-2/AM.

Analizy napływu wapnia w mitochondriach w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach

Tutaj opisujemy zoptymalizowaną, opartą na Langendorffie procedurę izolacji jednokomórkowych kardiomiocytów przedsionkowych z szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową. Ręczna regulacja ciśnienia śródświetlnego w jamach serca jest wdrażana w celu uzyskania funkcjonalnie nienaruszonych miocytów odpowiednich do badań pobudzenia, skurczu i sprzężenia.

Izolacja kardiomiocytów przedsionkowych od szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową

Przygotowanie wzbogaconych o mitochondria próbek z wcześniej zamrożonych zarchiwizowanych tkanek stałych pozwoliło badaczom na przeprowadzenie zarówno funkcjonalnych, jak i analitycznych ocen mitochondriów w różnych eksperymentalnych modalnościach. Badanie to pokazuje, jak przygotować preparaty wzbogacone w mitochondria z zamrożonej tkanki serca i przeprowadzić ocenę analityczną mitochondriów.

Pomiar mitochondrialnych kompleksów przenoszenia elektronów w wcześniej zamrożonej tkance serca od potomstwa lochy: model do oceny zmian bioenergetyki mitochondrialnej wywołanych wysiłkiem fizycznym

Tutaj opisujemy szczegółową metodę izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy i późniejszą analizę oddychania za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR) za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Rurociąg ten można zastosować do badania wpływu wielu interwencji środowiskowych lub genetycznych na metabolizm mitochondriów.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych

Ta metoda wykorzystuje udział porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów do wycieku protonów o niskiej przewodności, aby określić próg napięcia dla otwarcia porów u noworodków z zespołem łamliwego chromosomu X o zwiększonej zawartości kardiomiocytów mitochondrialnego koenzymu Q w porównaniu do kontroli typu dzikiego.

Ocena otwartego prawdopodobieństwa porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów w warunkach nadmiaru koenzymu q

Badania bioenergetyczne i metabolomiczne mitochondriów ujawniły ich wieloaspektową rolę w wielu chorobach, ale metody izolacji tych organelli są różne. Opisana tutaj metoda jest w stanie oczyścić wysokiej jakości mitochondria z wielu źródeł tkankowych. Jakość określa się na podstawie współczynników kontroli oddechu i innych wskaźników ocenianych za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Solidna izolacja mitochondriów z tkanki serca gryzoni

Naucz się izolować wysoce sprzężone mitochondria serca szczura przy użyciu mechanicznej i enzymatycznej homogenizacji oraz różnicowej wirowania. Ta metoda zapewnia wysoką jakość preparatów do badań bioenergetyki komórkowej.

Przygotowanie silnie sprzężonych mitochondriów serca szczura

Przeglądaj więcej filmów